王柯諾，從俊峰，顧 雙，王向陽

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

隨著居民生活水平的不斷提高，人們?cè)絹碓蕉嗟厥秤酶吣芰康氖称?，加之缺乏鍛煉，高血壓患者越來越多。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是人體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓升高的系統(tǒng)，該系統(tǒng)中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）將血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）水解轉(zhuǎn)化成一種致使血壓升高的血管收縮劑——血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），同時(shí)使激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）中的降血壓物質(zhì)緩激肽（BK）失活，抑制降壓系統(tǒng)，促進(jìn)升壓系統(tǒng)，致使血壓升高[1]。適當(dāng)抑制ACE活性，可能有利于緩解高血壓。日常飲食中飲料和堅(jiān)果等一些加工食品的食用量較大，然而其對(duì)ACE 的活性的影響尚不清楚。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）作為目前五大類常用的降壓藥物之一，不僅能降血壓，還能治療心力衰竭、慢性腎功能衰竭等一些高血壓，并發(fā)癥[2]，然而長(zhǎng)期食用此類化學(xué)合成的ACEI，常伴隨干咳、水腫、腎功能損傷、高血鉀等不良反應(yīng)，心血管、呼吸、皮膚等多個(gè)系統(tǒng)都受到不同程度的影響，更有患者因此停止用藥[3-6]。鑒于此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始尋找安全有效的降壓藥。食源性ACE 抑制肽逐漸進(jìn)入人們的視野中?，F(xiàn)階段食源性ACE 抑制肽的研究對(duì)象多以食用蛋白質(zhì)或者食品加工后廢棄的下腳料為主，包括乳蛋白和動(dòng)、植物蛋白[7]，如牛羊乳、鮰魚皮、蝦仁加工副產(chǎn)物、茶渣[8]、米糠[9]、扇貝裙邊[10]、利馬豆[11]、魚鱗蛋白[12]等。于志鵬等[13]研究獲得雞蛋蛋白中的FQK、WGK 和ADW三肽，它們能與ACE 的活性口袋S1 和S2 形成氫鍵相互作用，從而抑制其活性。馬瑩等[14]從螺旋藻中提取出藻膽蛋白，用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解藻膽蛋白制備ACE 抑制肽，抑制率高達(dá)94.30%。Wang 等[15]用胰蛋白酶水解米糠蛋白，進(jìn)一步分離水解產(chǎn)物得到一種名為F2-a 的新型抗氧化，且能抑制ACE 活性的生物活性肽。Lin 等[16]發(fā)現(xiàn)魷魚皮明膠酶解產(chǎn)物具有顯著ACE 抑制作用，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過口服給藥有降壓作用。此外，有研究證實(shí)非多肽物質(zhì)也具有ACE 抑制活性。辣木中所含有的氨基酸甲酯和酚性成分具有ACE 抑制活性，能夠降血壓[17-18]。Ben Salah 等[19]通過超聲合成了新型三唑酮和雙三唑酮，毒性低且具有良好的ACE 抑制活性。李春陽等[20]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中槲皮素和金絲桃苷能顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的ACE 活性，具有舒張血管的作用。Wijesinghe 等[21]從海洋褐藻的乙醇提取物中分離得到5 種褐藻多酚，均具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性。

本試驗(yàn)通過水提、醇提和胃蛋白酶酶解日常飲食中常見的堅(jiān)果、火腿腸等加工食品得到相應(yīng)的提取物，分別測(cè)定提取物與不同飲料的ACE 抑制率，篩選酶解后抑制效果較好的樣品，稀釋提取液進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，以期為新型預(yù)防高血壓食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1）試驗(yàn)材料 飲料、堅(jiān)果以及其它加工食品購于浙江工商大學(xué)附近的超市。

2）主要試驗(yàn)試劑 胃蛋白酶（1∶3 000），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、馬尿酸（HA）標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司；ACE 酶，實(shí)驗(yàn)室自制，從豬肺中提取，酶比活力為119.2 U/g。

