何曉葉，任 爽，鄭伊琰，高彥祥，袁 芳*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 教育部功能乳品重點實驗室 北京100083 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京100081）

超高壓（High Pressure Processing，HPP）是一種非熱食品加工技術(shù)，近年來在國內(nèi)外得到廣泛的研究。食品的超高壓處理技術(shù)，是利用水等傳壓介質(zhì)在100～1 000 MPa 壓力范圍使食品內(nèi)部產(chǎn)生物理、化學(xué)及生物效應(yīng)，從而達到滅菌改性等目的[1]。HPP 技術(shù)具有處理溫度低，食品營養(yǎng)成分及色香味損失少，處理效率高，能耗少等優(yōu)點，目前已商業(yè)化應(yīng)用于果汁類產(chǎn)品中。超高壓可以通過影響蛋白質(zhì)的分子體積、非共價鍵等引起蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，進而改善蛋白質(zhì)的功能特性（特別是乳化特性），然而可能具有一定副作用，例如導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，誘導(dǎo)多肽聚集和解離，改變其表面疏水性、溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)[2]。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)與功能性質(zhì)受多重因素影響，不僅與氨基酸的組成、結(jié)構(gòu)、分子大小等本身屬性有關(guān)，還與其所處環(huán)境有關(guān)，如溫度、pH 值、離子強度等。在不同離子組成的緩沖體系中，因離子的吸附作用不同，故蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)和穩(wěn)定性也不同。pH 值也是影響蛋白質(zhì)狀態(tài)的重要因素，它通過改變蛋白質(zhì)表面的電荷來影響蛋白質(zhì)分子間的交互作用。有研究表明，在磷酸鹽緩沖液中提高壓力和保壓時間會使鷹嘴豆分離蛋白溶解性明顯下降，而增強體系的離子強度能有效阻止這種現(xiàn)象[3]。還有研究表明，經(jīng)600 MPa 超高壓處理，與乳清和脫脂牛乳體系相比，磷酸鹽緩沖體系中的牛乳鐵蛋白依然保持較高的免疫活性[4]。研究緩沖體系對蛋白質(zhì)的影響具有重要意義。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）存在于哺乳動物的外分泌液中，是一條分子質(zhì)量約80 ku 的鐵結(jié)合性糖蛋白，這條多肽鏈上結(jié)合有兩條糖鏈，含量為7%左右[5]。牛乳鐵蛋白由689 個氨基酸組成，二級結(jié)構(gòu)呈“二枚銀杏葉型”，分別在分子的C-端和N-端形成2 個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且每葉的內(nèi)部縫隙處都有一個鐵結(jié)合位點[6]。每個鐵結(jié)合位點均由4 個氨基酸殘基（1 個組氨酸、1 個天冬氨酸、2 個酪氨酸）組成配位體，螯合一個Fe3+。乳鐵蛋白的等電點較高，在8.0 以上，這是它區(qū)別于其它食品級蛋白質(zhì)的一項重要性質(zhì)[7]。乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性，已被廣泛應(yīng)用于各種產(chǎn)品，如嬰兒配方奶粉、益生菌、補充片劑、寵物食品、化妝品、食品中鐵的天然增溶劑等[8]。

目前有文獻報道HPP 處理對乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響[2，4]，然而幾乎沒有文獻考慮到緩沖體系在其中所起作用。本試驗選擇磷酸鹽（Phosphate buffer saline，PBS）、檸檬酸鹽（Citrate buffer saline，CBS）和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖溶液，分別代表無機鹽、有機酸和有機堿緩沖體系，研究不同強度超高壓處理對不同緩沖體系中乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑 乳鐵蛋白，純度≥96.2%，鐵飽和度為9.85%，美國Hilmar 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），純度≥99.9%，日本Lanyi Reagent 公司；5，5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB），純度≥98%，美國Sigma 公司；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、考馬斯亮藍G250、乙醇、磷酸、牛血清白蛋白、甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和尿素，均為分析純級試劑。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 納米粒度電位儀（Zetasizer Nano-ZS90），英國Malvern 公司；熒光分光光度計（F-7000），日本Hitachi 公司；圓二色性光譜儀（Pistar π-180），英國Applied Photophysics 公司；紫外-可見分光光度計（UV-1800），日本島津公司；分析天平（AR1140），上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；pH 計（Orion Star），美國Thermo Scientific 公司；超高壓設(shè)備（HPP L2-700/1），天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；數(shù)顯電動磁力攪拌器（78HW-1），江蘇榮華儀器制造有限公司；高速離心機（3K15），美國Sigma 公司；冷凍干燥機（LGJ-12），北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳鐵蛋白溶液的制備及超高壓處理 將乳鐵蛋白粉末分別溶于10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS）、檸檬酸鹽緩沖液（CBS）和Tris-HCl 緩沖液中，置磁力攪拌器上攪拌2 h，使其充分溶解，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乳鐵蛋白溶液，加入抑菌劑疊氮化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%）防止微生物滋生。將每種緩沖體系的乳鐵蛋白溶液分成3 份，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH 值至3.0，5.0 和7.0，置4℃冰箱溶脹過夜。

