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        新型殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子研究

        2021-06-07 08:23:46姜竹茂畢浩然賈愛榮張綿松史亞萍劉昌衡
        中國食品學(xué)報 2021年5期
        關(guān)鍵詞:巖藻腸液胃液

        劉 雪,姜竹茂,畢浩然,,賈愛榮,劉 新,張綿松,史亞萍,劉昌衡*

        (1 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省科學(xué)院生物研究所 濟(jì)南250103 2 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東煙臺264005)

        口服藥物給藥方式簡單,不損傷皮膚和黏膜,無交叉感染,是目前藥物療法最常用的給藥途徑[1-2]。然而,藥物在胃、腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性極大地限制了藥物的利用率[1]。許多藥物仍需以注射的方式給藥[3]。如何提高藥物的口服利用率,構(gòu)建口服藥物載體,仍是現(xiàn)階段亟待解決的問題[4]。近年來提出的納米載藥體系主要是利用具有一定特性的納米載體,將藥物包裹入內(nèi),提高其穩(wěn)定性和利用率,現(xiàn)已成為國內(nèi)外藥劑學(xué)研究的熱點[5]。為了防止藥物進(jìn)入腸道之前在胃中分解,納米口服藥物載體的構(gòu)建需要考慮胃、腸道pH 值的變化,使用對pH 值敏感的載體系統(tǒng)[1]。殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米載體系統(tǒng)是常用的活性物質(zhì)運(yùn)載體系。殼聚糖是一種天然陽離子多糖,具有良好的安全性、生物相容性、pH 值敏感性,可以通過增強(qiáng)細(xì)胞旁路的藥物轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)藥物的吸收利用,這使其在口服藥物領(lǐng)域具有一定優(yōu)勢[6-8]。巖藻聚糖硫酸酯是褐藻和海洋無脊椎動物中常見的硫酸化多糖,含有大量的硫酸基團(tuán),可與帶正電的殼聚糖通過聚電解質(zhì)自組裝的方式形成納米粒子[4]。巖藻聚糖硫酸酯自身具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種活性,進(jìn)入體內(nèi)后不僅很少引起副反應(yīng),而且還可以輔助所運(yùn)載的活性物質(zhì)發(fā)揮作用,是一種良好的載藥納米粒子構(gòu)建材料[9]。據(jù)報道,殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子已作為多種生物活性物質(zhì)的運(yùn)載體,如生長因子、抗腫瘤藥物等[10]。Pinheiro 等[11]采用自組裝法制備殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子,用其運(yùn)載生物活性物質(zhì);Huang 等[12]將封裝有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子應(yīng)用于神經(jīng)組織工程;Huang 等[13]將制備的殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子用于抗腫瘤藥物姜黃素的運(yùn)載,增加了姜黃素的生物利用度。目前,納米粒子的制備多采用商品化的海帶、墨角藻等來源的巖藻聚糖硫酸酯,對于其它褐藻來源的巖藻聚糖硫酸酯的研究較少[9,14]。本文從常見、易得的大型海藻羊棲菜中提取得到巖藻聚糖硫酸酯,制備新型殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子,測定不同巖藻聚糖硫酸酯/殼聚糖比例的納米粒子在人工胃、腸液中的穩(wěn)定性,尋找適用于運(yùn)載口服藥物的新型殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        羊棲菜購于浙江溫州海虎海藻養(yǎng)殖有限公司。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(重均分子質(zhì)量分別為21.1,47.1,107,200,344,708 ku),美國Flu-ka 公司;10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白,美國Sigma 公司;乙腈(色譜純級),美國Tedia 公司;殼聚糖(脫乙酰度80%~95%),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

