陳 康，張卓濰，沈 清，戴志遠(yuǎn)*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116034 4 新昌縣鱘鰉生物科技有限公司 浙江紹興312521）

鱘魚是一種大型淡水魚，是魚類最原始的類群之一，在黑龍江、松花江等地均有分布，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值較高[1]。我國(guó)鱘魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，魚子醬產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，而鱘魚肉作為魚子醬的加工副產(chǎn)物未得到充分利用[2]。養(yǎng)殖鱘魚肉脂肪含量較高，對(duì)加工工藝要求較高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚肉脂肪氧化迅速是魚腥味產(chǎn)生的主要因素[3-4]。目前國(guó)內(nèi)鱘魚肉加工產(chǎn)品較少，主要為煙熏鱘魚肉[5]、鱘魚松[6]、鱘魚片[7]、鱘魚腸[8]等。

脂質(zhì)是水產(chǎn)品中重要的活性物質(zhì)，包括甘油三酯、磷脂和固醇等，并且水產(chǎn)品中ω-3 多不飽和脂肪酸含量較高[9-10]。海洋動(dòng)物脂質(zhì)中，磷脂的不飽和程度較高，并富含DHA 和EPA 等多不飽和脂肪酸，具有重要的研究?jī)r(jià)值[11]。磷脂廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞膜的重要組成部分，具有多種生理功能[12-13]。脂肪酸不飽和程度增高使得其穩(wěn)定性降低，而魚肉富含多不飽和脂肪酸，在加工過(guò)程中容易造成脂肪酸氧化，引起營(yíng)養(yǎng)損失。煙熏技術(shù)是一種傳統(tǒng)的肉制品保存技術(shù)，通過(guò)高溫及熏煙引起食品脫水從而延長(zhǎng)保存期限，并賦予食品特殊的顏色和風(fēng)味[14]。雖然煙熏工藝可以抑制鱘魚脂肪酸酸敗，但是煙熏的高溫也會(huì)加速魚肉脂肪酸氧化形成酸類和酮類物質(zhì)[15-16]。目前，煙熏鱘魚的研究主要針對(duì)菌落總數(shù)、脂肪酸氧化及風(fēng)味物質(zhì)變化，暫無(wú)針對(duì)鱘魚不同部位及魚肉脂質(zhì)體的研究。本文采用親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Hydrophilic interaction chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）技術(shù)和主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法，系統(tǒng)研究鱘魚肉不同部位在煙熏過(guò)程中磷脂成分的變化，以期為煙熏鱘魚肉工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

史氏鱘鰉（史氏鱘♀×達(dá)氏鰉♂），新昌縣鱘鰉生物科技有限公司。3 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholines，PC）PC-14∶0/14∶0、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）PE-15∶0/15∶0 和磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）PS-14∶0/14∶0（純度均大于99.9%），美國(guó)Avanti Polar Lipids 公司；乙腈（色譜純級(jí)），德國(guó)Merck 公司；氯仿、甲醇等試劑，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

4000 Q-TRAP 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有ESI離子源），美國(guó)Applied Biosystems 公司；HPLC 高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters 公司；7890B 氣相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；TMS-PRO 物性分析儀，美國(guó)FTC 公司；Fresco-21G 臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；Millipore 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚煙熏工藝 取冷凍鱘魚肉于常溫解凍并去皮去骨，流水洗凈表面黏液，切成1 cm 厚的鱘魚片，然后清洗瀝干，放入調(diào)味料中浸漬30 min。取出鱘魚肉放入煙熏爐中熱風(fēng)干燥，干燥溫度定為55℃，干燥時(shí)間設(shè)定為30 min。熏材采用蘋果木，煙熏溫度60℃，煙熏時(shí)間40 min。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)測(cè)定方法采用TPA 方法[17]測(cè)定樣品破斷強(qiáng)度和凹陷深度，采用P/50 不銹鋼球形探頭，直徑5 mm，穿刺速度60 mm/min，每組樣品重復(fù)測(cè)量5 次。

