何曉葉，任 爽，鄭伊琰，高彥祥，袁 芳*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京100081）

超高壓（High Pressure Processing，HPP）是一種非熱食品加工技術(shù)，近年來在國內(nèi)外得到廣泛的研究。食品的超高壓處理技術(shù)，是利用水等傳壓介質(zhì)在100～1 000 MPa 壓力范圍使食品內(nèi)部產(chǎn)生物理、化學(xué)及生物效應(yīng)，從而達(dá)到滅菌改性等目的[1]。HPP 技術(shù)具有處理溫度低，食品營養(yǎng)成分及色香味損失少，處理效率高，能耗少等優(yōu)點(diǎn)，目前已商業(yè)化應(yīng)用于果汁類產(chǎn)品中。超高壓可以通過影響蛋白質(zhì)的分子體積、非共價(jià)鍵等引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的功能特性（特別是乳化特性），然而可能具有一定副作用，例如導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，誘導(dǎo)多肽聚集和解離，改變其表面疏水性、溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)[2]。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)與功能性質(zhì)受多重因素影響，不僅與氨基酸的組成、結(jié)構(gòu)、分子大小等本身屬性有關(guān)，還與其所處環(huán)境有關(guān)，如溫度、pH 值、離子強(qiáng)度等。在不同離子組成的緩沖體系中，因離子的吸附作用不同，故蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)和穩(wěn)定性也不同。pH 值也是影響蛋白質(zhì)狀態(tài)的重要因素，它通過改變蛋白質(zhì)表面的電荷來影響蛋白質(zhì)分子間的交互作用。有研究表明，在磷酸鹽緩沖液中提高壓力和保壓時(shí)間會使鷹嘴豆分離蛋白溶解性明顯下降，而增強(qiáng)體系的離子強(qiáng)度能有效阻止這種現(xiàn)象[3]。還有研究表明，經(jīng)600 MPa 超高壓處理，與乳清和脫脂牛乳體系相比，磷酸鹽緩沖體系中的牛乳鐵蛋白依然保持較高的免疫活性[4]。研究緩沖體系對蛋白質(zhì)的影響具有重要意義。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）存在于哺乳動物的外分泌液中，是一條分子質(zhì)量約80 ku 的鐵結(jié)合性糖蛋白，這條多肽鏈上結(jié)合有兩條糖鏈，含量為7%左右[5]。牛乳鐵蛋白由689 個(gè)氨基酸組成，二級結(jié)構(gòu)呈“二枚銀杏葉型”，分別在分子的C-端和N-端形成2 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且每葉的內(nèi)部縫隙處都有一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)[6]。每個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)均由4 個(gè)氨基酸殘基（1 個(gè)組氨酸、1 個(gè)天冬氨酸、2 個(gè)酪氨酸）組成配位體，螯合一個(gè)Fe3+。乳鐵蛋白的等電點(diǎn)較高，在8.0 以上，這是它區(qū)別于其它食品級蛋白質(zhì)的一項(xiàng)重要性質(zhì)[7]。乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性，已被廣泛應(yīng)用于各種產(chǎn)品，如嬰兒配方奶粉、益生菌、補(bǔ)充片劑、寵物食品、化妝品、食品中鐵的天然增溶劑等[8]。

目前有文獻(xiàn)報(bào)道HPP 處理對乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響[2，4]，然而幾乎沒有文獻(xiàn)考慮到緩沖體系在其中所起作用。本試驗(yàn)選擇磷酸鹽（Phosphate buffer saline，PBS）、檸檬酸鹽（Citrate buffer saline，CBS）和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖溶液，分別代表無機(jī)鹽、有機(jī)酸和有機(jī)堿緩沖體系，研究不同強(qiáng)度超高壓處理對不同緩沖體系中乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 乳鐵蛋白，純度≥96.2%，鐵飽和度為9.85%，美國Hilmar 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），純度≥99.9%，日本Lanyi Reagent 公司；5，5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB），純度≥98%，美國Sigma 公司；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、考馬斯亮藍(lán)G250、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白、甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和尿素，均為分析純級試劑。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 納米粒度電位儀（Zetasizer Nano-ZS90），英國Malvern 公司；熒光分光光度計(jì)（F-7000），日本Hitachi 公司；圓二色性光譜儀（Pistar π-180），英國Applied Photophysics 公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1800），日本島津公司；分析天平（AR1140），上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；pH 計(jì)（Orion Star），美國Thermo Scientific 公司；超高壓設(shè)備（HPP L2-700/1），天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；數(shù)顯電動磁力攪拌器（78HW-1），江蘇榮華儀器制造有限公司；高速離心機(jī)（3K15），美國Sigma 公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-12），北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳鐵蛋白溶液的制備及超高壓處理 將乳鐵蛋白粉末分別溶于10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS）、檸檬酸鹽緩沖液（CBS）和Tris-HCl 緩沖液中，置磁力攪拌器上攪拌2 h，使其充分溶解，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乳鐵蛋白溶液，加入抑菌劑疊氮化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%）防止微生物滋生。將每種緩沖體系的乳鐵蛋白溶液分成3 份，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH 值至3.0，5.0 和7.0，置4℃冰箱溶脹過夜。