        Agilent 1260 高效液相色譜儀、Aglient Elipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),美國Agilent公司;Shodex ohpak SB-804HQ 高效凝膠滲透色譜柱,日本Shodex 公司;Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀,瑞士Tecan 公司;800Y 高速多功能粉碎機(jī),永康市鉑歐五金制品有限公司;超聲波破碎儀,德國Bandelin 公司;Brookhaven 粒度儀,美國布魯克海文儀器公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯的提取 羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯的提取參照Silchenko 等[15]和劉雪等[16]的方法。將新鮮羊棲菜洗凈,40℃干燥72 h,粉碎。取適量藻體粉末,95%乙醇脫脂(料液比1∶30),室溫攪拌24 h。脫脂后進(jìn)行提取,提取條件:2% CaCl2溶液,料液比1∶30,60℃提取3 h。提取完畢后,冷卻離心,收集上清液,超濾濃縮,截留分子質(zhì)量100 ku。液體濃縮至原體積的1/10,加入4倍體積95%乙醇,醇沉,沉淀經(jīng)無水乙醇脫水、烘干后得到羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯,命名為SFP。

        1.2.2 分子質(zhì)量測定 多糖分子質(zhì)量的測定采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC 法)[17]。色譜條件:Shodex ohpak SB-804HQ 分析柱(7.6 mm×300 mm);流動相為0.1 mol/L Na2SO4;流速0.5 mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量20 μL;檢測器采用示差折光檢測器。以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo),保留時間為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品的分子質(zhì)量。

        1.2.3 單糖組成分析采用PMP 柱前衍生高效

        液相色譜法測定SFP 的單糖組成[18]。多糖完全酸水解:準(zhǔn)確稱取2 mg 樣品,加入1 mL 三氟乙酸(2 mol/L),110℃降解6 h,去除多余三氟乙酸,得到完全酸水解的樣品。多糖PMP 衍生:多糖降解產(chǎn)物及單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 μL 蒸餾水中,隨即加入100 μL NaOH 溶液(0.3 mol/L)及120 μL PMP 甲醇溶液(0.5 mol/L),70℃水浴反應(yīng)100 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL HCl 溶液(0.3 mol/L)中和,二氯甲烷萃取3 次,上層液體經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾后備用。色譜條件:Agilent Eclipse XDBC18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為CH3CN:PBS(磷酸鹽緩沖液,pH 6.7)=17∶83(體積比);進(jìn)樣量10 μL;柱溫35℃;紫外檢測器檢測波長254 nm;流速1.0 mL/min。

        1.2.4 理化性質(zhì)分析SFP 的總糖含量[19]、蛋白質(zhì)含量[20]、硫酸基含量[21]、糖醛酸含量[22]分別按照相應(yīng)的文獻(xiàn)進(jìn)行測定。

        1.2.5 殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子(Cs-Fuc NPs)的制備 配制1 mg/mL 的殼聚糖(Cs)溶液(0.2%醋酸溶液溶解)和巖藻聚糖硫酸酯(Fuc)溶液(蒸餾水溶解)。采用聚電解質(zhì)自組裝方法制備納米粒子,按照不同的Fuc/Cs 體積比(0.6∶1,0.8∶1,1∶1,1.2∶1,1.4∶1)將殼聚糖溶液滴入巖藻聚糖硫酸酯溶液中,同時使用超聲波破碎儀(每開啟15 s,暫停10 s,共40 s)混合,得到納米粒懸浮液[1]。

        1.2.6 Cs-Fuc NPs 的理化性質(zhì) 采用Brookhaven粒度儀測定納米粒子的粒徑、Zeta 電位和多分散系數(shù)(PDI)。巖藻聚糖硫酸酯復(fù)合率(Fuc 復(fù)合率):參考文獻(xiàn)[23]的方法,納米粒子溶液經(jīng)14 000 r/min 離心15 min 后取上層清液0.5 mL,加入0.5 mL 蒸餾水,混勻。繼續(xù)加入0.5 mL 亞甲基藍(lán)溶液(0.4 mmol/L),混勻,放置5 min,于波長560 nm 處測定吸光度。

        式中,F(xiàn)uc0——納米粒子溶液中巖藻聚糖硫酸酯的總量,mg;Fuc上清——離心后上清液中巖藻聚糖硫酸酯的總量,mg。

        1.2.7 Cs-Fuc NPs 的體外模擬消化穩(wěn)定性研究

        1.2.7.1 體外消化液配制 模擬過程中使用的人工胃液和人工腸液按照王忠元等[24]的方法配制。

        1)模擬胃液的配制 按照《中國藥典》2015年版第4 部,取稀鹽酸16.4 mL,添加約800 mL 水與10 g 胃蛋白酶,搖勻使其充分溶解后,調(diào)節(jié)pH值至1.3,加水稀釋定容至1 000 mL,即為人工胃液。