將乳鐵蛋白溶液以一定體積分裝于聚乙烯袋中，用真空包裝機封口，置超高壓設(shè)備的壓力腔中，完全浸沒于傳壓介質(zhì)（去離子水）中，設(shè)置壓力和時間參數(shù)，進行超高壓處理。本試驗中設(shè)置的超高壓處理壓力分別為200，400 MPa 和600 MPa，時間為30 min，選取常壓（0.1 MPa）作對照，升壓速率和降壓速率分別為6.5 MPa/s 和20 MPa/s。經(jīng)超高壓處理的樣品一部分被保存于4℃冰箱待測，另一部分被冷凍干燥為粉末于室溫保存待測。

1.2.2 Zeta 電位的測定 利用納米粒度電位儀測定不同pH 值下超高壓處理前、后的乳鐵蛋白溶液的Zeta 電位。該儀器基于動態(tài)光散射原理（Dynamic light scattering，DLS）分析，通過測量光束的頻率和相位的變化來測定顆粒電泳的速度，從而求出Zeta 電位。測定時樣品池溫度設(shè)定為25℃。為了減少多重光散射造成的誤差，每個樣品重復(fù)測定3 次，最終以Zeta 電位（mV）表示顆粒的表面電勢。

1.2.3 游離巰基含量的測定參照Qin 等[9]的方法測定不同pH 值下超高壓處理前、后乳鐵蛋白中游離巰基的含量。首先將4 mg DTNB 溶解于1 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，4 mmol/L EDTA，pH=8.0）中配制Ellman's 試劑，稱取10～15 mg 乳鐵蛋白凍干粉溶解于含8 mol/L 尿素的上述Tris-甘氨酸緩沖液中，向其中加入40 μL Ellman's 試劑，于室溫反應(yīng)30 min，以對應(yīng)的緩沖溶液作空白對照，用UV-1800 型紫外-可見分光光度計測定樣品在波長412 nm 處的吸光值。每個樣品測定3 次游離巰基含量后取平均值。樣品的游離巰基含量計算公式：

式中，A412nm——波長412 nm 處的吸光度值；C——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；D——稀釋倍數(shù)（本試驗中未稀釋）。

1.2.4 紫外吸收光譜分析 將樣品用相應(yīng)緩沖溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，以相應(yīng)的緩沖溶液作為對照，用UV-1800 型紫外-可見分光光度計測定樣品在波長200～400 nm 范圍的吸光度，繪制乳鐵蛋白的紫外吸收光譜圖。

1.2.5 熒光光譜分析參考Sun 等[10]的方法，用相應(yīng)的緩沖溶液將樣品稀釋至質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，以LF 分子內(nèi)熒光基團作為探針，采用F-7000型熒光分光光度計進行熒光光譜掃描。設(shè)置激發(fā)波長292 nm（激發(fā)色氨酸熒光），發(fā)射波長300～450 nm，以1 200 nm/min 的掃描速度記錄熒光強度的變化。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，電壓為550 V，以相應(yīng)的空白緩沖溶液作對照。