將乳鐵蛋白溶液以一定體積分裝于聚乙烯袋中，用真空包裝機(jī)封口，置超高壓設(shè)備的壓力腔中，完全浸沒于傳壓介質(zhì)（去離子水）中，設(shè)置壓力和時(shí)間參數(shù)，進(jìn)行超高壓處理。本試驗(yàn)中設(shè)置的超高壓處理壓力分別為200，400 MPa 和600 MPa，時(shí)間為30 min，選取常壓（0.1 MPa）作對照，升壓速率和降壓速率分別為6.5 MPa/s 和20 MPa/s。經(jīng)超高壓處理的樣品一部分被保存于4℃冰箱待測，另一部分被冷凍干燥為粉末于室溫保存待測。

1.2.2 Zeta 電位的測定 利用納米粒度電位儀測定不同pH 值下超高壓處理前、后的乳鐵蛋白溶液的Zeta 電位。該儀器基于動態(tài)光散射原理（Dynamic light scattering，DLS）分析，通過測量光束的頻率和相位的變化來測定顆粒電泳的速度，從而求出Zeta 電位。測定時(shí)樣品池溫度設(shè)定為25℃。為了減少多重光散射造成的誤差，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，最終以Zeta 電位（mV）表示顆粒的表面電勢。

1.2.3 游離巰基含量的測定參照Qin 等[9]的方法測定不同pH 值下超高壓處理前、后乳鐵蛋白中游離巰基的含量。首先將4 mg DTNB 溶解于1 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH=8.0）中配制Ellman's 試劑，稱取10～15 mg 乳鐵蛋白凍干粉溶解于含8 mol/L 尿素的上述Tris-甘氨酸緩沖液中，向其中加入40 μL Ellman's 試劑，于室溫反應(yīng)30 min，以對應(yīng)的緩沖溶液作空白對照，用UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)測定樣品在波長412 nm 處的吸光值。每個(gè)樣品測定3 次游離巰基含量后取平均值。樣品的游離巰基含量計(jì)算公式：

式中，A412nm——波長412 nm 處的吸光度值；C——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；D——稀釋倍數(shù)（本試驗(yàn)中未稀釋）。

1.2.4 紫外吸收光譜分析 將樣品用相應(yīng)緩沖溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，以相應(yīng)的緩沖溶液作為對照，用UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)測定樣品在波長200～400 nm 范圍的吸光度，繪制乳鐵蛋白的紫外吸收光譜圖。

1.2.5 熒光光譜分析參考Sun 等[10]的方法，用相應(yīng)的緩沖溶液將樣品稀釋至質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，以LF 分子內(nèi)熒光基團(tuán)作為探針，采用F-7000型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描。設(shè)置激發(fā)波長292 nm（激發(fā)色氨酸熒光），發(fā)射波長300～450 nm，以1 200 nm/min 的掃描速度記錄熒光強(qiáng)度的變化。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，電壓為550 V，以相應(yīng)的空白緩沖溶液作對照。

1.2.6 圓二色性光譜分析參考Liu 等[11]的方法，將樣品用相應(yīng)緩沖溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的待測液，用Pistar π-180 型圓二色性光譜儀在室溫下測定，掃描范圍為遠(yuǎn)紫外區(qū)域190～260 nm，樣品池光程0.1 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率0.2 nm，頻帶寬度2 nm。所測數(shù)據(jù)通過網(wǎng)站http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk[12-13]在線分析。

