樊 蕊，郝云濤，康佳偉，胡佳妮，徐美虹，李 勇

（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系 北京100191）

隨著年齡增加，中老年人肌骨系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)退行性病變，包括，骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉減少癥等，表現(xiàn)為骨質(zhì)丟失、關(guān)節(jié)軟骨磨損、骨微結(jié)構(gòu)破壞，肌肉減少，最終導(dǎo)致相應(yīng)功能退化[1-3]。骨質(zhì)疏松和骨折被認(rèn)為是與增齡相關(guān)的2 型糖尿病并發(fā)癥[4]，并且60 歲以上患者肌肉減少癥的患病率高于血糖正常人群1～2 倍[5]。肌骨系統(tǒng)退行性病變不僅對(duì)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)影響巨大，還損壞了糖尿病老年患者的運(yùn)動(dòng)機(jī)能，顯著增加了跌倒事件和骨折的發(fā)生率。肌骨系統(tǒng)的增齡性病變還可影響其它系統(tǒng)的機(jī)能，嚴(yán)重影響糖尿病老年患者的生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。因此，關(guān)注糖尿病患者肌骨系統(tǒng)的退行性疾病，提升其運(yùn)動(dòng)機(jī)能，對(duì)提升患者生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義。

軟骨的主要組成物質(zhì)之一是膠原蛋白，其構(gòu)成中90%以上為Ⅱ型膠原蛋白。Ⅱ型膠原蛋白起到維持軟骨組織和結(jié)構(gòu)的完整性，刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化，提升關(guān)節(jié)性能，促進(jìn)骨形成的作用[6-8]。

目前，傳統(tǒng)的Ⅱ型膠原蛋白生產(chǎn)主要經(jīng)過(guò)氯仿脫脂、鹽酸胍去多糖、蛋白酶解等步驟[9]。然而，在制備過(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫酶解，易發(fā)生部分變性，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響其作用與功能。本研究采用國(guó)內(nèi)首例研發(fā)的非變性Ⅱ型膠原蛋白，研究其對(duì)老年糖尿病小鼠運(yùn)動(dòng)能力的改善作用，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本研究率先采用終生喂養(yǎng)自發(fā)2 型糖尿病小鼠——db/db 小鼠作為模型動(dòng)物，旨在對(duì)老年2 型糖尿病患者運(yùn)動(dòng)能力的提升提供膳食營(yíng)養(yǎng)依據(jù)，改善患者的生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與受試物

雄性db/db 小鼠【10 周齡，體重（25 ±2）g】，與之周齡匹配的同窩出生的非糖尿病雄性小鼠（db/m），由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0010】。屏障環(huán)境動(dòng)物房【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0041】，SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%。以美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)（AIN-93G）動(dòng)物飼料作為基礎(chǔ)飼料，所有動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。待db/db 小鼠正常喂養(yǎng)至50 周齡，將45 只小鼠【空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L，體重（73 ±2）g】分為3 組：模型對(duì)照組（飲用無(wú)菌蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組【飲用硫酸軟骨素（180 mg/kg bw）復(fù)配氨基葡萄糖（225 mg/kg bw）溶液】、UCⅡ干預(yù)組【飲用非變性II 型膠原蛋白（6 mg/kg bw）配制的溶液】。正常對(duì)照組（n=15）為同周齡db/m 小鼠（正常飲用無(wú)菌蒸餾水），青年對(duì)照組（n=15）為正常喂養(yǎng)至25周齡的雄性db/db 小鼠（正常飲用無(wú)菌蒸餾水）。干預(yù)16 周，在干預(yù)第12 周進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估。干預(yù)結(jié)束后，眼眶取血，脫頸椎處死，無(wú)菌快速剝離組織器官，待測(cè)。

非變性Ⅱ型膠原蛋白（UCⅡ）、硫酸軟骨素、復(fù)配氨基葡萄糖，北京盛美諾生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

