楊 蜜 孫碧君 侯 佳 王文婕 應(yīng)文靜 惠曉瑩 孫金嶠 王曉川

Shwachman-Diamond 綜合征(SDS，OMIM：260400)是一類原發(fā)性免疫缺陷病，歸類于吞噬細胞數(shù)目及功能異常，發(fā)病率約1/75 000[1]。SDS臨床主要表現(xiàn)為胰腺外分泌功能不全、骨發(fā)育畸形、骨髓衰竭三聯(lián)征，并有反復(fù)感染及多系統(tǒng)受累[2]。約90%的SDS患兒由SBDS基因突變導(dǎo)致[3]。目前報道EFL1、DNAJC21、SRP54基因突變也可導(dǎo)致SDS樣綜合征[4, 5]，但病例少見。本文通過總結(jié)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)診治的SDS患兒的臨床表現(xiàn)、免疫功能和基因突變情況，探究該病的基因型與表型的相關(guān)性。

1 方法

1.1 SDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]①臨床診斷：胰腺外分泌功能不全和血液系統(tǒng)異常的表現(xiàn)(3個月內(nèi)≥2次中性粒細胞減少或其他血細胞減少)，并排除已知原因的外分泌胰腺功能障礙和骨髓衰竭；其他支持性證據(jù)包括骨骼異常、行為問題、一級親屬曾被確診為SDS。②分子診斷：檢出SDS相關(guān)基因(SBDS、EFL1、DNAJC21、SRP54) 已知或預(yù)測有害的致病性變異。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 2016年1月至2020年11月我院臨床免疫科住院的符合SDS臨床診斷并經(jīng)分子診斷確診的SDS連續(xù)病例。

1.3 資料截取 從我院病歷系統(tǒng)中提?。孩傩詣e；②年齡(起病、就診、末次隨訪)；③就診時身高和體重；④住院期間感染狀況：包括部位、癥狀、頻率、病原，反復(fù)呼吸道感染(1年內(nèi)，上呼吸道感染：0～2歲≥7次，～5歲≥6次，～14歲≥5次；下呼吸道感染：氣管支氣管炎0～2歲≥3次，～5歲≥2次，或肺炎≥2次[6])；嚴(yán)重感染(發(fā)生敗血癥、重癥肺炎、骨髓炎和肝膿腫等危及生命的感染)；⑤住院期間實驗室檢查：血常規(guī)、血生化、骨髓細胞學(xué)、自身抗體和免疫功能指標(biāo)；⑥影像學(xué)檢查：骨骼X線、肺部CT和頭顱MR的報告；⑦治療：抗感染、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、手術(shù)、對癥支持；⑧出院結(jié)局：好轉(zhuǎn)(體溫正常、感染控制)、自動出院、死亡。

1.4 高通量基因檢測(WES) 取得患兒父母的知情同意后，采集患兒外周靜脈血。用mini blood 全血試劑盒(QIAGEN公司，德國)提取基因組DNA, NanoDrop 2000紫外分光光度儀(Thermofisher 公司，美國)測定其濃度?；贗llumina Hiseq 2000/2500平臺進行序列檢測。測序覆蓋度>98%,平均測序深度>100×。根據(jù)我院WES數(shù)據(jù)分析流程(第1和2 版)[7，8]對變異進行信息注釋和致病性分析,并采用Sanger測序?qū)c突變進行驗證。

1.5 隨訪 截取末次門診隨訪的血常規(guī)結(jié)果，截止至2020年11月電話隨訪的感染控制情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 病例資料采用描述性分析?；純菏状尉驮\時中性粒細胞水平為中性粒細胞初始值。計算每個病例的粒細胞數(shù)值時，除外G-CSF治療后次日的檢測值，取病歷中所有檢測值的平均值。采用OriginPro (2021)軟件進行Kruskal-Wallis秩和檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的8例SDS患兒進入本文分析，男3例，女5例。父母均非近親結(jié)婚，無相關(guān)疾病家族史。起病中位年齡2.2月(新生兒期至3歲)，確診中位年齡8.5月(4月至5歲)。5例體格生長落后，就診時5例體重

2.2 基因檢測結(jié)果 7例SBDS基因突變，例1、2、4、6、7為復(fù)合雜合突變c.183_184TA>CT/c.258+2T>C；例3、5為純合突變c.258+2T>C。例8為SRP54基因新發(fā)雜合突變c.349_351del(p.T117del)。

