婁行行，魏天予，蘆紅云，陳啟和

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 杭州310058）

阿魏酸酯酶（Ferulic acid esterases，F(xiàn)AEs）是一種能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，使阿魏酸游離出來的羧酸酯酶[1]，在食品和飼料等工業(yè)中有著光明的前景。食品工業(yè)利用阿魏酸酯酶降解植物細(xì)胞壁中阿魏酸酯鍵，得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸。通過阿魏酸酯酶的處理，飼料工業(yè)中植物性原材料的細(xì)胞壁變的疏松，更容易被禽畜消化利用。研究表明，真菌和細(xì)菌都能分泌阿魏酸酯酶[2-3]，然而目前研究較多的是真菌中的黑曲霉。

黑曲霉在工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，如在檸檬酸生產(chǎn)以及各種高價(jià)值酶產(chǎn)品包括果膠酶、蛋白酶、淀粉葡糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶和脂肪酶[4-5]等的生產(chǎn)。雖然曲霉菌是一種重要的工業(yè)微生物，但這些絲狀微生物中有一個(gè)難以控制的特性就是它復(fù)雜的形態(tài)，它們不僅有致密的小球還有黏性的菌絲[6]。由于以分散菌絲形態(tài)存在的真菌可以帶來更高的產(chǎn)品收益率，因此其價(jià)值一般優(yōu)于菌絲形成小球形態(tài)的真菌[7-8]。合適的菌株形態(tài)對發(fā)酵的重大作用促使研究者嘗試改變真菌的生長特性，相關(guān)研究包括一些培養(yǎng)參數(shù)的改變，如接種量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基配料以及酸堿度[9-12]。已有研究通過對具有合適形態(tài)突變體的隨機(jī)篩選得到了較理想的菌團(tuán)形態(tài)，并改善了半纖維素酶的產(chǎn)量[13]。因而，改善真菌形態(tài)已經(jīng)成為生物技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。最近發(fā)現(xiàn)通過向培養(yǎng)基中添加滑石粉和氧化鋁可以控制真菌的形態(tài)，其對黑曲霉和其它絲狀微生物的形態(tài)發(fā)展具有強(qiáng)烈的影響[14]。本文通過向黑曲霉ZJUQH 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的滑石粉、氧化鋁和高嶺土，探究添加微顆粒對黑曲霉菌絲生長和產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基配方

1）菌株 黑曲霉ZJUQH，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2）斜面培養(yǎng)基 20%馬鈴薯煮出液，1%葡萄糖。

3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 22.6%豆粕浸出液、1.035%蛋白胨、0.3% KH2PO4、0.8%Na2HPO4·7H2O、0.01%NaC1、0.02% MgSO4·7H2O、0.005% CaC12，自然pH 值。

1.2 主要材料與試劑

滑石粉顆粒（800 目），上海麥克林生化科技有限公司；三氧化二鋁顆粒（200～300 目）、高嶺土顆粒（300 目），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；馬鈴薯，購于超市；豆粕、蛋白胨，生工生物工程股份有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·7H2O、NaC1、MgSO4·7H2O、CaC12，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿魏酸甲酯，南通飛宇生物科技有限公司；二甲基甲酰胺、色譜純級乙腈、甲酸、甲醇，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

LC-2010AHT 高效液相色譜儀，日本島津公司；Beckman 冷凍高速離心機(jī)，美國Beckman 公司；L500 臺式低速大容量離心機(jī)，湖南湘儀有限公司；DCQF-1 超聲復(fù)頻清洗器，上海東大超聲儀器有限公司；HYG-Ⅱa 恒溫調(diào)速搖床，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；Stemi 2000-C 立體顯微鏡，德國ZEISS 公司；XL-30 ESEM 掃描電鏡，荷蘭Philips 公司；Hitachi S-3000N 掃描電鏡，日本Hitachi 公司；Mastersizer 2000 激光粒度儀，英國Malvern Instruments 公司。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)及酶液制備

將微顆粒的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0.1，0.5，1，5，10，20 g/L，即在30 mL 的培養(yǎng)基中分別加入0.003，0.015，0.03，0.15，0.3，0.6，3 g 的微顆粒。微顆粒與液體培養(yǎng)基分開滅菌，備用。