1.2.6 圓二色性光譜分析參考Liu 等[11]的方法，將樣品用相應(yīng)緩沖溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的待測液，用Pistar π-180 型圓二色性光譜儀在室溫下測定，掃描范圍為遠(yuǎn)紫外區(qū)域190～260 nm，樣品池光程0.1 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率0.2 nm，頻帶寬度2 nm。所測數(shù)據(jù)通過網(wǎng)站http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk[12-13]在線分析。

1.2.7 溶解性 利用考馬斯亮藍法測定溶液中蛋白質(zhì)含量（μg）變化，探究不同pH 值下超高壓處理前、后乳鐵蛋白溶解性的變化。將不同處理的乳鐵蛋白溶液10 000×g、20℃高速離心15 min，取上清液，用相應(yīng)的緩沖溶液稀釋，用考馬斯亮藍法測定每毫升待測液中蛋白質(zhì)的含量，每個樣品做3 組平行。

1.2.8 統(tǒng)計分析 文中數(shù)據(jù)為3 次平行試驗的平均值，在α=0.05 水平下使用SPSS 16.0 對數(shù)據(jù)進行顯著性分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 超高壓對乳鐵蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 Zeta 電位分析 蛋白質(zhì)表面攜帶的電荷主要來自表面基團的電離作用，通常用Zeta 電位表示蛋白質(zhì)所帶平均電荷[14]。通過測定蛋白質(zhì)的Zeta 電位了解其帶電基團的暴露程度，以進一步分析其三級結(jié)構(gòu)的變化。

從圖1可以看出，與水溶液相比，加入緩沖物質(zhì)后乳鐵蛋白表面電位顯著降低。據(jù)報道，乳鐵蛋白等電點約為8.0[7]。在試驗的pH 條件下水溶液中的乳鐵蛋白表面均帶正電荷；而在緩沖液中，由于陰離子的吸附作用，中和了蛋白質(zhì)表面的正電荷，導(dǎo)致其Zeta 電位降低，等電點隨之發(fā)生變化。3 種緩沖液中乳鐵蛋白的等電點分別降到5～7間，5 左右和7 左右。以水溶液為對照，根據(jù)Zeta電位下降幅度不同，可推斷3 種緩沖溶液離子吸附能力CBS＞PBS＞Tris-HCl，這可能與3 種緩沖物質(zhì)的解離常數(shù)pKa 值有關(guān)。此外，Tris-HCl 緩沖液離子強度較低[15]，也可能是導(dǎo)致其吸附能力弱的原因之一。

圖1 不同pH 值條件下不同強度的超高壓處理對乳鐵蛋白Zeta 電位的影響Fig.1 Effect of different levels of HPP treatments on Zeta potential of LF at different pH

在水溶液中，隨超高壓處理壓力的增加，乳鐵蛋白表面電荷沒有顯著的變化，且變化較無規(guī)律。而在緩沖液中，由于存在離子的吸附作用，因此電位的變化趨勢與水中明顯不同。在PBS 和CBS 緩沖液中pH 3 條件，以及Tris-HCl 緩沖液中pH 3和pH 7 條件下，隨著處理壓力的升高（200～600 MPa），乳鐵蛋白表面電荷量（電位的絕對值）呈上升趨勢。有文獻報道，蛋白質(zhì)表面電荷增加可增強分子間的靜電排斥作用，提高溶液的穩(wěn)定性[16]。簡俊麗等[17]在研究超高壓處理對β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)隨超高壓處理壓力的增加，蛋白質(zhì)表面電位呈上升趨勢，推測可能是蛋白質(zhì)聚集所致。而在PBS 緩沖液中pH 5 和pH 7 以及CBS 緩沖液中pH 5 的條件下，隨著壓力的升高，乳鐵蛋白的Zeta 電位沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），可能是因為緩沖液中乳鐵蛋白等電點發(fā)生改變，這些pH值剛好接近蛋白等電點，蛋白質(zhì)表面電荷接近0，超高壓處理后也沒有明顯變化。