2.3SBDS基因突變患兒基因型及表型

2.3.1 臨床表現(xiàn) 復(fù)合雜合突變患兒均以反復(fù)感染起病，均存在反復(fù)呼吸道感染，例1和6皮膚軟組織感染，例4、7生后不久出現(xiàn)膿毒血癥，例7還伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，例2于5歲發(fā)生重癥肺炎、肺膿腫(圖1)；病原包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌等細菌及腸道病毒，其中例2多次痰液檢出白色念珠菌，例4血半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)陽性。例1、4和6合并中重度貧血，例4合并血小板減少，例1、2、4和6肝功能異常，例4胰腺外分泌功能不全，例4和6骨骼影像學(xué)表現(xiàn)異常，例1、2和4精神運動發(fā)育遲緩,其中例2胼胝體發(fā)育不全。

純合突變的2例，例5生后42 d因肺炎住院，予抗感染治療1周后好轉(zhuǎn)，隨訪無反復(fù)和嚴(yán)重感染；例3主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛，MR提示下肢軟組織、肌肉少許炎癥，抗心磷脂抗體IgG和抗β2球蛋白抗體陽性，余自身抗體陰性，病原學(xué)檢查均陰性，結(jié)合病史、實驗室檢查，風(fēng)濕性疾病如SLE、ANCA相關(guān)血管炎、抗磷脂綜合征等依據(jù)不足，尚需長期隨訪；例5合并重度貧血和肝功能異常；2例均有精神運動發(fā)育遲緩；例3頭顱MR提示腦萎縮。

2.3.2 免疫功能 6例SBDS突變患兒發(fā)生粒細胞缺乏，首次發(fā)現(xiàn)粒細胞缺乏的中位年齡為2月(新生兒至5歲)，粒細胞水平(×109·L-1)0.03～0.87，5例同時伴有感染(上、下呼吸道感染，膿毒血癥)表現(xiàn)。剔除G-CSF治療后次日數(shù)據(jù)，外周血粒細胞中位數(shù)0.77；復(fù)合雜合突變患兒外周血粒細胞水平(中位數(shù)0.8)與純合突變患兒(中位數(shù)0.5)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。例1、2、6和7(復(fù)合雜合突變)抗感染治療同時予每次皮下注射G-CSF 5 μg·kg-1，粒細胞可升至正常；其中例2合并肺膿腫(圖1)，每次予G-CSF 5 μg·kg-1，每周1次，皮下注射半年，粒細胞>1.0，期間無新發(fā)感染。純合突變患兒感染程度輕，均未使用G-CSF治療。

骨髓細胞學(xué)檢查：7例均無惡性血液系統(tǒng)疾病如急性髓系白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)依據(jù)。例1和7粒系增生低下；例1各階段比值均降低，例2、3、5、6和7分葉核比例下降。

表1 SDS患兒臨床特征

除了粒細胞減少之外，部分SBDS突變患兒的免疫功能檢查還提示適應(yīng)性免疫的異常，例2 CD4+/CD8+比例倒置，B淋巴細胞比例及數(shù)目下降，但血清IgG未見降低(圖1)；例3～6 NK細胞數(shù)目及比例下降，其中例3 IgG和IgA升高、IgG亞類示IgG4明顯升高，例4 IgA降低。

2.4SRP54基因突變患兒基因型及表型 例8為SRP54基因雜合突變。圖2顯示，2月齡時以呼吸道感染伴粒細胞缺乏起病，5月齡反復(fù)頸部膿腫，1～2個月1次，多次行膿腫切開引流術(shù)，切口病理檢查提示壞死性筋膜炎，PAS染色見許多霉菌及孢子，膿液培養(yǎng)先后檢出銅綠假單胞菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌。分別于16月齡、2歲、2歲8月齡因嚴(yán)重肺部感染住院治療，痰液及肺泡灌洗液先后檢出銅綠假單胞菌、白色念珠菌、耶氏肺孢子蟲(PCP)、肺炎克雷伯菌、脆弱擬桿菌、人博卡病毒等?；純毫＜毎形恢?.48(0.01～5.5)，同時合并中度貧血和語言發(fā)育遲緩。骨髓細胞學(xué)檢查提示中幼及以后階段粒細胞比例均減低。

3 討論

SDS是一類罕見的多臟器累及的遺傳性疾病，常在1歲前發(fā)病。既往報道，粒細胞缺乏、胰腺外分泌功能不全、骨骼異常發(fā)生率分別為80%、75%和50%[9]。SDS患兒還可出現(xiàn)肝功能輕度異常、認(rèn)知功能障礙，亦有少數(shù)合并JIA、克羅恩病等炎癥性疾病的報道[10-12]。本研究中，粒細胞缺乏及肝功能異常比例與既往報道相仿，胰腺外分泌功能不全及骨骼發(fā)育異常發(fā)生率低于既往報道，提示部分患兒可能缺乏典型的三聯(lián)征表現(xiàn)，易漏診。