1.2.7 溶解性 利用考馬斯亮藍(lán)法測定溶液中蛋白質(zhì)含量（μg）變化，探究不同pH 值下超高壓處理前、后乳鐵蛋白溶解性的變化。將不同處理的乳鐵蛋白溶液10 000×g、20℃高速離心15 min，取上清液，用相應(yīng)的緩沖溶液稀釋，用考馬斯亮藍(lán)法測定每毫升待測液中蛋白質(zhì)的含量，每個(gè)樣品做3 組平行。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 文中數(shù)據(jù)為3 次平行試驗(yàn)的平均值，在α=0.05 水平下使用SPSS 16.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高壓對乳鐵蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 Zeta 電位分析 蛋白質(zhì)表面攜帶的電荷主要來自表面基團(tuán)的電離作用，通常用Zeta 電位表示蛋白質(zhì)所帶平均電荷[14]。通過測定蛋白質(zhì)的Zeta 電位了解其帶電基團(tuán)的暴露程度，以進(jìn)一步分析其三級結(jié)構(gòu)的變化。

從圖1可以看出，與水溶液相比，加入緩沖物質(zhì)后乳鐵蛋白表面電位顯著降低。據(jù)報(bào)道，乳鐵蛋白等電點(diǎn)約為8.0[7]。在試驗(yàn)的pH 條件下水溶液中的乳鐵蛋白表面均帶正電荷；而在緩沖液中，由于陰離子的吸附作用，中和了蛋白質(zhì)表面的正電荷，導(dǎo)致其Zeta 電位降低，等電點(diǎn)隨之發(fā)生變化。3 種緩沖液中乳鐵蛋白的等電點(diǎn)分別降到5～7間，5 左右和7 左右。以水溶液為對照，根據(jù)Zeta電位下降幅度不同，可推斷3 種緩沖溶液離子吸附能力CBS＞PBS＞Tris-HCl，這可能與3 種緩沖物質(zhì)的解離常數(shù)pKa 值有關(guān)。此外，Tris-HCl 緩沖液離子強(qiáng)度較低[15]，也可能是導(dǎo)致其吸附能力弱的原因之一。

圖1 不同pH 值條件下不同強(qiáng)度的超高壓處理對乳鐵蛋白Zeta 電位的影響Fig.1 Effect of different levels of HPP treatments on Zeta potential of LF at different pH

在水溶液中，隨超高壓處理壓力的增加，乳鐵蛋白表面電荷沒有顯著的變化，且變化較無規(guī)律。而在緩沖液中，由于存在離子的吸附作用，因此電位的變化趨勢與水中明顯不同。在PBS 和CBS 緩沖液中pH 3 條件，以及Tris-HCl 緩沖液中pH 3和pH 7 條件下，隨著處理壓力的升高（200～600 MPa），乳鐵蛋白表面電荷量（電位的絕對值）呈上升趨勢。有文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)表面電荷增加可增強(qiáng)分子間的靜電排斥作用，提高溶液的穩(wěn)定性[16]。簡俊麗等[17]在研究超高壓處理對β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)隨超高壓處理壓力的增加，蛋白質(zhì)表面電位呈上升趨勢，推測可能是蛋白質(zhì)聚集所致。而在PBS 緩沖液中pH 5 和pH 7 以及CBS 緩沖液中pH 5 的條件下，隨著壓力的升高，乳鐵蛋白的Zeta 電位沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），可能是因?yàn)榫彌_液中乳鐵蛋白等電點(diǎn)發(fā)生改變，這些pH值剛好接近蛋白等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)表面電荷接近0，超高壓處理后也沒有明顯變化。

