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        CARD11基因非經典區(qū)域突變所致免疫缺陷2例的臨床和免疫特征

        2021-06-07 06:13:34李天慈王文婕應文靜劉璐瑤王曉川孫金嶠
        中國循證兒科雜志 2021年2期
        關鍵詞:功能

        李天慈 王 瑩 王文婕 應文靜 劉璐瑤 胡 榆 王曉川 呂 偉 孫金嶠,3

        1 病例資料

        1.1 病史報告

        例1 男,6歲,因“反復呼吸道感染5年”于復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)初次就診。1歲后,無明顯誘因出現反復呼吸道感染,表現為支氣管炎、化膿性扁桃體炎,伴發(fā)熱,熱峰39℃以上,通常持續(xù)3~5 d,每月1次,偶伴關節(jié)痛、腹痛;3歲起,呼吸道感染頻率增加,1~2周1次,予細菌溶解產物、胸腺肽等治療無好轉。體格檢查:雙側頸部可觸及數枚淋巴結,直徑0.5~0.7 cm,質中,活動度可,無觸痛,邊界清楚,其他查體和體征未見異常。實驗室檢查提示,IL-6最高達79.8(參考值<7)pg·mL-1,RBC、Hb和PLT均正常,自身抗體陰性,EB病毒VCA IgG滴度為177(參考值為<20)RU·mL-1,EB病毒 DNA水平低于檢測值下限。胸部CT未見異常,腹部B超腹腔內未探及腫大淋巴結。

        患兒系G4P2,無反復發(fā)熱病史?;純耗赣H第1和2胎均不明原因早期流產;第3胎系患兒姐姐,無反復感染、發(fā)熱病史,未行基因檢查。隨訪患兒至8歲時診斷為變應性鼻炎,行顳骨CT,提示部分鼻黏膜增厚。

        例2 男,7歲,10月齡起無明顯誘因出現反復呼吸道感染伴發(fā)熱,體溫最高達40℃,通常持續(xù)5~7 d,伴咳嗽,無氣喘,偶伴嘔吐,無腹痛、腹瀉,抗感染治療后可好轉;3~4歲感染最為嚴重,1~2個月1次呼吸道感染伴發(fā)熱,胸腺肽治療后發(fā)病頻率較前下降;6歲起出現特應性皮炎,頭皮可見散在硬幣大小斑禿樣皮損,伴瘙癢,夜間加重。查過敏原提示對雞蛋、塵螨過敏。體格檢查未見異常?;純焊赣H自幼反復呼吸道感染伴發(fā)熱病史,學生時期最為嚴重,嚴重時呼吸道感染每月1次,成年后呼吸道感染每年3~4次,每次持續(xù)5~7 d,抗生素治療有效。母親體健。

        1.2 免疫相關檢查

        1.2.1 免疫球蛋白 外周血IgA、IgG及IgM濃度測定采用免疫透射比濁法,外周血IgE濃度采用UniCAP診斷系統(tǒng)檢測。表1顯示,例2 IgE水平顯著增高。

        表1 2例患兒的免疫球蛋白水平

        1.2.2 外周血免疫細胞分型 2例血常規(guī)顯示外周血淋巴細胞分別為60%和72%,絕對計數分別為3 100和5 200個/μL,提示存在淋巴細胞過度增殖現象。

        1.2.3 外周血淋巴細胞分型及精細分型 ①淋巴細胞分型:免疫熒光法檢測紅細胞裂解后的外周血淋巴細胞的比例及絕對數(BD公司的Multitest IMK試劑盒)。表2顯示,例1 CD3+T細胞比例升高,CD8+T細胞數量、比例輕度升高;例2 T細胞計數及比例顯著降低,B細胞計數及比例顯著升高。 ②淋巴細胞精細分型:取患兒肝素抗凝外周血50 μL,加入流式抗體后室溫避光孵育30 min,加入紅細胞裂解液,水浴離心,棄上清,加入適量磷酸鹽緩沖液后上機(BD FACSCanto Ⅱ);圖1顯示,2例過渡B細胞比例均顯著升高。例2初始B細胞比例顯著升高,記憶B細胞比例顯著下降;CD4+初始T細胞比例上升, CD4+中樞記憶T細胞及CD4+效應記憶T細胞比例下降;CD8+初始T細胞比例升高,CD8+中樞記憶T細胞和CD8+效應記憶T細胞比例下降。