圖1 例2粒細胞水平、治療及影像學(xué)表現(xiàn)

圖2 SRP54基因突變患兒(例8)臨床信息時間軸及家系圖、Sanger測序圖

肺炎、復(fù)發(fā)性中耳炎和皮膚軟組織感染也是SDS患兒常見的臨床表現(xiàn)[13]。嚴(yán)重膿毒血癥是嬰幼兒期常見死亡原因之一[14]。以往認(rèn)為，SDS患兒易感病原包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、克雷伯菌、大腸桿菌和假單胞菌屬等細菌，及CMV、微小病毒B19等病毒，真菌感染相對少見[3]。本文患兒常見感染部位與既往報道相符，值得注意的是，3例患兒多次檢出真菌感染，提示真菌可能也是SDS患兒的易感病原。粒細胞缺乏是患兒易感性增加的主要原因。部分患兒可同時合并貧血、PLT減少等其他血細胞譜系減少，且有向AML、MDS轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險[3]。本研究7例患兒存在中性粒細胞缺乏，起病年齡早，粒細胞波動無明顯規(guī)律及周期，感染可能是其誘發(fā)因素。

約90%的SDS患兒由位于7q11的SBDS基因突變導(dǎo)致，該基因編碼的SBDS蛋白參與了包括核糖體成熟、RNA代謝、中性粒細胞趨化等重要分子途徑和過程[15]。c.258+2T>C和c.183-184 TA>CT是SBDS最常見的突變位點，造成的氨基酸改變分別為C84fsX3和K62X[9，16]。SBDS基因完全敲除小鼠胚胎致死，提示其功能完全缺失，無法存活。本文7例為SBDS基因突變，均為熱點突變，其中5例c.258+2T>C/c.183-184 TA>CT復(fù)合雜合突變，2例c.258+2T>C純合突變。既往文獻報道，SBDS基因型與嚴(yán)重血液系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生無關(guān)[17]。法國的一項隊列研究顯示，c.258+2T>C/c.183-184 TA>CT復(fù)合雜合突變和其余突變位點相比，血液學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。本文比較了復(fù)合雜合突變與c.258T>C純合突變患兒臨床表現(xiàn)，兩者中性粒細胞絕對值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與既往報道相符，但前者感染表現(xiàn)似乎更為突出；推測c.183-184 TA>CT突變可能對中性粒細胞功能造成更大影響，尚需更多病例進一步驗證。

SRP54基因?qū)е碌腟DS樣綜合征于2017年首次報道[4]，目前共報道30例患兒，國內(nèi)尚無文獻報道。該基因定位于14q13.2。本文例8為SRP54(c.349_351del)突變，該位點既往已報道，位于G1元素結(jié)構(gòu)域[19]。該結(jié)構(gòu)域突變患兒與其他結(jié)構(gòu)域突變患兒相比血液表型更突出，且既往報道合并神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征者約占44.4%[19]。SRP54突變患兒臨床表現(xiàn)與SBDS突變類似，但兩者骨髓粒細胞發(fā)育停滯階段存在差別，SRP54突變患兒骨髓粒細胞發(fā)育水平停滯于早幼粒階段，治療時常需更大劑量的G-CSF；SBDS突變患兒骨髓粒細胞發(fā)育水平多停滯于中幼和晚幼階段[20，21]。本文發(fā)現(xiàn)，與SBDS突變患兒相比，例8感染程度重、頻次高，感染病原廣泛，包括細菌、病毒、真菌，其中PCP感染未在SBDS突變患兒中檢出，但兩者間中性粒細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測這可能與SRP54突變患兒骨髓粒系發(fā)育水平停滯階段更早、對粒細胞功能影響更大有關(guān)，后續(xù)需更多樣本及相關(guān)功能實驗驗證。

既往國內(nèi)SDS多為個案報告，側(cè)重于消化及血液系統(tǒng)表現(xiàn)[11，22]。本文總結(jié)了8例SDS患兒的臨床及免疫表型，發(fā)現(xiàn)他們對細菌、病毒、真菌均易感，G-CSF可作為重癥感染合并粒細胞缺乏的輔助治療手段。對于粒細胞缺乏伴有反復(fù)感染的患兒，需警惕SDS可能，以期早期診斷，改善預(yù)后。