2.1.2 游離巰基含量分析 不同強度超高壓處理對不同緩沖液中乳鐵蛋白游離巰基含量的影響如圖2所示。在PBS 緩沖液中，pH 5 和pH 7 條件下，200～400 MPa 處理的蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），600 MPa 處理的蛋白質(zhì)游離巰基含量顯著上升（P＜0.05），這可能是因為超高壓破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非共價鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，從而暴露出埋藏在內(nèi)部的巰基基團[9]。在CBS 緩沖液中，過高的壓力（600 MPa）使得蛋白質(zhì)的游離巰基含量下降。Qin 等[9]發(fā)現(xiàn)隨處理壓力的增加，Tris-甘氨酸緩沖液中核桃分離蛋白游離巰基含量先上升后下降，下降的趨勢可能是由于進一步增高的壓力使得暴露出來的巰基形成二硫鍵鍵橋，使部分蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集。CBS緩沖液中pH 7 時游離巰基含量隨壓力的升高而降低，這與Yang 等[18]研究超高壓處理對Tris-甘氨酸緩沖體系中大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果一致，分析可能是由于超高壓使蛋白質(zhì)表面的游離巰基通過SH/S-S 交換反應(yīng)形成分子內(nèi)二硫鍵。在Tris-HCl 緩沖液中，pH 7 時，壓力增到600 MPa，游離巰基含量顯著升高（P＜0.05），達到6.23 μmol/L，是其它條件下游離巰基含量的3～4 倍，這可能是因為Tris-HCl 緩沖體系中蛋白質(zhì)等電點接近7（見圖1d），此時分子間靜電排斥作用弱，在高壓下易發(fā)生變性，甚至產(chǎn)生沉淀。

圖2 不同pH 值條件下不同強度的超高壓處理對乳鐵蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effect of different levels of HPP treatments on the free SH content of LF at different pH

2.1.3 紫外吸收光譜分析 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)有吸收紫外光的性質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致其氨基酸殘基位置和周圍環(huán)境發(fā)生改變，從而引起紫外吸收光譜的變化。

圖3顯示不同緩沖體系下超高壓處理前、后乳鐵蛋白紫外吸收光譜的變化。可以看出，PBS 體系中乳鐵蛋白紫外吸收光譜受超高壓影響程度最大，而CBS 和Tris-HCl 中乳鐵蛋白對超高壓耐受能力相對較強。有文獻報道，PBS 緩沖液中磷酸氫根離子可以催化蛋白質(zhì)分子聚合[19]，可以與結(jié)合金屬離子的組氨酸殘基反應(yīng)[20]，這些都可能導(dǎo)致PBS 緩沖體系中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定。而Tris-HCl 體系中，除pH 7，600 MPa 條件外，其它條件下蛋白質(zhì)紫外吸收光譜變化不顯著。劉堅等[3]在研究超高壓對不同緩沖體系中鷹嘴豆分離蛋白溶解性的影響時，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl 緩沖體系中蛋白質(zhì)溶解性的變化最不顯著，并稱之為抗壓型緩沖體系，說明該緩沖體系中蛋白質(zhì)對超高壓耐受能力較強，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)受超高壓影響較小。

在PBS 體系中，酸性條件下超高壓對乳鐵蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響更大。如圖3a 顯示，隨著超高壓壓力的增加，最大吸光度呈先降后升的趨勢，且在400 MPa 時的最大吸光值最低。這說明低強度的超高壓處理導(dǎo)致乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)變得更加致密，色氨酸等疏水性氨基酸被包裹得更深，而高強度的超高壓處理使蛋白質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的內(nèi)部氨基酸基團。喬寧等[21]研究超高壓對綠豆球蛋白結(jié)構(gòu)的影響時也發(fā)現(xiàn)，隨著壓力的增加，蛋白質(zhì)的最大紫外吸光度先降后升，與本試驗結(jié)果一致。而在有機緩沖體系中，乳鐵蛋白在酸性條件下較穩(wěn)定，在中性條件下變化較大。CBS 體系中乳鐵蛋白的最大紫外吸光度隨壓力的變化趨勢與PBS 體系中的相同，均先降低后升高，不同的是CBS 體系中乳鐵蛋白在壓力200 MPa 時的最大紫外吸光值最低。在Tris-HCl 緩沖體系中，pH 7 條件下，600 MPa 處理的樣品紫外吸收光譜突然升高，且高于其它條件，說明蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生驟變。這一結(jié)果與游離巰基含量測定結(jié)果相吻合，進一步說明pH 值接近蛋白質(zhì)等電點時，因分子間靜電排斥作用減弱，故超高壓處理后蛋白質(zhì)更易發(fā)生變性。