CatWalk XT 10.6 動(dòng)物步態(tài)采集分析系統(tǒng)，荷蘭Noldus 公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測(cè)定 每天觀察小鼠狀態(tài)（毛發(fā)光澤、精神狀態(tài)和活動(dòng)情況），每周記錄小鼠攝食量、飲水量、體重。

1.3.2 腓腸肌指數(shù) 小鼠處死后，快速剝離腓腸肌，稱重，計(jì)算腓腸肌指數(shù)。

腓腸肌指數(shù)（%）=腓腸肌重（g）/體重（kg）×100

1.3.3 爬網(wǎng)能力評(píng)價(jià) 將小鼠放置在垂直置于地面的金屬網(wǎng)（150 cm×50 cm）頂端，記錄小鼠在金屬網(wǎng)上的停留時(shí)間。

1.3.4 步態(tài)情況評(píng)價(jià) 為了讓小鼠適應(yīng)通道環(huán)境，首先對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，訓(xùn)練期間不做數(shù)據(jù)記錄。將小鼠放置于跑道起點(diǎn)端，讓其自由探索，從起點(diǎn)端跑至重點(diǎn)端，認(rèn)為成功完成一次訓(xùn)練。若小鼠遲遲未跑完全程，或者原地不動(dòng)，可以給予小鼠一定的刺激，或者在終點(diǎn)的暗盒中放置食物，誘導(dǎo)其跑至終點(diǎn)。每只小鼠每天訓(xùn)練3 次，連續(xù)訓(xùn)練1 周。正式測(cè)試中，測(cè)試期間如果小鼠出現(xiàn)躊躇、往回跑、停止等情況，則需要重新再跑。合格的跑動(dòng)中須包含7～8 個(gè)連續(xù)步數(shù)。每只小鼠的測(cè)試至少要有3 次有效跑動(dòng)結(jié)果，之后用軟件CatWalk XT Version 10.6 分析，取各個(gè)指標(biāo)均值用于最后的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0 軟件。采用ANOVA 對(duì)組間進(jìn)行分析。采用LSD 分析各組之間差異。采用Pearson 分析表征參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 老年db/db 小鼠腓腸肌指數(shù)

由圖1可知，模型對(duì)照組體重最高，UCⅡ干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組、青年對(duì)照組體重依次減小，正常對(duì)照組最低。其中模型對(duì)照組和UCⅡ干預(yù)組小鼠體重分別為58.9 g 和57.8 g，顯著高于正常對(duì)照組（46 g）（P＜0.05）。UCⅡ干預(yù)組腓腸肌指數(shù)為0.44%，顯著高于模型對(duì)照組（0.27%）（P＜0.05）。

圖1 db/db 小鼠體重和腓腸肌指數(shù)Fig.1 The body weight and gastrocnemius index of db/db mice

2.2 老年db/db 小鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)

由表1可以看出，模型對(duì)照組骨密度最小，與UCⅡ干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組和青年對(duì)照組呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），UCII 干預(yù)顯著提高老年db/db 小鼠、老年正常小鼠骨密度（P＜0.05）。UCⅡ干預(yù)組的骨小梁相對(duì)體積和骨小梁數(shù)量最大，陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組、青年對(duì)照組、模型對(duì)照組依次減小，其中，模型對(duì)照組骨小梁相對(duì)體積、骨小梁數(shù)量分別小于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和UCⅡ干預(yù)組（P＜0.05）。

表1 db/db 小鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)Table 1 The bone morphometry of db/db mice

2.3 老年db/db 小鼠爬網(wǎng)能力

由圖2可知，爬網(wǎng)時(shí)間最長(zhǎng)的為正常對(duì)照組，分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和UCⅡ干預(yù)組的9.81 倍、8.84 倍和6.02 倍，UCⅡ干預(yù)顯著提升了模型對(duì)照組的爬網(wǎng)時(shí)間（P＜0.05）。

