王柯諾，從俊峰，顧 雙，王向陽

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018）

隨著居民生活水平的不斷提高，人們越來越多地食用高能量的食品，加之缺乏鍛煉，高血壓患者越來越多。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是人體內調節(jié)血壓升高的系統(tǒng)，該系統(tǒng)中血管緊張素轉化酶（ACE）將血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）水解轉化成一種致使血壓升高的血管收縮劑——血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），同時使激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）中的降血壓物質緩激肽（BK）失活，抑制降壓系統(tǒng)，促進升壓系統(tǒng)，致使血壓升高[1]。適當抑制ACE活性，可能有利于緩解高血壓。日常飲食中飲料和堅果等一些加工食品的食用量較大，然而其對ACE 的活性的影響尚不清楚。

血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）作為目前五大類常用的降壓藥物之一，不僅能降血壓，還能治療心力衰竭、慢性腎功能衰竭等一些高血壓，并發(fā)癥[2]，然而長期食用此類化學合成的ACEI，常伴隨干咳、水腫、腎功能損傷、高血鉀等不良反應，心血管、呼吸、皮膚等多個系統(tǒng)都受到不同程度的影響，更有患者因此停止用藥[3-6]。鑒于此，國內外學者開始尋找安全有效的降壓藥。食源性ACE 抑制肽逐漸進入人們的視野中。現(xiàn)階段食源性ACE 抑制肽的研究對象多以食用蛋白質或者食品加工后廢棄的下腳料為主，包括乳蛋白和動、植物蛋白[7]，如牛羊乳、鮰魚皮、蝦仁加工副產物、茶渣[8]、米糠[9]、扇貝裙邊[10]、利馬豆[11]、魚鱗蛋白[12]等。于志鵬等[13]研究獲得雞蛋蛋白中的FQK、WGK 和ADW三肽，它們能與ACE 的活性口袋S1 和S2 形成氫鍵相互作用，從而抑制其活性。馬瑩等[14]從螺旋藻中提取出藻膽蛋白，用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解藻膽蛋白制備ACE 抑制肽，抑制率高達94.30%。Wang 等[15]用胰蛋白酶水解米糠蛋白，進一步分離水解產物得到一種名為F2-a 的新型抗氧化，且能抑制ACE 活性的生物活性肽。Lin 等[16]發(fā)現(xiàn)魷魚皮明膠酶解產物具有顯著ACE 抑制作用，且動物實驗表明通過口服給藥有降壓作用。此外，有研究證實非多肽物質也具有ACE 抑制活性。辣木中所含有的氨基酸甲酯和酚性成分具有ACE 抑制活性，能夠降血壓[17-18]。Ben Salah 等[19]通過超聲合成了新型三唑酮和雙三唑酮，毒性低且具有良好的ACE 抑制活性。李春陽等[20]研究發(fā)現(xiàn)藍莓葉中槲皮素和金絲桃苷能顯著抑制內皮細胞的ACE 活性，具有舒張血管的作用。Wijesinghe 等[21]從海洋褐藻的乙醇提取物中分離得到5 種褐藻多酚，均具有較強的ACE 抑制活性。

本試驗通過水提、醇提和胃蛋白酶酶解日常飲食中常見的堅果、火腿腸等加工食品得到相應的提取物，分別測定提取物與不同飲料的ACE 抑制率，篩選酶解后抑制效果較好的樣品，稀釋提取液進行進一步試驗，以期為新型預防高血壓食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）試驗材料 飲料、堅果以及其它加工食品購于浙江工商大學附近的超市。

2）主要試驗試劑 胃蛋白酶（1∶3 000），國藥集團化學試劑有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、馬尿酸（HA）標準品，美國Sigma 公司；ACE 酶，實驗室自制，從豬肺中提取，酶比活力為119.2 U/g。