        1.3 基因檢測結果 對患兒及其父母行全外顯子測序(WES)。取患兒及其父母外周血,提取基因組DNA,經超聲打斷、末端修復、接頭連接和雜交捕獲構建文庫,采用Illumina公司HiSeq測序平臺進行序列檢測,以人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列進行比對。2例患兒7號染色體CARD11基因(NM_032415)均存在雜合突變,例1突變位點:exon19的c.2542 C>T(p.R848C),突變來自母親;例2突變位點:exon16的c.2036 A>T(p.Q679L),突變來自父親,既往未見報道。

        表2 2例患兒外周血淋巴細胞比例及絕對數量

        圖1 2例患兒外周血B淋巴細胞精細分型結果

        取患兒及父母外周血基因組DNA,設計引物進行PCR擴增(2 ×Multiplex PCR Mix,上海近岸科技有限公司)。突變驗證引物序列如下。例1正向:CCATCCCTACGCAGAG-TCG,反向:GGTTTGAAGCTGGCGAGATC;例2正向:ACATTCTGTTTCCTGCTGCA,反向:GACACTACAGTTGCAGCCAC。Sanger驗證結果見圖2?;純和蛔兎謩e導致CARD11蛋白第848位點的精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?例1)以及第679位點的谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼?例2)。2個突變PhyloP得分分別為0.758和4.144(-14~6,正值代表保守),PhastCons得分均為1分(0~1,越接近1則保守度越高),說明在不同物種間這2個突變位點及其附近序列高度保守。經mutation taster網站預測,2個突變均為致病突變,氨基酸改變得分分別為180和113。2個突變的PROVEAN得分[1, 2]分別為-1.954和-3.134,預測結果亦為致病突變。ExAC及1000G數據庫中未發(fā)現c.2036 A>T。

        CARD11基因突變導致的疾病以功能獲得性點突變導致B細胞增殖伴NF-κB激活、T細胞無能疾病(BENTA)及彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)最具代表性。這類功能獲得性CARD11突變通常位于CARD11基因的CARD結構域、CC結構域及其之間的部分。圖3顯示,例1攜帶的突變位于SH3結構域及GUK結構域之間,例2攜帶的突變位于PDZ結構域,與經典的CARD11突變相比在基因中的位置相對靠后。

        1.4 體外NF-κB通路激活實驗結果 體外使用Gibco DMEM培養(yǎng)基,加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞。使用聚乙烯亞胺(PEI)為媒介,轉染293T細胞。12孔板培養(yǎng)細胞,細胞密度70%左右,每孔轉NF-κB GFP報告質粒及目的質粒各0.5 μg,6 h后換液。圖4顯示,24 h后檢測GFP表達情況[NF-κB通路激活時NF-κB GFP 報告質??杀磉_綠色熒光蛋白(GFP),表達情況與通路激活程度成正比],與野生型相比,在293T細胞系中過表達患兒涉及的2種突變蛋白,表達GFP的細胞比例及GFP表達的平均熒光強度所反映的NF-κB通路的激活情況均減弱,提示患兒所攜帶的2種突變均導致功能缺失。

        圖2 2例CARD11基因突變患兒一代測序驗證結果及家系圖

        圖3 文獻報道[4-8]的致BENTA及DLBCL的CARD11突變

        及本文患兒突變在基因中的位置

        注 黑色為致BENTA的CARD11突變,灰色為致DLBCL的CARD11突變,均位于基因靠近N端的CARD及CC結構域中。紅色為本文患兒攜帶的突變位點

        圖4 在293T細胞中過表達野生型(WT)及突變的CARD11基因后NF-κB通路的激活情況

        2 討論

        Caspase 募集結構域家族成員11(CARD11)基因編碼的同名蛋白CARD11是一種含半胱天冬酶募集結構域的支架蛋白,屬于膜相關鳥苷酸激酶家族,其表達具有淋巴細胞特異性[3]。在適應性免疫中,尤其是T細胞受體(TCR)介導的NF-κB途徑激活中,CARD11蛋白發(fā)揮著重要作用[3]。在TCR和B細胞受體(BCR)接受刺激后,CARD11蛋白發(fā)生構象改變,與黏膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(MALT1)以及B細胞淋巴瘤/白血病10(BCL10)組成CBM復合物,充當細胞間聯(lián)系的橋梁,傳遞細胞表面的受體信號,激活下游的NF-κB通路,在適應性免疫中發(fā)揮重要作用[3]。