菌株接種到配好的PDA 培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d 后制成孢子懸浮液，按一定接種量（孢子數(shù)約107CFU/mL）接種于裝有30 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，置于28℃，180 r/min 的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)7 d，分別于3，5，7 d 取樣。將菌懸液置于低速離心機(jī)中3 000 r/min 離心30 min，取上清液即為粗酶液于4℃冰箱中保存，待用。

1.5 酶活測定

1.5.1 阿魏酸酯酶酶活測定 用一級色譜純甲醇溶解阿魏酸甲酯配制成50 mmol/L 的阿魏酸甲酯溶液，再用檸檬酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.0）稀釋10 倍。取2 mL 稀釋后的阿魏酸甲酯溶液重新加熱至40℃，加入1 mL 稀釋10 倍的粗酶液，混勻?；旌衔镉?0℃反應(yīng)30 min 后加熱至100℃，10 min 后終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物于室溫冷卻，以蒸餾水代替底物溶液體系為空白對照[15]。

酶解反應(yīng)后的阿魏酸產(chǎn)物參考文獻(xiàn)[16-17]的HPLC 法定量分析，并稍作修改。高效液相色譜條件：流動相為乙腈-0.5%甲酸混合液（V乙腈∶V0.5%甲酸=30∶70），C18 反相柱（250 mm×4.6 mm，4 μm），檢測溫度30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長317 nm。阿魏酸酯酶的酶活定義為在40℃，pH 6.0 條件下，每分鐘水解底物阿魏酸甲酯產(chǎn)生1 μmol 阿魏酸所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.5.2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)制品配成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋成100，50，10，8，4，2，1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5.1 節(jié)中的色譜條件進(jìn)行HPLC 測定，記錄峰面積，以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

采用Bradford[18]的蛋白質(zhì)定量試劑盒法檢測發(fā)酵上清液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。取考馬斯亮藍(lán)染液平衡至室溫混勻，預(yù)熱分光光度計(jì)。將0，1，2，3，4，5，6 μL 牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）分別加入酶標(biāo)板，加PBS 補(bǔ)足到10 μL；加Bradford 考馬斯亮藍(lán)染液190 μL 后混勻，室溫放置5～10 min，酶標(biāo)儀測定波長595 nm 處的吸光度值，以不含BSA 的樣品吸光度值作為空白對照，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣品測定中，取10 μL 發(fā)酵液樣品和190 μL 考馬斯亮藍(lán)染液混勻，室溫放置5～10 min，酶標(biāo)儀測定波長595 nm 處的吸光度值。隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，用于阿魏酸酯酶比活力的計(jì)算。

1.7 生物量的測定

將各菌株的發(fā)酵液置于離心杯中，于3 000 r/min 離心30 min，收集菌絲沉淀，用與發(fā)酵液體積相等的蒸餾水洗滌并離心，重復(fù)3 次，最后將所得菌絲體于60℃烘干至恒重，對應(yīng)減去微顆粒的質(zhì)量，即得生物量。

1.8 顯微鏡觀察及粒度分布

1）菌體微觀形態(tài)觀察 用立體顯微鏡觀察菌團(tuán)，然后通過預(yù)處理，用XL-30 ESEM 掃描電鏡對菌團(tuán)進(jìn)行更細(xì)致的觀察。

2）菌體粒度分析 用Hitachi S-3000N 掃描電鏡在20 kV 下觀察微顆粒，然后用Mastersizer 2000 激光粒度儀測定樣品的粒度分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 微顆粒對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的作用