圖3 不同強度超高壓對乳鐵蛋白的紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of different levels of HPP treatments on UV absorption spectrum of LF

2.1.4 熒光光譜分析 由于作用基團基本一致，熒光光譜與紫外吸收光譜的變化趨勢基本一致，結(jié)果可互相印證。由圖4可見，同一pH 值下，超高壓處理未使乳鐵蛋白的熒光光譜發(fā)生藍移或紅移。Franco 等[4]用400，500 MPa 和600 MPa 壓力處理PBS 緩沖液中（pH 7.4）的乳鐵蛋白，發(fā)現(xiàn)超高壓處理并未改變?nèi)殍F蛋白熒光光譜的λmax值（即未發(fā)生紅移和藍移），與本試驗結(jié)果一致。與其它pH 值相比，pH 3 時蛋白質(zhì)熒光光譜的最大發(fā)射峰明顯紅移，說明酸性條件下乳鐵蛋白氨基酸所處環(huán)境的極性增強。此外，pH 3 時，蛋白質(zhì)的熒光強度明顯高于其它pH 條件的，這可能是由于隨著pH 值的下降，乳鐵蛋白結(jié)合鐵離子的能力迅速降低，大量鐵離子從蛋白中釋放出來，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，易受超高壓處理的影響[22]。

緩沖體系成分對乳鐵蛋白最大發(fā)射峰的位置無明顯影響，說明其氨基酸微環(huán)境的極性未改變。此外，從圖4可以看出，同一pH 值和壓力的條件下，不同緩沖液中乳鐵蛋白最大發(fā)射峰的熒光強度略有不同：Tris-HCl>CBS>PBS。Su 等[23]發(fā)現(xiàn)同一pH 值下PBS 緩沖液中黃嘌呤氧化酶的熒光強度略高于Tris-HCl 緩沖液中氧化酶的熒光強度，與本試驗結(jié)果有相似之處，分析其可能與緩沖液中溶質(zhì)的極性有關(guān)。PBS 緩沖液的疏水性較強，對蛋白質(zhì)分子的穿透能力較強，更易于進入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而不改變其分子結(jié)構(gòu)，因而分子內(nèi)部的色氨酸等疏水性氨基酸未能暴露出來，因此檢測到的熒光強度偏低。

圖4 不同強度超高壓對乳鐵蛋白的熒光光譜的影響Fig.4 Effect of different levels of HPP treatments on fluorescence of LF

2.2 超高壓對乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

不同超高壓處理條件下得到的圓二色譜見圖5。乳鐵蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖以反平行β-折疊圖譜為特征峰[24]，在pH 3 條件下最小峰值在204 nm 處，在pH 5 和pH 7 條件下最小峰值在210 nm 處，說明緩沖體系的酸堿度影響乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從計算結(jié)果看，3 種緩沖液中，同一pH 值和壓力條件下，乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成并無明顯變化，說明緩沖溶液的種類不影響乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)。然而，緩沖液的pH 值對二級結(jié)構(gòu)的影響較為顯著，從表1中可以看出，pH 3 條件下α-螺旋的含量顯著低于pH 5 和pH 7 條件下的含量（P＜0.05），相差約10%；而無規(guī)則卷曲的含量顯著高于其它條件（P＜0.05），相差約7%。據(jù)報道，α-螺旋結(jié)構(gòu)的上升表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)逐漸變得緊湊[25]，α-螺旋結(jié)構(gòu)的下降則表明其結(jié)構(gòu)變得松散；另一方面，無規(guī)則卷曲的增加也說明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變得松散[21]。這些結(jié)果共同表明酸性條件下乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差，易變性。由2.1 節(jié)分析可知，超高壓處理對乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)影響顯著，而經(jīng)計算發(fā)現(xiàn)，其對蛋白的二級結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（P＞0.05）。He 等[2]研究超高壓（300～700 MPa）對PBS 緩沖液中牛乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)的影響時也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，分析可能是由于適當(dāng)?shù)某邏禾幚泶龠M了乳鐵蛋白熔球結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)高度水合，保留了較多的二級結(jié)構(gòu)和較少的穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。pH 7 的Tris-HCl 緩沖液中，壓力200～400 MPa 時，乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成為21.5%的α-螺旋，29.1%的β-折疊，21.6%的β-轉(zhuǎn)角，27.4%的無規(guī)則卷曲，當(dāng)壓力升至600 MPa 時，乳鐵蛋白的α-螺旋含量顯著降至15.2%，β-折疊顯著升至35.6%。據(jù)報道，β-折疊在聚集蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的較多[26]，說明處理后的乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加松散，且易于聚集，不穩(wěn)定?？赡苁怯捎诖司彌_液中乳鐵蛋白的等電點接近7，說明pH 7 條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，易發(fā)生變性。