1.2 儀器與設(shè)備

R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司；2-16KL 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、UV-2600 紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu 公司；A65312906 冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；D18TS25 臺(tái)式均質(zhì)機(jī)，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堅(jiān)果及其它加工食品提取物的制備 樣品各部位取樣，共取30 g 樣品，按料液比1∶3 的比例加入蒸餾水，勻漿處理2 min 后，取勻漿液30 mL于培養(yǎng)皿中進(jìn)行冷凍干燥。稱取3 份凍干粉各50 mg，分別加入2 mL 不同的溶劑配置成25 mg/mL的凍干粉溶液，再用3 種不同處理方法進(jìn)行提取，終體積定容為2 mL：1）水提：加2 mL 水，80℃加熱10 min，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后取上清液，于-80℃儲(chǔ)存、備用。2）酶解：加2 mL 水，用100 μL 1 mol/L HCL 溶液調(diào)節(jié)pH 值至2～3，加10 μL 50 mg/mL 胃蛋白酶，37℃反應(yīng)2 h 后于100℃水浴15 min，加100 μL 1 mol/L NaOH 溶液。冷卻后，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后取上清液，于-80℃儲(chǔ)存、備用。3）醇提：加2 mL 無水乙醇，于80℃加熱10 min。冷卻后，于15℃，6 000 r/min 離心20 min 后，將上清液旋蒸除去乙醇后，加同體積10%乙醇復(fù)溶，于-80℃儲(chǔ)存、備用。

1.3.2 火腿腸和核桃含水量的測(cè)定 取樣品可食用部分稱量鮮重，再置于100℃烘箱中烘至恒重，得到干重，計(jì)算含水量。

1.3.3 ACE 酶活性抑制效果的測(cè)定[22]取50 μL硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.3）與50 μL 不同提取液混合（相當(dāng)于1.25 mg 原料干物質(zhì)），加入160 μL 于37℃下加熱10 min 后的ACE 酶液（質(zhì)量濃度2 mg/mL）和40 μL 5 mmoL/L HHL 溶液，于37℃下反應(yīng)15 min，加入150 μL 1 mol/L HCL 終止反應(yīng)。用0.45 μm 濾膜過濾，采用HPLC 測(cè)定酶解產(chǎn)物中馬尿酸的含量。水提取液的對(duì)照組為超純水、乙醇提取液的對(duì)照組為10%乙醇、酶解提取液的對(duì)照組為0.25 mg/mL 的胃蛋白酶經(jīng)沸水浴后處理的溶液，分別加入反應(yīng)體系中，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)。

液相色譜條件：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V甲醇∶V超純水=3∶17，超純水中含有0.1%三氟乙酸（TFA）；柱溫箱溫度：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。

繪制HPLC 測(cè)定馬尿酸質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：取質(zhì)量濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/μL 的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，通過HPLC 測(cè)定馬尿酸的含量及其對(duì)應(yīng)的峰面積，繪制出如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程式為：y=6×107x+109179，R2=0.9999，線性關(guān)系良好。檢測(cè)范圍：0.01～0.1 μg/μL。通過對(duì)不同樣品液所測(cè)得的峰面積與標(biāo)曲的對(duì)照，可得馬尿酸產(chǎn)量。

圖1 HPLC 測(cè)定馬尿酸質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of HA mass concentration determined by HPLC

ACE 酶活單位的定義：37℃下，每1 min 催化生成1 μmoL 馬尿酸所需要的酶量（U）。

ACE 酶活力抑制強(qiáng)度：1）飲料樣品：抑制強(qiáng)度（△U/mL）=（對(duì)照組酶活力-樣品組酶活力）/樣品體積。2）其它樣品：抑制強(qiáng)度（△U/g 干重）=（對(duì)照組酶活力-樣品組酶活力）/樣品干重

ACE 抑制率（%）=（對(duì)照組酶活力-樣品組酶活力）/對(duì)照組酶活力×100

1.3.4 水提醇沉法制備提取物及測(cè)定蛋白質(zhì)含量

各取5 g 火腿腸和核桃的可食用部分，按料液比1∶5 的比例加入蒸餾水，勻漿處理后，于4℃，10 000 r/min 離心20 min 后，取5 mL 上清液，加等量無水乙醇，于4℃靜置過夜。4℃，10 000 r/min離心20 min 后分離上清液與沉淀，分別作2 種不同處理：1）取上清液5 mL 旋蒸完全去除乙醇，加入等量超純水溶解。2）在沉淀物中加5 mL 去離子水。取1 mL，加9 mL 蒸餾水和5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液混勻，避光靜置2 min，測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度，重復(fù)3 次，測(cè)定蛋白濃度[23]。另取500 μL溶液，用10 μL 1 mol/L HCL 溶液調(diào)pH 值調(diào)節(jié)至2～3，加10 μL 50 mg/mL 的胃蛋白酶，37℃反應(yīng)2 h，100℃水浴15 min，加10 μL 1 mol/L 的NaOH溶液。提取物用于ACE 酶抑制率的測(cè)定，劑量為1.3.1 節(jié)中初步篩選時(shí)提取液濃度的十分之一。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 飲料對(duì)ACE 的抑制

