李天慈 王 瑩 王文婕 應文靜 劉璐瑤 胡 榆 王曉川 呂 偉 孫金嶠,3

1 病例資料

1.1 病史報告

例1 男，6歲，因“反復呼吸道感染5年”于復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)初次就診。1歲后，無明顯誘因出現反復呼吸道感染，表現為支氣管炎、化膿性扁桃體炎，伴發(fā)熱，熱峰39℃以上，通常持續(xù)3～5 d，每月1次，偶伴關節(jié)痛、腹痛；3歲起，呼吸道感染頻率增加，1～2周1次，予細菌溶解產物、胸腺肽等治療無好轉。體格檢查：雙側頸部可觸及數枚淋巴結，直徑0.5～0.7 cm，質中，活動度可，無觸痛，邊界清楚，其他查體和體征未見異常。實驗室檢查提示，IL-6最高達79.8(參考值<7)pg·mL-1，RBC、Hb和PLT均正常，自身抗體陰性，EB病毒VCA IgG滴度為177(參考值為<20)RU·mL-1，EB病毒 DNA水平低于檢測值下限。胸部CT未見異常，腹部B超腹腔內未探及腫大淋巴結。

患兒系G4P2，無反復發(fā)熱病史?；純耗赣H第1和2胎均不明原因早期流產；第3胎系患兒姐姐，無反復感染、發(fā)熱病史，未行基因檢查。隨訪患兒至8歲時診斷為變應性鼻炎，行顳骨CT，提示部分鼻黏膜增厚。

例2 男，7歲，10月齡起無明顯誘因出現反復呼吸道感染伴發(fā)熱，體溫最高達40℃，通常持續(xù)5～7 d，伴咳嗽，無氣喘，偶伴嘔吐，無腹痛、腹瀉，抗感染治療后可好轉；3～4歲感染最為嚴重，1～2個月1次呼吸道感染伴發(fā)熱，胸腺肽治療后發(fā)病頻率較前下降；6歲起出現特應性皮炎，頭皮可見散在硬幣大小斑禿樣皮損，伴瘙癢，夜間加重。查過敏原提示對雞蛋、塵螨過敏。體格檢查未見異常?；純焊赣H自幼反復呼吸道感染伴發(fā)熱病史，學生時期最為嚴重，嚴重時呼吸道感染每月1次，成年后呼吸道感染每年3～4次，每次持續(xù)5～7 d，抗生素治療有效。母親體健。

1.2 免疫相關檢查

1.2.1 免疫球蛋白 外周血IgA、IgG及IgM濃度測定采用免疫透射比濁法，外周血IgE濃度采用UniCAP診斷系統(tǒng)檢測。表1顯示，例2 IgE水平顯著增高。

表1 2例患兒的免疫球蛋白水平

1.2.2 外周血免疫細胞分型 2例血常規(guī)顯示外周血淋巴細胞分別為60%和72%，絕對計數分別為3 100和5 200個/μL，提示存在淋巴細胞過度增殖現象。

1.2.3 外周血淋巴細胞分型及精細分型 ①淋巴細胞分型：免疫熒光法檢測紅細胞裂解后的外周血淋巴細胞的比例及絕對數(BD公司的Multitest IMK試劑盒)。表2顯示，例1 CD3+T細胞比例升高，CD8+T細胞數量、比例輕度升高；例2 T細胞計數及比例顯著降低，B細胞計數及比例顯著升高。 ②淋巴細胞精細分型：取患兒肝素抗凝外周血50 μL，加入流式抗體后室溫避光孵育30 min，加入紅細胞裂解液，水浴離心，棄上清，加入適量磷酸鹽緩沖液后上機(BD FACSCanto Ⅱ);圖1顯示，2例過渡B細胞比例均顯著升高。例2初始B細胞比例顯著升高，記憶B細胞比例顯著下降；CD4+初始T細胞比例上升， CD4+中樞記憶T細胞及CD4+效應記憶T細胞比例下降；CD8+初始T細胞比例升高，CD8+中樞記憶T細胞和CD8+效應記憶T細胞比例下降。

1.3 基因檢測結果 對患兒及其父母行全外顯子測序(WES)。取患兒及其父母外周血，提取基因組DNA，經超聲打斷、末端修復、接頭連接和雜交捕獲構建文庫，采用Illumina公司HiSeq測序平臺進行序列檢測，以人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列進行比對。2例患兒7號染色體CARD11基因(NM_032415)均存在雜合突變，例1突變位點：exon19的c.2542 C>T(p.R848C)，突變來自母親；例2突變位點：exon16的c.2036 A>T(p.Q679L)，突變來自父親，既往未見報道。

表2 2例患兒外周血淋巴細胞比例及絕對數量

圖1 2例患兒外周血B淋巴細胞精細分型結果

取患兒及父母外周血基因組DNA，設計引物進行PCR擴增(2 ×Multiplex PCR Mix，上海近岸科技有限公司)。突變驗證引物序列如下。例1正向：CCATCCCTACGCAGAG-TCG，反向：GGTTTGAAGCTGGCGAGATC；例2正向：ACATTCTGTTTCCTGCTGCA，反向：GACACTACAGTTGCAGCCAC。Sanger驗證結果見圖2?；純和蛔兎謩e導致CARD11蛋白第848位點的精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?例1)以及第679位點的谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼?例2)。2個突變PhyloP得分分別為0.758和4.144(-14～6，正值代表保守)，PhastCons得分均為1分(0～1，越接近1則保守度越高)，說明在不同物種間這2個突變位點及其附近序列高度保守。經mutation taster網站預測，2個突變均為致病突變，氨基酸改變得分分別為180和113。2個突變的PROVEAN得分[1, 2]分別為-1.954和-3.134，預測結果亦為致病突變。ExAC及1000G數據庫中未發(fā)現c.2036 A>T。