圖5 不同強度超高壓處理對乳鐵蛋白的圓二色性光譜的影響Fig.5 Effect of different levels of HPP treatments on the far-UV CD spectra of LF

表1 不同緩沖體系中不同pH 值和壓強條件下乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of LF at different pH under different pressures in different buffer systems

2.3 超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響

不同緩沖體系和pH 值條件下超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響如圖6所示。在PBS 體系中，超高壓對乳鐵蛋白溶解性的影響最大，而在CBS 和Tris-HCl 體系中蛋白質(zhì)溶解性受超高壓的影響較小，這與2.1.3 節(jié)紫外吸收光譜的測定結(jié)果一致，說明結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其溶解性的變化。CBS 體系中蛋白質(zhì)溶解性幾乎不受超高壓影響，可能是其強離子吸附作用賦予蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的溶解性。

隨著pH 值的升高，乳鐵蛋白溶解度逐漸降低，是由于pH 值越來越接近蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)表面電荷逐漸減少，表面基團的水合作用減弱，從而溶解度降低。在變化較明顯的PBS 體系中，酸性條件下，隨著處理壓力的增加，乳鐵蛋白的溶解性呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，與紫外吸收光譜結(jié)果一致。據(jù)報道，將蛋白質(zhì)進行超高壓處理時，凝聚的球狀蛋白質(zhì)逐漸伸展和解締，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性基團和非極性基團得以暴露，新暴露的極性基團表面的結(jié)合水增多，且分子表面電荷增加，可能是導(dǎo)致其溶解度增大的原因之一[20]。在Tris-HCl 中，pH 7 條件下經(jīng)600 MPa 處理后樣品析出大量絮狀沉淀，溶解度降幅最大，與2.1 和2.2節(jié)的分析結(jié)果一致，說明等電點附近蛋白質(zhì)溶解度受超高壓影響最大。

3 結(jié)論

超高壓處理使乳鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，在不同緩沖液中變化趨勢和幅度略有不同，從整體來看，低強度的超高壓處理使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)趨向緊密，高強度處理則破壞其中的非共價鍵并導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的展開和解蒂，暴露出內(nèi)部疏水性基團；結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致溶解性發(fā)生相應(yīng)變化，即低壓下蛋白質(zhì)溶解性下降，高壓時蛋白質(zhì)溶解性又回升；超高壓處理對乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響。

緩沖液的pH 值、緩沖物質(zhì)及離子強度等對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響。酸性條件下，乳鐵蛋白的氨基酸殘基所處微環(huán)境極性增強，且由于鐵離子釋放等原因，在超高壓處理過程中結(jié)構(gòu)更易展開。PBS 體系中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定，超高壓處理對其三級結(jié)構(gòu)及溶解性的影響最大，這可能與磷酸氫根的催化能力及其與組氨酸的相互作用有關(guān)。緩沖液中離子強度及pKa 值的不同導(dǎo)致離子的吸附能力不同（CBS＞Tris-HCl＞PBS），并導(dǎo)致乳鐵蛋白的Zeta 電位和等電點發(fā)生不同程度的降低。緩沖物質(zhì)的種類對乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)無明顯影響，然而，酸性pH 值下蛋白質(zhì)的α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，結(jié)構(gòu)松散不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集。綜上所述，3 種緩沖液中乳鐵蛋白對超高壓耐受能力：CBS＞Tris-HCl＞PBS。

圖6 不同強度超高壓處理前、后不同緩沖體系樣品中蛋白質(zhì)含量Fig.6 Effects of different levels of HPP treatments on solubility of LF at different media