1.3.3 脂肪酸組成測(cè)定參照Bligh 等[18]方法。取4 g 魚肉完全絞碎，加入12 mL 脂質(zhì)提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1）均質(zhì)3 min，再超聲提取20 min，低溫離心后（10℃，8 500 r/min，15 min），取下層氮吹得粗油脂。在提取油脂中加入5 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，于65℃水浴20 min，振搖至油滴消失并冷卻。加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，于65℃水浴5 min，超聲提取10 min 后加入2 mL 正己烷，振搖后用2 mL 飽和NaCl 淋洗上層，取上層用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾待測(cè)。采用峰面積歸一化法分析各脂肪酸組分的相對(duì)含量。每組樣品重復(fù)測(cè)試3 次。

氣相色譜條件[19]：HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.15 μm）；升溫程序：初溫50℃保持2 min 后以4℃/min 升至250℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流比40∶1，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速0.65 mL/min。

1.3.4 磷脂提取方法 采用改進(jìn)后的Bligh-Dyer法提取鱘魚肉磷脂[20]。準(zhǔn)確稱取鱘魚肉樣品1.0 g，加入12.0 mL 脂質(zhì)提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），振蕩后于20℃水浴超聲提取20 min。加入6 mL 超純水，于8 000 r/min，10℃離心10 min，收集有機(jī)相。水相中加入6.0 L 氯仿重復(fù)提取2 次，合并3次提取液并氮?dú)獯蹈?。干燥后加? mL 磷脂溶解液（V氯仿∶V甲醇=1∶1）復(fù)溶，用0.2 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后用于質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3.5 液相色譜條件 色譜柱：Cosmosil HILIC色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相A：水相（20 mmol/L 甲酸銨，18 mmol/L 甲酸，超純水溶解）；流動(dòng)相B：有機(jī)相（18 mmol/L 甲酸，乙腈溶解）。梯度洗脫程序[21]：0 min（95% B），3 min（95%B），18 min（70% B），23 min（50% B），28 min（50%B），29 min（95% B），32 min（95% B）。流量：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.6 質(zhì)譜條件電噴霧離子源ESI 負(fù)離子模式；離子源電壓（IS）-4 500 V；毛細(xì)管溫度500℃；氣簾氣（CUR）172.368 kPa；霧化氣（GS1）165.474 kPa；輔助氣（GS2）206.843 kPa；掃描范圍m/z 600～1 000[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Software v1.6.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用Lipid View 1.2 進(jìn)行磷脂分子種鑒定，用Excel 2013 和SPSS 22 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙熏過(guò)程對(duì)鱘魚肉質(zhì)構(gòu)的影響

煙熏加工工藝通過(guò)熱量傳遞及煙熏材料吸附在魚肉表面的方式，使魚肉組織失去一部分水分，從而延長(zhǎng)魚肉制品的保質(zhì)期。從圖1可以看出，鱘魚背部組織硬度高于腹部組織，這可能是由于魚體背部脂肪含量較少，蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，肌肉蛋白纖維組織結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的耐壓能力[23-24]。經(jīng)過(guò)煙熏工藝加工后，煙熏鱘魚腹部組織硬度高于背部組織，這可能是由于煙熏過(guò)程中，煙熏顆粒附著在魚肉組織表面，同熱力學(xué)共同作用使魚肉組織脫水[25]。煙熏過(guò)程中，鱘魚肉組織脂肪滲出，引起鱘魚肉脂肪含量下降，而鱘魚腹部具有更多的水分與脂肪，煙熏后肌肉蛋白纖維含量增高，使得鱘魚腹部具有更高的硬度。煙熏過(guò)程對(duì)鱘魚肉質(zhì)構(gòu)的影響如表1所示，煙熏后的鱘魚肉具有更高的回復(fù)性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性，而彈性則在不同部位具有強(qiáng)度差異。

圖1 煙熏工藝對(duì)鱘魚肉硬度的影響Fig.1 The effect of smoking technology on hardness of sturgeon

表1 煙熏工藝對(duì)鱘魚肉結(jié)構(gòu)的影響Table 1 The effect of smoking technology on the structure of sturgeon