從圖1中可以看出，與對照組相比，添加微顆粒對阿魏酸酯酶的酶活產(chǎn)生一定的影響。這種影響與微顆粒的種類、添加微顆粒的質(zhì)量濃度以及發(fā)酵時(shí)間都有關(guān)。由圖1a 和1b 可知，發(fā)酵第3天，添加微顆粒組的阿魏酸酯酶的酶活均高于對照組；發(fā)酵第5 天，當(dāng)滑石粉和氧化鋁質(zhì)量濃度的增大到一定程度時(shí)（滑石粉>5 g/L，氧化鋁>1 g/L），阿魏酸酯酶的酶活受到抑制；發(fā)酵第7 天，高質(zhì)量濃度的滑石粉和氧化鋁對阿魏酸酯酶活性的抑制情況有所改善。由圖1c 可以看出，高嶺土的添加會提高黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活。綜上，添加高嶺土對黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳。整體來看，3 種微顆粒均是在發(fā)酵第5 天、質(zhì)量濃度為0.5 g/L 時(shí)，阿魏酸酯酶酶活最高。

圖1 添加滑石粉、氧化鋁和高嶺土對黑曲霉ZJUQH 產(chǎn)阿魏酸酯酶比酶活的影響Fig.1 Effects of talc，alumina and kaolin on FAEs specific activity produced by Aspergillus niger ZJUQH

2.2 微顆粒對液體深層發(fā)酵中黑曲霉生物量、菌團(tuán)大小以及形態(tài)的影響

為揭示添加氧化鋁、滑石粉和高嶺土對液體深層發(fā)酵中黑曲霉生長的影響，比較了發(fā)酵第5天時(shí)的黑曲霉生物量。從圖2可以看出，高嶺土對菌絲生長具有負(fù)面作用，而高嶺土對黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最佳（圖1），表明細(xì)胞的積累可能與阿魏酸酯酶酶活的提高無關(guān)。0.5 g/L 滑石粉有利于菌絲生長，然而隨著培養(yǎng)基中滑石粉質(zhì)量濃度的增加，菌絲生長減慢，表明少量添加滑石粉可以促進(jìn)菌絲生長，過量添加滑石粉會抑制菌絲生長。

由圖3可知，添加微顆粒后菌團(tuán)直徑均小于對照組（2.2 mm），并且添加微顆粒的質(zhì)量濃度越大，菌團(tuán)直徑越小。除改變菌團(tuán)大小外，添加微顆粒還會改變真菌菌絲的結(jié)構(gòu)。由圖4可以看出，與對照組相比，添加微顆粒后菌絲體比較松散，菌絲不完整。其中，添加0.5 g/L 高嶺土對菌絲體表面結(jié)構(gòu)的影響最大。微顆粒影響真菌菌絲形態(tài)可能有2 個(gè)方面的原因：一是懸浮的微顆粒在菌團(tuán)開始形成時(shí)阻止了菌絲的聚集，二是菌團(tuán)形成后搖瓶培養(yǎng)使微顆粒與菌團(tuán)之間相互碰撞、剪切造成菌團(tuán)被破壞[19]。整體來看，3 種顆粒中，高嶺土對菌團(tuán)大小和菌絲結(jié)構(gòu)的影響最大，這可能與高嶺土的結(jié)構(gòu)有關(guān)。由圖5可以看出氧化鋁顆粒一般是圓形的，高嶺土顆粒一般呈尖銳的不規(guī)則形狀，而滑石粉顆粒的形狀則介于兩者之間。相比于光滑的、規(guī)則的氧化鋁顆粒，尖銳的不規(guī)則形狀的高嶺土顆粒對菌絲聚集產(chǎn)生的破壞作用更大。

3 討論

絲狀真菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。在深層培養(yǎng)過程中，它們表現(xiàn)出與產(chǎn)量相關(guān)的復(fù)雜的形態(tài)學(xué)周期（從稠密的球形顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒌木z），這對培養(yǎng)過程優(yōu)化非常有利[20]。碳源的類型和濃度以及氮源、磷酸鹽、微量元素，溶解氧和二氧化碳、pH 值和溫度等因素都影響著真菌的形態(tài)；另外培養(yǎng)容器或者生物反應(yīng)器的幾何學(xué)、攪拌系統(tǒng)、流變學(xué)以及培養(yǎng)基的類型都調(diào)節(jié)著培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶會受到3 種微顆粒的影響，添加微顆粒的不同對酶活的影響也不同，其中高嶺土對黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果最為顯著。在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)間和適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度下，氧化鋁和滑石粉也有利于提高黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活。然而，添加微顆粒對真菌菌絲的生長產(chǎn)生了負(fù)面影響。微顆粒對真菌細(xì)胞積累的影響與對酶活的影響產(chǎn)生了相反的效果，說明了黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高不是單純的黑曲霉細(xì)胞積累的作用。先前的研究也顯示了微顆粒似乎能提高酶的活力、增加酶的產(chǎn)量，卻使生物量不變或減少[14]。這些都表明微顆粒對真菌細(xì)胞的作用不是一般的代謝調(diào)控刺激，而是真菌細(xì)胞在微顆粒存在下發(fā)生了一系列細(xì)胞生理學(xué)方面的復(fù)雜變化[10，22]。