2.1.2 游離巰基含量分析 不同強(qiáng)度超高壓處理對不同緩沖液中乳鐵蛋白游離巰基含量的影響如圖2所示。在PBS 緩沖液中，pH 5 和pH 7 條件下，200～400 MPa 處理的蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），600 MPa 處理的蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著上升（P＜0.05），這可能是因?yàn)槌邏浩茐牧说鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部的非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，從而暴露出埋藏在內(nèi)部的巰基基團(tuán)[9]。在CBS 緩沖液中，過高的壓力（600 MPa）使得蛋白質(zhì)的游離巰基含量下降。Qin 等[9]發(fā)現(xiàn)隨處理壓力的增加，Tris-甘氨酸緩沖液中核桃分離蛋白游離巰基含量先上升后下降，下降的趨勢可能是由于進(jìn)一步增高的壓力使得暴露出來的巰基形成二硫鍵鍵橋，使部分蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集。CBS緩沖液中pH 7 時(shí)游離巰基含量隨壓力的升高而降低，這與Yang 等[18]研究超高壓處理對Tris-甘氨酸緩沖體系中大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果一致，分析可能是由于超高壓使蛋白質(zhì)表面的游離巰基通過SH/S-S 交換反應(yīng)形成分子內(nèi)二硫鍵。在Tris-HCl 緩沖液中，pH 7 時(shí)，壓力增到600 MPa，游離巰基含量顯著升高（P＜0.05），達(dá)到6.23 μmol/L，是其它條件下游離巰基含量的3～4 倍，這可能是因?yàn)門ris-HCl 緩沖體系中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)接近7（見圖1d），此時(shí)分子間靜電排斥作用弱，在高壓下易發(fā)生變性，甚至產(chǎn)生沉淀。

圖2 不同pH 值條件下不同強(qiáng)度的超高壓處理對乳鐵蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effect of different levels of HPP treatments on the free SH content of LF at different pH

2.1.3 紫外吸收光譜分析 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)有吸收紫外光的性質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致其氨基酸殘基位置和周圍環(huán)境發(fā)生改變，從而引起紫外吸收光譜的變化。

圖3顯示不同緩沖體系下超高壓處理前、后乳鐵蛋白紫外吸收光譜的變化?？梢钥闯?，PBS 體系中乳鐵蛋白紫外吸收光譜受超高壓影響程度最大，而CBS 和Tris-HCl 中乳鐵蛋白對超高壓耐受能力相對較強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，PBS 緩沖液中磷酸氫根離子可以催化蛋白質(zhì)分子聚合[19]，可以與結(jié)合金屬離子的組氨酸殘基反應(yīng)[20]，這些都可能導(dǎo)致PBS 緩沖體系中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定。而Tris-HCl 體系中，除pH 7，600 MPa 條件外，其它條件下蛋白質(zhì)紫外吸收光譜變化不顯著。劉堅(jiān)等[3]在研究超高壓對不同緩沖體系中鷹嘴豆分離蛋白溶解性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl 緩沖體系中蛋白質(zhì)溶解性的變化最不顯著，并稱之為抗壓型緩沖體系，說明該緩沖體系中蛋白質(zhì)對超高壓耐受能力較強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)受超高壓影響較小。

在PBS 體系中，酸性條件下超高壓對乳鐵蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響更大。如圖3a 顯示，隨著超高壓壓力的增加，最大吸光度呈先降后升的趨勢，且在400 MPa 時(shí)的最大吸光值最低。這說明低強(qiáng)度的超高壓處理導(dǎo)致乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)變得更加致密，色氨酸等疏水性氨基酸被包裹得更深，而高強(qiáng)度的超高壓處理使蛋白質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的內(nèi)部氨基酸基團(tuán)。喬寧等[21]研究超高壓對綠豆球蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著壓力的增加，蛋白質(zhì)的最大紫外吸光度先降后升，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而在有機(jī)緩沖體系中，乳鐵蛋白在酸性條件下較穩(wěn)定，在中性條件下變化較大。CBS 體系中乳鐵蛋白的最大紫外吸光度隨壓力的變化趨勢與PBS 體系中的相同，均先降低后升高，不同的是CBS 體系中乳鐵蛋白在壓力200 MPa 時(shí)的最大紫外吸光值最低。在Tris-HCl 緩沖體系中，pH 7 條件下，600 MPa 處理的樣品紫外吸收光譜突然升高，且高于其它條件，說明蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生驟變。這一結(jié)果與游離巰基含量測定結(jié)果相吻合，進(jìn)一步說明pH 值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，因分子間靜電排斥作用減弱，故超高壓處理后蛋白質(zhì)更易發(fā)生變性。

圖3 不同強(qiáng)度超高壓對乳鐵蛋白的紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different levels of HPP treatments on UV absorption spectrum of LF