        2)模擬腸液的配制 按照《中國藥典》2015年版第4 部,取磷酸二氫鉀6.8 g,加500 mL 水使其溶解,用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8;另外稱取10 g 胰蛋白酶加適量水溶解,將兩液混合后,加水定容至1 000 mL,即為人工腸液。

        1.2.7.2 體外模擬消化 取制備好的納米乳液15 mL 于50 mL 滅菌離心管,加入模擬胃液15 mL(37℃預(yù)熱),置于恒溫振蕩器(37℃)中,分別在0,1,2,4,6 h 取出3 mL 反應(yīng)液,在100℃水浴中滅酶,4 000 r/min 離心10 min,取離心后溶液2 mL 測定上清液中納米微粒的粒徑、Zeta 電位、PDI等指標(biāo)。剩余溶液經(jīng)14 000 r/min 離心15 min 后,取上清液測定Fuc 復(fù)合率。上步反應(yīng)全部結(jié)束后,取剩余樣液,用0.1 mol/L 碳酸鈉調(diào)節(jié)pH 值至6.8。向管中繼續(xù)加入腸液15 mL(37℃預(yù)熱),置于恒溫振蕩器(37℃)中,分別在0,1,2,4,6 h 取出3 mL,在100℃水浴中滅酶,4 000 r/min 離心10 min 后取2 mL 上清液測定其中納米微粒的粒徑、Zeta 電位、PDI 等指標(biāo),剩余溶液經(jīng)14 000 r/min 離心15 min 后按上述方法取上清液測定Fuc復(fù)合率[4]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 多糖的理化性質(zhì)及分子質(zhì)量測定

        根據(jù)表1所示,SFP 的分子質(zhì)量在101.5~701.0 ku 之間,總糖含量為56.42%,蛋白質(zhì)含量為3.26%,硫酸基含量為21.07%,未檢測到糖醛酸。根據(jù)單糖組成的結(jié)果可知,糖醛酸含量極低,因此化學(xué)法未能檢測到糖醛酸,這與以往的研究有所不同,可能是由于藻類生長環(huán)境、巖藻聚糖硫酸酯處理方法的不同造成的[25-26]。

        表1 SFP 的理化性質(zhì)測定結(jié)果Table 1 The results of physico-chemical analysis of SFP

        2.2 單糖組成

        由圖1可知,SFP 由甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、巖藻糖組成,物質(zhì)的量比分別為3.96%,0.37%,0.42%,27.20%,68.05%。其中,巖藻糖含量最高,半乳糖、甘露糖的含量次之,這與近年來報道的海藻巖藻聚糖的單糖組成相近[25],表明SFP 為巖藻聚糖的一種。

        圖1 SFP 的單糖組成分析Fig.1 The monosaccharide composition of SFP

        由表2可知,不同F(xiàn)uc/Cs 比例下制備的納米粒子粒徑在330~450 nm 之間。當(dāng)Fuc/Cs 比例為1.4∶1 時,納米粒子粒徑最小;當(dāng)比例為0.6∶1 時,粒徑最大。Zeta 電位的范圍為27~31 mV,PDI 的范圍為0.2~0.29,表明納米溶液體系穩(wěn)定。Fuc 復(fù)合率的范圍為85%~93%,并隨著Fuc/Cs 比例的增大總體呈現(xiàn)下降趨勢,這可能是因為Fuc 與Cs的結(jié)合量達(dá)到飽和[4]。

        表2 不同F(xiàn)uc/Cs 比例的納米粒子的理化性質(zhì)Table 2 Physico-chemical of nanoparticles with different Fuc/Cs ratios

        2.3 體外模擬胃液消化

        測定制備的納米粒子在人工胃液中粒徑、Zeta 電位、PDI、Fuc 復(fù)合率的變化,結(jié)果如圖2~5所示。在0,1,2,4,6 h 時,納米粒子的粒徑為330~470 nm,Zeta 電位為25~32 mV,PDI 為0.18~0.29,F(xiàn)uc 復(fù)合率為84%~95%,相對于初始狀態(tài)變化不大,說明納米粒子在人工胃液環(huán)境中呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