        CARD11缺陷的臨床表現復雜多樣,雜合的功能獲得性種系突變可以導致一種名為BENTA的原發(fā)免疫缺陷病。1971年Darte等[4]描述了第1例CARD11突變導致BENTA的患兒,表現為反復呼吸道感染、脾腫大以及外周血B細胞中過渡性B細胞比例顯著升高。Arjunaraja等[5]發(fā)現導致BENTA的CARD11突變還可影響B(tài)淋巴細胞的分化,表現為刺激后短期漿細胞及長期漿細胞比例的顯著降低。類似的功能獲得性點突變若發(fā)生在體細胞中,則可導致彌漫性大B細胞淋巴瘤[6, 7]。純合的功能缺失性突變可以導致免疫缺陷病11A,表現為自幼出現的反復感染,以肺炎最為常見;患兒T、B細胞數正常但免疫球蛋白水平降低,外周血淋巴細胞分型以幼稚或過渡性T、B淋巴細胞增高,調節(jié)性淋巴細胞[8]及記憶細胞減低為主要特征[9]。另外,雜合的功能缺失點突變亦可導致伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B,呈常染色體顯性遺傳。Ma等[10]發(fā)現此病患者表現為輕重不一的特應性皮炎,同時伴不同程度的感染,如一過性或反復發(fā)作的肺炎、軟疣、膿腫、菌血癥等,部分患者可出現外周血IgE水平升高及嗜酸性粒細胞計數增多,還可出現一過性的低丙種球蛋白血癥、外周血IgM水平降低。

        本文2例患兒均有反復感染臨床表現和外周血過渡B細胞顯著增高的CARD11突變導致免疫缺陷的特征性免疫表型,突變致病性預測提示,攜帶的突變均致病,提示患兒所患疾病應與CARD11突變有關。例1攜帶的突變,Dorjbal等[11]認為其為致病突變,精細分型的檢查進一步印證了此突變的致病性。例2基因型及臨床表型均符合CARD11突變致病表現,且疾病表現為常染色體顯性遺傳,其父親具有相似臨床特征,進一步證實了突變與疾病之間的關聯(lián)性。目前已報道的功能獲得性CARD11突變,主要位于基因N端的CARD、CC結構域或2個結構域之間的部分(有文獻稱這部分為LATCH結構域)[6, 12]。這些突變使NF-κB通路持續(xù)激活,從而導致了疾病的發(fā)生[13]。而導致免疫缺陷病11A和伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B的功能缺失性點突變,則不會出現NF-κB通路的自發(fā)激活[9]。本文例1突變位于SH3結構域與GUK結構域之間,例2突變位于PDZ結構域,均距CC結構域較遠。僅有少量涉及GUK結構域附近的功能缺失性點突變的文獻報道,關于PDZ結構域的致病突變尚未見報道。結合功能實驗,患兒所攜帶的點突變不會導致NF-κB通路的自發(fā)過度激活的結果,2例突變應為功能缺失性點突變。與經典的BENTA相比,本文2例B細胞克隆增殖程度較輕,脾臟均無腫大,無B細胞淋巴瘤,應歸類為伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B。

        本文涉及的實驗及文獻中報道的研究結果,均提示這些功能缺失性突變的致病機制可能不依賴NF-κB通路,且致病突變在基因中的相對位置并不局限在經典的導致BENTA或DLBCL的結構域,提示C端的結構域對于CARD11基因功能的發(fā)揮亦有重要作用,除NF-κB通路外,CARD11基因還可能通過其他通路影響免疫功能。

        值得注意的是,例1母親攜帶與患兒相同的致病突變,但無顯著的反復感染伴發(fā)熱病史,Buchbinder等[12]報告一類似家系,即相同基因型,男孩患病但母親無顯著臨床表現,提示CARD11突變導致的免疫缺陷可能存在不完全顯性。例2與其父親有相同基因型及臨床表型,結合與CARD11突變密切相關的彌漫性大B細胞淋巴瘤存在一定的性別傾向,尤其是在年輕患者中男性多于女性,治療結果也受性別影響[14, 15],提示CARD11突變致病的臨床表現與嚴重程度可能與性別存在相關性。

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