2.1.4 熒光光譜分析 由于作用基團(tuán)基本一致，熒光光譜與紫外吸收光譜的變化趨勢基本一致，結(jié)果可互相印證。由圖4可見，同一pH 值下，超高壓處理未使乳鐵蛋白的熒光光譜發(fā)生藍(lán)移或紅移。Franco 等[4]用400，500 MPa 和600 MPa 壓力處理PBS 緩沖液中（pH 7.4）的乳鐵蛋白，發(fā)現(xiàn)超高壓處理并未改變?nèi)殍F蛋白熒光光譜的λmax值（即未發(fā)生紅移和藍(lán)移），與本試驗(yàn)結(jié)果一致。與其它pH 值相比，pH 3 時(shí)蛋白質(zhì)熒光光譜的最大發(fā)射峰明顯紅移，說明酸性條件下乳鐵蛋白氨基酸所處環(huán)境的極性增強(qiáng)。此外，pH 3 時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度明顯高于其它pH 條件的，這可能是由于隨著pH 值的下降，乳鐵蛋白結(jié)合鐵離子的能力迅速降低，大量鐵離子從蛋白中釋放出來，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，易受超高壓處理的影響[22]。

緩沖體系成分對乳鐵蛋白最大發(fā)射峰的位置無明顯影響，說明其氨基酸微環(huán)境的極性未改變。此外，從圖4可以看出，同一pH 值和壓力的條件下，不同緩沖液中乳鐵蛋白最大發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度略有不同：Tris-HCl>CBS>PBS。Su 等[23]發(fā)現(xiàn)同一pH 值下PBS 緩沖液中黃嘌呤氧化酶的熒光強(qiáng)度略高于Tris-HCl 緩沖液中氧化酶的熒光強(qiáng)度，與本試驗(yàn)結(jié)果有相似之處，分析其可能與緩沖液中溶質(zhì)的極性有關(guān)。PBS 緩沖液的疏水性較強(qiáng)，對蛋白質(zhì)分子的穿透能力較強(qiáng)，更易于進(jìn)入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而不改變其分子結(jié)構(gòu)，因而分子內(nèi)部的色氨酸等疏水性氨基酸未能暴露出來，因此檢測到的熒光強(qiáng)度偏低。

圖4 不同強(qiáng)度超高壓對乳鐵蛋白的熒光光譜的影響Fig.4 Effect of different levels of HPP treatments on fluorescence of LF

2.2 超高壓對乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

不同超高壓處理?xiàng)l件下得到的圓二色譜見圖5。乳鐵蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖以反平行β-折疊圖譜為特征峰[24]，在pH 3 條件下最小峰值在204 nm 處，在pH 5 和pH 7 條件下最小峰值在210 nm 處，說明緩沖體系的酸堿度影響乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從計(jì)算結(jié)果看，3 種緩沖液中，同一pH 值和壓力條件下，乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成并無明顯變化，說明緩沖溶液的種類不影響乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)。然而，緩沖液的pH 值對二級結(jié)構(gòu)的影響較為顯著，從表1中可以看出，pH 3 條件下α-螺旋的含量顯著低于pH 5 和pH 7 條件下的含量（P＜0.05），相差約10%；而無規(guī)則卷曲的含量顯著高于其它條件（P＜0.05），相差約7%。據(jù)報(bào)道，α-螺旋結(jié)構(gòu)的上升表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)逐漸變得緊湊[25]，α-螺旋結(jié)構(gòu)的下降則表明其結(jié)構(gòu)變得松散；另一方面，無規(guī)則卷曲的增加也說明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變得松散[21]。這些結(jié)果共同表明酸性條件下乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差，易變性。由2.1 節(jié)分析可知，超高壓處理對乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)影響顯著，而經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，其對蛋白的二級結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（P＞0.05）。He 等[2]研究超高壓（300～700 MPa）對PBS 緩沖液中牛乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，分析可能是由于適當(dāng)?shù)某邏禾幚泶龠M(jìn)了乳鐵蛋白熔球結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)高度水合，保留了較多的二級結(jié)構(gòu)和較少的穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。pH 7 的Tris-HCl 緩沖液中，壓力200～400 MPa 時(shí)，乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成為21.5%的α-螺旋，29.1%的β-折疊，21.6%的β-轉(zhuǎn)角，27.4%的無規(guī)則卷曲，當(dāng)壓力升至600 MPa 時(shí)，乳鐵蛋白的α-螺旋含量顯著降至15.2%，β-折疊顯著升至35.6%。據(jù)報(bào)道，β-折疊在聚集蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的較多[26]，說明處理后的乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加松散，且易于聚集，不穩(wěn)定。可能是由于此緩沖液中乳鐵蛋白的等電點(diǎn)接近7，說明pH 7 條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，易發(fā)生變性。