圖2 db/db 小鼠爬網(wǎng)時(shí)間Fig.2 The crawl time of db/db mice

2.4 老年db/db 小鼠步態(tài)參數(shù)分析

2.4.1 db/db 小鼠步態(tài)距離參數(shù)的測(cè)定 由表2可以看出，右后肢步幅和左前肢步幅在各組之間差異不顯著（P＞0.05），老年db/db 小鼠步幅周期顯著高于正常小鼠（P＜0.05），經(jīng)過(guò)UCⅡ干預(yù)，老年db/db 小鼠右前肢步幅、左后肢步幅顯著增加（P＜0.05）。

表2 db/db 小鼠步態(tài)距離參數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of the distance parameter of catwalk in db/db mice

2.4.2 db/db 小鼠步態(tài)時(shí)間參數(shù)的測(cè)定 由表3可以看出，5 組間右后肢擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)差異不顯著（P＞0.05），老年db/db 小鼠右前肢擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、左后肢擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)顯著高于青年db/db 小鼠和正常小鼠（P＜0.05），經(jīng)過(guò)UC 干預(yù)顯著降低擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)（P＜0.05）。各組擺動(dòng)速度最快的為UCⅡ干預(yù)組，其右前肢、右后肢和左后肢擺動(dòng)速度顯著大于模型對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 db/db 小鼠步態(tài)時(shí)間參數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of the time parameter of catwalk in db/db mice

2.4.3 db/db 小鼠步態(tài)支撐相的測(cè)定由表4可知，各組右肢支撐相間差異并未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且UCⅡ干預(yù)并未顯著改變四肢支撐相時(shí)相（P＞0.05）。

表4 db/db 小鼠步態(tài)支撐相測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of the duty cycle of catwalk in in db/db mice

2.4.4 db/db 小鼠步態(tài)協(xié)調(diào)性相關(guān)參數(shù)的測(cè)定由表5可知，各組步序比并未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。老年db/db 小鼠步速顯著低于其余各組小鼠。UCⅡ干預(yù)顯著提升老年db/db 小鼠步速和步調(diào)，并且提升步調(diào)的效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。

表5 db/db 小鼠步態(tài)協(xié)調(diào)性相關(guān)參數(shù)Table 5 The coordination of catwalk in in db/db mice

2.4.5 db/db 小鼠腓腸肌指數(shù)、骨骼與步態(tài)特征相關(guān)性分析 由表6可知，小鼠步態(tài)相關(guān)特征和爬網(wǎng)時(shí)間與其腓腸肌質(zhì)量、骨密度存在一定的相關(guān)性。其中腓腸肌指數(shù)與爬網(wǎng)時(shí)間之間有一定的聯(lián)系（P＜0.05，系數(shù)＞0.5）。小鼠腓腸肌指數(shù)與小鼠后肢支撐相呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，系數(shù)＞0.5）。小鼠骨密度與右后肢擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系（系數(shù)＞0.5）。骨密度與爬網(wǎng)時(shí)間、左后肢支撐相、后肢擺動(dòng)速度呈現(xiàn)一定正相關(guān)關(guān)系（系數(shù)＞0.5），其中骨密度與后肢擺動(dòng)速度、左后肢支撐高度正相關(guān)（P＜0.05）。

表6 db/db 小鼠腓腸肌指數(shù)、骨骼與步態(tài)特征的相關(guān)性分析Table 6 The correlation analysis between gastrocnemius index，bone mineral density and catwalk indexes of db/db mice

3 討論

報(bào)道指出，與血糖正常的老年人相比，糖尿病老年患者四肢肌肉和腿部伸展力量明顯下降[10]。胰島素抵抗（IR）通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）通路，降低了蛋白質(zhì)合成，IR促進(jìn)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1 的磷酸化，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)泛素E3 連接酶肌肉降解因子和肌肉環(huán)指蛋白1 的表達(dá)，導(dǎo)致肌肉蛋白降解增加[11]。本文發(fā)現(xiàn)，老年糖尿病小鼠腓腸肌指數(shù)顯著低于正常小鼠和青年糖尿病小鼠（P＜0.05）。隨著糖尿病患者年齡增大，病程增長(zhǎng)，肌肉質(zhì)量進(jìn)一步減少，并且出現(xiàn)脂肪浸潤(rùn)現(xiàn)象，加劇IR，造成惡性循環(huán)。