蒙牛優(yōu)益C（原味）、娃哈哈AD 鈣奶、伊利每益添（原味）、安慕希（希臘風(fēng)味酸奶原味）具有顯著的ACE 抑制作用。其中，蒙牛優(yōu)益C（原味）、娃哈哈AD 鈣奶ACE 抑制作用較強(qiáng)。這些都是牛奶飲料，可能是牛奶中含有抑制ACE 的多肽。其它非牛奶飲料都沒有顯著的ACE 抑制作用。

2.2 堅(jiān)果對(duì)ACE 的抑制

5 種堅(jiān)果水提取物沒有顯著的ACE 抑制作用，開心果反而顯著促進(jìn)ACE 活性。5 種堅(jiān)果的酶解產(chǎn)物都有顯著的ACE 抑制作用，其中核桃和油板栗抑制效果最好，碧根果和瓜子也有較好的抑制作用，開心果的酶解產(chǎn)物抑制作用較弱。油板栗乙醇提取物顯著促進(jìn)ACE 活性，其它4 種堅(jiān)果乙醇提取物對(duì)ACE 也有輕微的ACE 促進(jìn)作用，但是都沒有顯著性。

表1 不同飲料對(duì)ACE 的抑制Table 1 Inhibition of ACE by different beverages

圖2 牛奶對(duì)馬尿酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of milk on the production of hippuric acid

表2 堅(jiān)果提取液對(duì)ACE 的抑制Table 2 Inhibition of ACE by nut extracts

2.3 其它食品對(duì)ACE 的抑制

王中王火腿腸、山楂片、枸杞和桂圓水提取物有顯著的ACE 抑制作用，徐福記巧克力有顯著的ACE 促進(jìn)作用?；鹜饶c酶解產(chǎn)物有極顯著的ACE抑制作用。枸橘、豆腐和桂圓酶解產(chǎn)物有顯著的ACE 抑制作用。乙醇提取物中只有枸橘有顯著的ACE 抑制作用，山楂片、桂圓和豆腐等都能顯著促進(jìn)ACE 活性。

表3 其它加工食品提取液對(duì)ACE 的抑制Table 3 Inhibition of ACE by other processed foods extracts

2.4 火腿腸和核桃對(duì)ACE 的抑制

鑒于具有ACE 抑制作用的主要是酶解產(chǎn)物，因此選擇抑制率最高的火腿腸和核桃，進(jìn)一步驗(yàn)證其抑制作用效果。由表4可知，火腿腸含水量和蛋白質(zhì)含量均高于核桃。提取液體稀釋10 倍后，雖然核桃對(duì)ACE 的抑制效果明顯下降了，但是還是顯著抑制ACE 的活性，而火腿腸反而促進(jìn)ACE活性，但是沒有顯著性。

表4 火腿腸和核桃的含水量及提取的蛋白含量Table 4 Water content and protein content of walnut and ham sausage

表5 火腿腸和核桃的胃蛋白酶解稀釋液對(duì)ACE 的抑制Table 5 Inhibition of ACE by pepsin hydrolysate diluent of ham sausage and walnut

3 結(jié)論

在15 種飲料中，蒙牛優(yōu)益C（原味）、哇哈哈AD 鈣奶、伊利每益添（原味）等含牛奶的飲料有顯著的ACE 抑制作用，其余不含牛奶的飲料，如康師傅綠茶（蜂蜜茉莉味）、東方樹葉（茉莉花茶）等ACE 抑制效果不明顯，而康師傅茉莉蜜茶、康師傅紅茶（檸檬口味）、王老吉涼茶卻促進(jìn)ACE 活性。5種堅(jiān)果的酶解產(chǎn)物都有顯著的ACE 抑制作用，其中核桃的抑制作用最強(qiáng)。碧根果和開心果的水提物能促進(jìn)ACE 活性，其中開心果促進(jìn)作用顯著，而核桃、油板栗、瓜子的水提物的ACE 抑制作用較弱。5 種堅(jiān)果的乙醇提取物均能促進(jìn)ACE 活性。其它8 種加工食品中，火腿腸的水提物和胃蛋白酶水解物有顯著的ACE 抑制作用。幾乎所有食品的乙醇提取物都具有促進(jìn)ACE 的活性。核桃的胃蛋白酶的酶解物在13 種固體加工食品中，ACE 抑制活性最強(qiáng)。