        圖2 人工胃液中納米粒子粒徑變化Fig.2 Changes of diameter of the nanoparticles in the artificial gastric juice

        圖3 人工胃液中納米粒子Zeta 電位變化Fig.3 Changes of Zeta potential of the nanoparticles in the artificial gastric juice

        圖4 人工胃液中納米粒子PDI 變化Fig.4 Changes of polydispersity of the nanoparticles in the artificial gastric juice

        圖5 人工胃液中Fuc 復(fù)合率的變化Fig.5 Changes of Fuc loading rate of the nanoparticles in the artificial gastric juice

        2.4 體外模擬腸液消化

        測定制備的納米粒子在人工腸液中粒徑、Zeta 電位、PDI、Fuc 復(fù)合率的變化,結(jié)果如圖6~9所示。粒徑在1 h 后均增大至1 μm 以上,表明納米粒子發(fā)生膨脹。Zeta 電位絕對值減小、PDI 增大,表明納米體系不穩(wěn)定。當(dāng)Fuc/Cs 比例為0.6∶1,0.8∶1,1.4∶1 時,F(xiàn)uc 復(fù)合率顯著降低,這是由于在堿性環(huán)境中,殼聚糖質(zhì)子化消失致使納米粒子膨脹或裂解。當(dāng)Fuc/Cs 比例為1.4∶1 時,復(fù)合率最低降至36%,說明大量巖藻聚糖硫酸酯被釋放出來,納米粒子被破壞。當(dāng)Fuc/Cs 比例為1.0∶1 和1.2∶1時,F(xiàn)uc 復(fù)合率相對穩(wěn)定。

        圖6 人工腸液中納米粒子粒徑變化Fig.6 Changes of average diameter of the nanoparticles in artificial intestinal juice

        圖7 人工腸液中納米粒子Zeta 電位變化Fig.7 Changes of Zeta potential of the nanoparticles in artificial intestinal juice

        圖8 人工腸液中納米粒子PDI 變化Fig.8 Changes of polydispersity of the nanoparticles in artificial intestinal juice

        圖9 人工腸液中Fuc 復(fù)合率的變化Fig.9 Changes of Fuc loading rate of the nanoparticles in artificial intestinal juice

        3 結(jié)論

        本文從羊棲菜中提取得到巖藻聚糖硫酸酯,通過測定分子質(zhì)量、單糖組成、總糖含量、蛋白質(zhì)含量、硫酸基含量和糖醛酸含量,初步表征其結(jié)構(gòu)特點。以此巖藻聚糖硫酸酯和殼聚糖為原料,采用聚電解質(zhì)自組裝的方法制備不同巖藻聚糖硫酸酯/殼聚糖比例的納米粒子。通過測定納米粒子在人工胃、腸液中的粒徑、Zeta 電位、PDI、巖藻聚糖硫酸酯復(fù)合率的變化來評價納米粒子的穩(wěn)定性,篩選出在人工胃液中穩(wěn)定性良好,在人工腸液中解聚性良好的納米粒子。根據(jù)模擬消化的結(jié)果可知,在人工胃液環(huán)境中,當(dāng)Fuc/Cs 比例為0.6∶1,0.8∶1,1.4∶1 時,制備得到的納米粒子溶液粒徑、Zeta 電位、PDI、Fuc 復(fù)合率變化不大,表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。但是在人工腸液環(huán)境中,粒徑、Zeta 電位、PDI、Fuc 復(fù)合率變化顯著,納米粒子穩(wěn)定性大大降低,尤其是當(dāng)比例為1.4∶1 時,F(xiàn)uc 復(fù)合率降至36%,納米粒子被顯著破壞。因此,當(dāng)羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯/殼聚糖納米粒子Fuc/Cs 比例為0.6∶1,0.8∶1,1.4∶1 時,在人工胃液中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,在人工腸液中表現(xiàn)出良好的解聚性,可作為潛在的口服藥物運(yùn)載體系,具有良好的市場前景。

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