1.2 儀器與設備

R-210 旋轉蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司；2-16KL 高速冷凍離心機，美國Sigma 公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、UV-2600 紫外分光光度計，日本Shimadzu 公司；A65312906 冷凍干燥機，美國Labconco 公司；D18TS25 臺式均質機，艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堅果及其它加工食品提取物的制備 樣品各部位取樣，共取30 g 樣品，按料液比1∶3 的比例加入蒸餾水，勻漿處理2 min 后，取勻漿液30 mL于培養(yǎng)皿中進行冷凍干燥。稱取3 份凍干粉各50 mg，分別加入2 mL 不同的溶劑配置成25 mg/mL的凍干粉溶液，再用3 種不同處理方法進行提取，終體積定容為2 mL：1）水提：加2 mL 水，80℃加熱10 min，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后取上清液，于-80℃儲存、備用。2）酶解：加2 mL 水，用100 μL 1 mol/L HCL 溶液調節(jié)pH 值至2～3，加10 μL 50 mg/mL 胃蛋白酶，37℃反應2 h 后于100℃水浴15 min，加100 μL 1 mol/L NaOH 溶液。冷卻后，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后取上清液，于-80℃儲存、備用。3）醇提：加2 mL 無水乙醇，于80℃加熱10 min。冷卻后，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后，將上清液旋蒸除去乙醇后，加同體積10%乙醇復溶，于-80℃儲存、備用。

1.3.2 火腿腸和核桃含水量的測定 取樣品可食用部分稱量鮮重，再置于100℃烘箱中烘至恒重，得到干重，計算含水量。

1.3.3 ACE 酶活性抑制效果的測定[22]取50 μL硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.3）與50 μL 不同提取液混合（相當于1.25 mg 原料干物質），加入160 μL 于37℃下加熱10 min 后的ACE 酶液（質量濃度2 mg/mL）和40 μL 5 mmoL/L HHL 溶液，于37℃下反應15 min，加入150 μL 1 mol/L HCL 終止反應。用0.45 μm 濾膜過濾，采用HPLC 測定酶解產物中馬尿酸的含量。水提取液的對照組為超純水、乙醇提取液的對照組為10%乙醇、酶解提取液的對照組為0.25 mg/mL 的胃蛋白酶經沸水浴后處理的溶液，分別加入反應體系中，進行3 次重復試驗。

液相色譜條件：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：V甲醇∶V超純水=3∶17，超純水中含有0.1%三氟乙酸（TFA）；柱溫箱溫度：30℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：228 nm。

繪制HPLC 測定馬尿酸質量濃度的標準曲線：取質量濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/μL 的馬尿酸標準液，通過HPLC 測定馬尿酸的含量及其對應的峰面積，繪制出如圖1所示的標準曲線。曲線方程式為：y=6×107x+109179，R2=0.9999，線性關系良好。檢測范圍：0.01～0.1 μg/μL。通過對不同樣品液所測得的峰面積與標曲的對照，可得馬尿酸產量。

圖1 HPLC 測定馬尿酸質量濃度的標準曲線Fig.1 The standard curve of HA mass concentration determined by HPLC

ACE 酶活單位的定義：37℃下，每1 min 催化生成1 μmoL 馬尿酸所需要的酶量（U）。

ACE 酶活力抑制強度：1）飲料樣品：抑制強度（△U/mL）=（對照組酶活力-樣品組酶活力）/樣品體積。2）其它樣品：抑制強度（△U/g 干重）=（對照組酶活力-樣品組酶活力）/樣品干重

ACE 抑制率（%）=（對照組酶活力-樣品組酶活力）/對照組酶活力×100

1.3.4 水提醇沉法制備提取物及測定蛋白質含量

各取5 g 火腿腸和核桃的可食用部分，按料液比1∶5 的比例加入蒸餾水，勻漿處理后，于4℃，10 000 r/min 離心20 min 后，取5 mL 上清液，加等量無水乙醇，于4℃靜置過夜。4℃，10 000 r/min離心20 min 后分離上清液與沉淀，分別作2 種不同處理：1）取上清液5 mL 旋蒸完全去除乙醇，加入等量超純水溶解。2）在沉淀物中加5 mL 去離子水。取1 mL，加9 mL 蒸餾水和5 mL 考馬斯亮藍溶液混勻，避光靜置2 min，測定波長595 nm 處的吸光度，重復3 次，測定蛋白濃度[23]。另取500 μL溶液，用10 μL 1 mol/L HCL 溶液調pH 值調節(jié)至2～3，加10 μL 50 mg/mL 的胃蛋白酶，37℃反應2 h，100℃水浴15 min，加10 μL 1 mol/L 的NaOH溶液。提取物用于ACE 酶抑制率的測定，劑量為1.3.1 節(jié)中初步篩選時提取液濃度的十分之一。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 飲料對ACE 的抑制