研究表明，肌肉減少癥的營(yíng)養(yǎng)治療方式是膳食補(bǔ)充蛋白質(zhì)[12]。通過(guò)UCⅡ干預(yù)，可以明顯看到db/db 老年小鼠腓腸肌指數(shù)增加至0.44%（P＜0.05）。小鼠的爬網(wǎng)能力也在一定程度上受腓腸肌指數(shù)的影響（表6），可能是由于肌肉質(zhì)量下降導(dǎo)致力量和功能減退。然而，正常對(duì)照組db/m 小鼠爬網(wǎng)時(shí)間最長(zhǎng)，可能原因是其體重顯著低于其余各組。

造成糖尿病患者骨質(zhì)損失的因素，包括血糖控制不佳、低胰島素血癥和糖尿病并發(fā)癥引起的Ca、P 等礦物質(zhì)的缺乏[13]。另一方面，糖尿病患者的機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)，由于TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的分泌增加，激活了核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）通路，從而提高了破骨細(xì)胞活性，骨吸收增加，造成骨丟失[14]。本文發(fā)現(xiàn)，db/db 老年小鼠骨密度顯著低于青年db/db 小鼠（P＜0.05），db/db 老年小鼠骨小梁相對(duì)體積、骨小梁數(shù)量顯著低于正常小鼠（P＜0.05），UCⅡ和氨糖硫氨酸干預(yù)可有效改善老年db/db 小鼠骨密度和骨小梁的結(jié)構(gòu)（P＜0.05）。增齡導(dǎo)致肌肉萎縮，從而使得肌肉無(wú)法給骨骼產(chǎn)生足夠的應(yīng)力刺激，導(dǎo)致骨吸收加速，骨小梁數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)損傷。臨床研究表明，Ⅱ型膠原蛋白能升高血清骨鈣素水平，增加骨密度[15]，這與其中富含羥脯胺酸有密切關(guān)系[16]。

靈活性下降，肌力減弱等生物性原因的相互作用導(dǎo)致了老年人步態(tài)的變化，加之糖尿病常見并發(fā)癥——糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）使患者在病程早期出現(xiàn)對(duì)稱性肢體麻木、踩棉花感等癥狀。糖尿病老年患者表現(xiàn)為步態(tài)異常、體態(tài)搖擺，因而易跌倒。其表現(xiàn)為：老年db/db 小鼠右前肢、左前肢和左后肢步幅周期，擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相似。步幅的減小源于衰老導(dǎo)致的膠原蛋白減少、彈性下降導(dǎo)致的四肢僵硬[18]，UCⅡ干預(yù)可有效改善步幅。文獻(xiàn)報(bào)道，鏈脲佐菌素（STZ）注射大鼠造模后12 周，DPN模型大鼠出現(xiàn)步行周期顯著延長(zhǎng)，擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)、支撐項(xiàng)時(shí)相增加，步幅減小、步行速度減小、協(xié)調(diào)性降低的現(xiàn)象[18]。本文也得到相似的結(jié)論，模型對(duì)照組的步序比和步調(diào)較小，步速顯著低于其余各組。微血管病變、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變、糖尿病足等，導(dǎo)致疼痛、麻木、乏力、平衡障礙，造成步態(tài)變化糖尿病可引起骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松，疼痛引起小鼠步態(tài)支撐相時(shí)長(zhǎng)增加，并且老年糖尿病患者肌肉質(zhì)量和功能下降，導(dǎo)致拖曳步態(tài)，膝關(guān)節(jié)與地面夾角減小，軀體縱軸嚴(yán)重偏離錘線，步速降低[18-19]。UCⅡ干預(yù)可以改善老年db/db 小鼠步態(tài)，通過(guò)分析腓腸肌指數(shù)與步態(tài)參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UCⅡ干預(yù)可以一定程度恢復(fù)肌肉質(zhì)量和功能，緩解疼痛，從而糾正步行姿勢(shì)，改善步態(tài)。綜上所述，UCⅡ干預(yù)可以顯著改善db/db 老年小鼠的步態(tài)參數(shù)。