2.2 脂肪酸組成分析

本研究共檢測(cè)到鱘魚肉中脂肪酸15 種，其中飽和脂肪酸（SFA）5 種，單不飽和脂肪酸（MUFA）4種，多不飽和脂肪酸（PUFA）6 種；煙熏鱘魚肉中共檢測(cè)到脂肪酸13 種，其中飽和脂肪酸4 種，單不飽和脂肪酸4 種，多不飽和脂肪酸5 種，鱘魚煙熏過(guò)程脂肪酸組成的變化如表2所示。由表2可知，鱘魚腹部不飽和脂肪酸相對(duì)含量高于背部組織，其中腹部EPA 和DHA 相對(duì)含量也顯著高于背部。本次試驗(yàn)結(jié)果與早期研究基本一致，說(shuō)明鱘魚肉不飽和脂肪酸含量高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[26-27]。煙熏后，鱘魚組織的多不飽和脂肪酸含量顯著下降，分別下降了5.31%（腹部）和3.75%（背部）。煙熏后鱘魚組織腹部和背部組織的不飽和脂肪酸相對(duì)含量差異不顯著，并且EPA 和DHA 相對(duì)含量相近。相關(guān)研究表明[28]，不飽和脂肪酸具有熱不穩(wěn)定性，隨著不飽和程度的提高穩(wěn)定性降低，更易被氧化。因此，鱘魚腹部組織由于脂肪酸不飽和程度高，在受熱煙熏過(guò)程中更易氧化，所以在加工鱘魚時(shí)，鱘魚背部組織可以采用熱熏處理，而腹部組織更適宜采用冷熏等溫度較低、較為溫和的加工方式。

表2 鱘魚肉及煙熏鱘魚肉脂肪酸組成分析Table 2 Analysis of fatty acid composition of smoked and raw sturgeon meat

（續(xù)表2）

2.3 鱘魚肉與煙熏鱘魚肉的脂質(zhì)組學(xué)分析

2.3.1 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品分析將3 種磷脂標(biāo)品以1∶1∶1 混合，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試保留時(shí)間。磷脂由親水性頭部與疏水性脂肪酸尾部組成，可以通過(guò)洗脫液梯度洗脫進(jìn)行不同磷脂分子種分離，并通過(guò)提取圖譜上標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行磷脂分子種鑒定[29]。由圖2可以看出，本試驗(yàn)方法可有效分離3 類磷脂分子種。在負(fù)離子模式中，PE 和PS 因去質(zhì)子化而以[M-H]-為特征離子，PC 由于流動(dòng)相中甲酸存在而以[M+CH3COO]-為特征離子。由圖2可知，PC、PE 和PS 的出峰時(shí)間分別為11.64，12.49 min 和16.58 min。

圖2 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品HILIC-MS 圖Fig.2 HILIC-MS of phospholipid standard

2.3.2 脂質(zhì)組學(xué)分析 由鱘魚肉與煙熏鱘魚肉的HILIC-MS 圖（圖3）可知，本試驗(yàn)的液相方法可以有效地分離磷脂種，通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，選取相近出峰位置進(jìn)行分子提取，可以得到各磷脂分子種（圖4）[30]。通過(guò)Lipid View 軟件定性分析及相對(duì)含量測(cè)定，共鑒定出鱘魚肉中PC 分子20 種、PE 分子24 種、PS 分子12 種（表3）。由表可知，鱘魚肉背部、鱘魚肉腹部、煙熏鱘魚肉背部和煙熏鱘魚肉腹部4 種鱘魚肉樣品中，含量最高的PC 分子都是C34：1，分別達(dá)到16.60%，14.93%，18.70%，20.70%；除煙熏鱘魚肉腹部樣品外（PE C36：0，18.93%），含量最高的PE 分子是C38：1，分別為14.50%，14.22%，15.60%；除煙熏鱘魚肉腹部樣品外（PS C44：9，19.02%），含量最高的PS 分子是C40：6，分別為23.32%，24.31%，17.07%，這表明鱘魚肉中PS 分子不飽和脂肪酸含量較高。當(dāng)磷脂分子不飽和度≥5 時(shí)，其中一條脂肪酸可能含有EPA 或DHA 鏈，因此本試驗(yàn)提取磷脂中不飽和度≥5 的分子種作為研究磷脂分子種高不飽和脂肪酸相對(duì)含量的參考。試驗(yàn)結(jié)果表明，鱘魚肉的磷脂組成中高不飽和脂肪酸相對(duì)含量較高。鱘魚肉煙熏前、后腹部多不飽和脂肪酸含量高于背部，這是由于魚肉背部蛋白質(zhì)含量較高，而腹部含有較高的油脂。煙熏后，鱘魚肉背部不飽和脂肪酸磷脂含量分別降低了3.40%（PC）、1.87%（PE）和15.81%（PS），其中PS（C44：9）分子含量下降顯著，達(dá)到9.11%。鱘魚肉腹部不飽和脂肪酸磷脂組成分別降低了5.01%（PC）、12.89%（PE）和10.90%（PS），其中PS（C40：6）分子含量下降12.52%。試驗(yàn)結(jié)果表明，用鱘魚肉腹部磷脂在煙熏過(guò)程中不飽和脂肪酸氧化程度更高，這與脂肪酸分析結(jié)果一致。