蒙牛優(yōu)益C（原味）、娃哈哈AD 鈣奶、伊利每益添（原味）、安慕希（希臘風味酸奶原味）具有顯著的ACE 抑制作用。其中，蒙牛優(yōu)益C（原味）、娃哈哈AD 鈣奶ACE 抑制作用較強。這些都是牛奶飲料，可能是牛奶中含有抑制ACE 的多肽。其它非牛奶飲料都沒有顯著的ACE 抑制作用。

2.2 堅果對ACE 的抑制

5 種堅果水提取物沒有顯著的ACE 抑制作用，開心果反而顯著促進ACE 活性。5 種堅果的酶解產物都有顯著的ACE 抑制作用，其中核桃和油板栗抑制效果最好，碧根果和瓜子也有較好的抑制作用，開心果的酶解產物抑制作用較弱。油板栗乙醇提取物顯著促進ACE 活性，其它4 種堅果乙醇提取物對ACE 也有輕微的ACE 促進作用，但是都沒有顯著性。

表1 不同飲料對ACE 的抑制Table 1 Inhibition of ACE by different beverages

圖2 牛奶對馬尿酸產量的影響Fig.2 Effects of milk on the production of hippuric acid

表2 堅果提取液對ACE 的抑制Table 2 Inhibition of ACE by nut extracts

2.3 其它食品對ACE 的抑制

王中王火腿腸、山楂片、枸杞和桂圓水提取物有顯著的ACE 抑制作用，徐福記巧克力有顯著的ACE 促進作用?；鹜饶c酶解產物有極顯著的ACE抑制作用。枸橘、豆腐和桂圓酶解產物有顯著的ACE 抑制作用。乙醇提取物中只有枸橘有顯著的ACE 抑制作用，山楂片、桂圓和豆腐等都能顯著促進ACE 活性。

表3 其它加工食品提取液對ACE 的抑制Table 3 Inhibition of ACE by other processed foods extracts

2.4 火腿腸和核桃對ACE 的抑制

鑒于具有ACE 抑制作用的主要是酶解產物，因此選擇抑制率最高的火腿腸和核桃，進一步驗證其抑制作用效果。由表4可知，火腿腸含水量和蛋白質含量均高于核桃。提取液體稀釋10 倍后，雖然核桃對ACE 的抑制效果明顯下降了，但是還是顯著抑制ACE 的活性，而火腿腸反而促進ACE活性，但是沒有顯著性。

表4 火腿腸和核桃的含水量及提取的蛋白含量Table 4 Water content and protein content of walnut and ham sausage

表5 火腿腸和核桃的胃蛋白酶解稀釋液對ACE 的抑制Table 5 Inhibition of ACE by pepsin hydrolysate diluent of ham sausage and walnut

3 結論

在15 種飲料中，蒙牛優(yōu)益C（原味）、哇哈哈AD 鈣奶、伊利每益添（原味）等含牛奶的飲料有顯著的ACE 抑制作用，其余不含牛奶的飲料，如康師傅綠茶（蜂蜜茉莉味）、東方樹葉（茉莉花茶）等ACE 抑制效果不明顯，而康師傅茉莉蜜茶、康師傅紅茶（檸檬口味）、王老吉涼茶卻促進ACE 活性。5種堅果的酶解產物都有顯著的ACE 抑制作用，其中核桃的抑制作用最強。碧根果和開心果的水提物能促進ACE 活性，其中開心果促進作用顯著，而核桃、油板栗、瓜子的水提物的ACE 抑制作用較弱。5 種堅果的乙醇提取物均能促進ACE 活性。其它8 種加工食品中，火腿腸的水提物和胃蛋白酶水解物有顯著的ACE 抑制作用。幾乎所有食品的乙醇提取物都具有促進ACE 的活性。核桃的胃蛋白酶的酶解物在13 種固體加工食品中，ACE 抑制活性最強。