本文分析了骨密度與db/db 小鼠運(yùn)動(dòng)參數(shù)的關(guān)系，小鼠骨密度與右后肢擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，骨密度與爬網(wǎng)時(shí)間、左后肢支撐相、后肢擺動(dòng)速度呈現(xiàn)一定正相關(guān)關(guān)系，其中骨密度與后肢擺動(dòng)速度、左后肢支撐相存在顯著正相關(guān)關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道，膠原蛋白可刺激成骨細(xì)胞數(shù)量增加，降低破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)新骨形成，有效維持骨密度，增加骨骼的堅(jiān)固性[16]。水解的膠原蛋白經(jīng)小腸吸收后在軟骨積累，刺激軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外大分子基質(zhì)和膠原蛋白，修復(fù)受損軟骨，回復(fù)軟骨彈性，改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀[20]。因此，與老年模型組相比，UCⅡ干預(yù)組的骨密度和骨形態(tài)學(xué)參數(shù)明顯改善。綜上所述，UCⅡ改善db/db 老年小鼠步態(tài)參數(shù)的作用可能是通過(guò)改善骨骼和肌肉的功能實(shí)現(xiàn)的。另外，本文發(fā)現(xiàn)，在改善db/db 老年小鼠骨骼健康和步行功能方面，UCⅡ干預(yù)組的效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組（硫酸軟骨素+氨基葡萄糖），相似結(jié)論在其它報(bào)道中也有證實(shí)[21]。

綜上所述，UCⅡ可以改善db/db 老年小鼠的肌肉質(zhì)量，增加骨密度，并在一定程度上改善db/db 老年小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，推測(cè)其可以通過(guò)改善骨退行性疾病提升其運(yùn)動(dòng)功能。在后期研究中，將對(duì)UCⅡ改善老年糖尿病小鼠運(yùn)動(dòng)功能的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究以正常喂養(yǎng)至老年的db/db 小鼠為模型動(dòng)物，通過(guò)UCⅡ?qū)ζ溥M(jìn)行16 周干預(yù)，通過(guò)腓腸肌質(zhì)量、骨密度的測(cè)定，骨形態(tài)劑量學(xué)參數(shù)的分析，運(yùn)動(dòng)機(jī)能的評(píng)估，表征UCⅡ?qū)夏阣b/db 小鼠肌骨系統(tǒng)退行性改變的影響。結(jié)果表明：UCⅡ干預(yù)組腓腸肌指數(shù)、骨密度、骨小梁相對(duì)體積和數(shù)量明顯大于模型對(duì)照組（P＜0.05）。UCⅡ干預(yù)顯著提升db/db 老年小鼠的爬網(wǎng)能力（P＜0.05），顯著提升其步幅、擺動(dòng)速度、步速、步調(diào)和步序比，UCⅡ干預(yù)顯著降低擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、支撐相時(shí)長(zhǎng)。試驗(yàn)表明，小鼠腓腸肌指數(shù)與支撐相時(shí)長(zhǎng)、爬網(wǎng)時(shí)間呈正相關(guān)（P＜0.05，系數(shù)＞0.5），小鼠骨密度與爬網(wǎng)時(shí)間、支撐相時(shí)長(zhǎng)、擺動(dòng)速度呈現(xiàn)一定正相關(guān)（系數(shù)＞0.5），提示UCⅡ可以改善db/db 小鼠由于增齡帶來(lái)的腓腸肌質(zhì)量、骨密度的下降，提高其運(yùn)動(dòng)能力。