圖3 鱘魚肉HILIC-MS 圖Fig.3 HILIC-MS of raw sturgeon meat

圖4 鱘魚肉PC（a）、PE（b）、PS（c）質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrometry of PC（a），PE（b）and PS（c）of sturgeon meat

表3 鱘魚肉及煙熏鱘魚肉磷脂分子種組成分析Table 3 Analysis of molecular species composition of phospholipid in smoked and raw sturgeon meat

（續(xù)表3）

2.4 主成分分析

通過(guò)SIMCA 14.1.0 軟件對(duì)48 組樣品中的磷脂成分進(jìn)行主成分分析，得到第1 主成分（貢獻(xiàn)率為50.6%）和第2 主成分（貢獻(xiàn)率為16.55%），2 種組分的總貢獻(xiàn)率為67.15%，因此，PCA 方法可以有效反映不同鱘魚樣品的特征磷脂。

煙熏鱘魚樣品的PCA 評(píng)分散點(diǎn)圖如圖5所示，圖中散點(diǎn)可分為左右2 個(gè)集群，左面集群為鱘魚肉，右面集群為煙熏鱘魚肉，煙熏后鱘魚肉磷脂組成發(fā)生顯著改變。進(jìn)一步分析鱘魚肉集群發(fā)現(xiàn)鱘魚肉腹部和背部磷脂可以分為A，B 2 個(gè)集群，并且2 個(gè)集群距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明鱘魚肉腹部和背部磷脂組成具有較大差異，可以作為區(qū)分鱘魚不同部位的指標(biāo)，有待進(jìn)一步研究[31]。煙熏鱘魚肉集群可分為a，b 2 個(gè)集群，2 個(gè)集群距離較近，說(shuō)明經(jīng)過(guò)煙熏后鱘魚肉中磷脂組成差異性減少。同時(shí)煙熏后鱘魚肉的磷脂樣品離散程度增加，說(shuō)明煙熏對(duì)鱘魚肉磷脂影響具有一定的隨機(jī)性，不同的磷脂在煙熏的過(guò)程中變化程度也不同。

圖5 鱘魚和煙熏鱘魚樣品主成分分析散點(diǎn)圖Fig.5 Principal component analysis of smoked and raw sturgeon samples

3 結(jié)論

通過(guò)分析煙熏鱘魚肉質(zhì)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)煙熏工藝后鱘魚腹部組織比背部組織具有較高的質(zhì)構(gòu)差異，其中硬度和彈性差異顯著。在煙熏過(guò)程中，鱘魚肉多不飽和脂肪酸會(huì)發(fā)生氧化損失，其中腹部組織下降較多，達(dá)5.31%。采用脂質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)煙熏鱘魚肉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙熏工藝會(huì)引起磷脂脂肪酸鏈不飽和程度下降，其中對(duì)PS 分子不飽和度影響最顯著。通過(guò)主成分分析，發(fā)現(xiàn)磷脂可以作為區(qū)分鱘魚肉腹部和背部的定性指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，煙熏工藝會(huì)顯著影響鱘魚肉磷脂組成并使腹部與背部磷脂組成差異性減少。同時(shí)，煙熏對(duì)鱘魚肉的影響具有一定的隨機(jī)性。本研究發(fā)現(xiàn)熱熏工藝會(huì)引起鱘魚肉脂肪酸氧化，不飽和脂肪酸含量顯著下降，不適于加工脂肪酸含量較高的腹部組織，可考慮采用液熏等冷熏工藝替代。本研究為優(yōu)化不同部位煙熏鱘魚肉產(chǎn)品的加工工藝提供數(shù)據(jù)參考及理論依據(jù)。