圖5 不同強(qiáng)度超高壓處理對乳鐵蛋白的圓二色性光譜的影響Fig.5 Effect of different levels of HPP treatments on the far-UV CD spectra of LF

表1 不同緩沖體系中不同pH 值和壓強(qiáng)條件下乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of LF at different pH under different pressures in different buffer systems

2.3 超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響

不同緩沖體系和pH 值條件下超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響如圖6所示。在PBS 體系中，超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響最大，而在CBS 和Tris-HCl 體系中蛋白質(zhì)溶解性受超高壓的影響較小，這與2.1.3 節(jié)紫外吸收光譜的測定結(jié)果一致，說明結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其溶解性的變化。CBS 體系中蛋白質(zhì)溶解性幾乎不受超高壓影響，可能是其強(qiáng)離子吸附作用賦予蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的溶解性。

隨著pH 值的升高，乳鐵蛋白溶解度逐漸降低，是由于pH 值越來越接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)表面電荷逐漸減少，表面基團(tuán)的水合作用減弱，從而溶解度降低。在變化較明顯的PBS 體系中，酸性條件下，隨著處理壓力的增加，乳鐵蛋白的溶解性呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，與紫外吸收光譜結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，將蛋白質(zhì)進(jìn)行超高壓處理時(shí)，凝聚的球狀蛋白質(zhì)逐漸伸展和解締，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)得以暴露，新暴露的極性基團(tuán)表面的結(jié)合水增多，且分子表面電荷增加，可能是導(dǎo)致其溶解度增大的原因之一[20]。在Tris-HCl 中，pH 7 條件下經(jīng)600 MPa 處理后樣品析出大量絮狀沉淀，溶解度降幅最大，與2.1 和2.2節(jié)的分析結(jié)果一致，說明等電點(diǎn)附近蛋白質(zhì)溶解度受超高壓影響最大。

3 結(jié)論

超高壓處理使乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，在不同緩沖液中變化趨勢和幅度略有不同，從整體來看，低強(qiáng)度的超高壓處理使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)趨向緊密，高強(qiáng)度處理則破壞其中的非共價(jià)鍵并導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的展開和解蒂，暴露出內(nèi)部疏水性基團(tuán)；結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致溶解性發(fā)生相應(yīng)變化，即低壓下蛋白質(zhì)溶解性下降，高壓時(shí)蛋白質(zhì)溶解性又回升；超高壓處理對乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響。

緩沖液的pH 值、緩沖物質(zhì)及離子強(qiáng)度等對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響。酸性條件下，乳鐵蛋白的氨基酸殘基所處微環(huán)境極性增強(qiáng)，且由于鐵離子釋放等原因，在超高壓處理過程中結(jié)構(gòu)更易展開。PBS 體系中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定，超高壓處理對其三級結(jié)構(gòu)及溶解性的影響最大，這可能與磷酸氫根的催化能力及其與組氨酸的相互作用有關(guān)。緩沖液中離子強(qiáng)度及pKa 值的不同導(dǎo)致離子的吸附能力不同（CBS＞Tris-HCl＞PBS），并導(dǎo)致乳鐵蛋白的Zeta 電位和等電點(diǎn)發(fā)生不同程度的降低。緩沖物質(zhì)的種類對乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)無明顯影響，然而，酸性pH 值下蛋白質(zhì)的α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，結(jié)構(gòu)松散不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集。綜上所述，3 種緩沖液中乳鐵蛋白對超高壓耐受能力：CBS＞Tris-HCl＞PBS。

圖6 不同強(qiáng)度超高壓處理前、后不同緩沖體系樣品中蛋白質(zhì)含量Fig.6 Effects of different levels of HPP treatments on solubility of LF at different media