圖2 添加滑石粉、氧化鋁和高嶺土對黑曲霉ZJUQH 生物量的影響Fig.2 Effects of talc，alumina and kaolin on biomass of Aspergillus niger ZJUQH

圖3 添加滑石粉、氧化鋁和高嶺土對黑曲霉ZJUQH 菌團(tuán)大小的影響Fig.3 Effects of talc，alumina and kaolin on average pellet diameter of A.niger ZJUQH

圖4 添加微顆粒培養(yǎng)120 h 后的黑曲霉ZJUQH 電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM examination of A.niger ZJUQH after adding microparticles for 120 h

圖5 滑石粉、氧化鋁和高嶺土微顆粒電鏡結(jié)果（300×）Fig.5 SEM images of talc，alumina and kaolin（300×）

絲狀真菌的特殊形態(tài)使它特別容易形成菌團(tuán)，菌團(tuán)逐漸變大會導(dǎo)致細(xì)胞生長過程中氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)不足[6，8，23]。添加微顆粒后，菌團(tuán)的平均粒徑顯著減小，氧氣的傳遞就更加充分，有利于特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，這可能是添加微顆粒后黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活提高的原因。在3 種微顆粒中，高嶺土對菌團(tuán)平均粒徑的影響最為顯著，并且高嶺土對黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高效果也最為顯著，因此黑曲霉菌團(tuán)大小與黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶活大小可能存在一定關(guān)系。本研究選用了3 種顆粒大小和形態(tài)不同的微顆粒進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)它們對黑曲霉菌絲形態(tài)的影響存在差異，因此可以通過改變微顆粒的大小和濃度精確地調(diào)整絲狀微生物的形態(tài)[14]。微顆粒的微觀研究進(jìn)一步證實(shí)微顆粒對菌絲的影響主要是通過調(diào)節(jié)菌絲形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的。有研究已經(jīng)證明，向培養(yǎng)基中添加滑石粉和氧化鋁強(qiáng)烈地影響了黑曲霉和其它絲狀微生物的形態(tài)[14，24-25]。絲狀微生物形態(tài)的改變對其產(chǎn)代謝物也有一定的影響。在搖瓶發(fā)酵的黑曲霉小菌落中，不同部位基因表達(dá)水平是不一樣的，mRNA 的積累也存在著差異[26-27]。小菌落的外圍的每個(gè)菌絲中RNA 的含量大約是中心的45倍[26]，這種差異對代謝酶的合成也有一定的影響。故微顆粒也可能通過改變黑曲霉的菌絲形態(tài)影響合成阿魏酸酯酶基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究探究3 種微顆粒在黑曲霉深層發(fā)酵過程中對絲狀真菌細(xì)胞形態(tài)和菌株產(chǎn)酶酶活的影響。研究發(fā)現(xiàn)，表面尖銳并呈不規(guī)則狀的高嶺土顆粒對黑曲霉菌絲形態(tài)的影響最大，同時(shí)對黑曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活的提高也最大，說明真菌產(chǎn)酶的酶活大小可能受到絲狀真菌形態(tài)的影響。因此，無論在研究還是工業(yè)應(yīng)用上，若要增大菌株產(chǎn)酶的活力或者產(chǎn)量，可以通過添加微顆?？刂凭z形態(tài)來實(shí)現(xiàn)。這種添加微顆粒改變菌絲形態(tài)的方法為更好地探究絲狀真菌代謝能力提供了一條有效途徑。