CARD11基因突變導致的疾病以功能獲得性點突變導致B細胞增殖伴NF-κB激活、T細胞無能疾病(BENTA)及彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)最具代表性。這類功能獲得性CARD11突變通常位于CARD11基因的CARD結構域、CC結構域及其之間的部分。圖3顯示，例1攜帶的突變位于SH3結構域及GUK結構域之間，例2攜帶的突變位于PDZ結構域，與經典的CARD11突變相比在基因中的位置相對靠后。

1.4 體外NF-κB通路激活實驗結果 體外使用Gibco DMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細胞。使用聚乙烯亞胺(PEI)為媒介，轉染293T細胞。12孔板培養(yǎng)細胞，細胞密度70%左右，每孔轉NF-κB GFP報告質粒及目的質粒各0.5 μg，6 h后換液。圖4顯示，24 h后檢測GFP表達情況[NF-κB通路激活時NF-κB GFP 報告質?？杀磉_綠色熒光蛋白(GFP)，表達情況與通路激活程度成正比]，與野生型相比，在293T細胞系中過表達患兒涉及的2種突變蛋白，表達GFP的細胞比例及GFP表達的平均熒光強度所反映的NF-κB通路的激活情況均減弱，提示患兒所攜帶的2種突變均導致功能缺失。

圖2 2例CARD11基因突變患兒一代測序驗證結果及家系圖

圖3 文獻報道[4-8]的致BENTA及DLBCL的CARD11突變

及本文患兒突變在基因中的位置

注 黑色為致BENTA的CARD11突變，灰色為致DLBCL的CARD11突變，均位于基因靠近N端的CARD及CC結構域中。紅色為本文患兒攜帶的突變位點

圖4 在293T細胞中過表達野生型(WT)及突變的CARD11基因后NF-κB通路的激活情況

2 討論

Caspase 募集結構域家族成員11(CARD11)基因編碼的同名蛋白CARD11是一種含半胱天冬酶募集結構域的支架蛋白，屬于膜相關鳥苷酸激酶家族，其表達具有淋巴細胞特異性[3]。在適應性免疫中，尤其是T細胞受體(TCR)介導的NF-κB途徑激活中，CARD11蛋白發(fā)揮著重要作用[3]。在TCR和B細胞受體(BCR)接受刺激后，CARD11蛋白發(fā)生構象改變，與黏膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(MALT1)以及B細胞淋巴瘤/白血病10(BCL10)組成CBM復合物，充當細胞間聯(lián)系的橋梁，傳遞細胞表面的受體信號，激活下游的NF-κB通路，在適應性免疫中發(fā)揮重要作用[3]。

CARD11缺陷的臨床表現復雜多樣，雜合的功能獲得性種系突變可以導致一種名為BENTA的原發(fā)免疫缺陷病。1971年Darte等[4]描述了第1例CARD11突變導致BENTA的患兒，表現為反復呼吸道感染、脾腫大以及外周血B細胞中過渡性B細胞比例顯著升高。Arjunaraja等[5]發(fā)現導致BENTA的CARD11突變還可影響B(tài)淋巴細胞的分化，表現為刺激后短期漿細胞及長期漿細胞比例的顯著降低。類似的功能獲得性點突變若發(fā)生在體細胞中，則可導致彌漫性大B細胞淋巴瘤[6, 7]。純合的功能缺失性突變可以導致免疫缺陷病11A，表現為自幼出現的反復感染，以肺炎最為常見；患兒T、B細胞數正常但免疫球蛋白水平降低，外周血淋巴細胞分型以幼稚或過渡性T、B淋巴細胞增高，調節(jié)性淋巴細胞[8]及記憶細胞減低為主要特征[9]。另外，雜合的功能缺失點突變亦可導致伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B，呈常染色體顯性遺傳。Ma等[10]發(fā)現此病患者表現為輕重不一的特應性皮炎，同時伴不同程度的感染，如一過性或反復發(fā)作的肺炎、軟疣、膿腫、菌血癥等，部分患者可出現外周血IgE水平升高及嗜酸性粒細胞計數增多，還可出現一過性的低丙種球蛋白血癥、外周血IgM水平降低。

本文2例患兒均有反復感染臨床表現和外周血過渡B細胞顯著增高的CARD11突變導致免疫缺陷的特征性免疫表型，突變致病性預測提示，攜帶的突變均致病，提示患兒所患疾病應與CARD11突變有關。例1攜帶的突變，Dorjbal等[11]認為其為致病突變，精細分型的檢查進一步印證了此突變的致病性。例2基因型及臨床表型均符合CARD11突變致病表現，且疾病表現為常染色體顯性遺傳，其父親具有相似臨床特征，進一步證實了突變與疾病之間的關聯(lián)性。目前已報道的功能獲得性CARD11突變，主要位于基因N端的CARD、CC結構域或2個結構域之間的部分(有文獻稱這部分為LATCH結構域)[6, 12]。這些突變使NF-κB通路持續(xù)激活，從而導致了疾病的發(fā)生[13]。而導致免疫缺陷病11A和伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B的功能缺失性點突變，則不會出現NF-κB通路的自發(fā)激活[9]。本文例1突變位于SH3結構域與GUK結構域之間，例2突變位于PDZ結構域，均距CC結構域較遠。僅有少量涉及GUK結構域附近的功能缺失性點突變的文獻報道，關于PDZ結構域的致病突變尚未見報道。結合功能實驗，患兒所攜帶的點突變不會導致NF-κB通路的自發(fā)過度激活的結果，2例突變應為功能缺失性點突變。與經典的BENTA相比，本文2例B細胞克隆增殖程度較輕，脾臟均無腫大，無B細胞淋巴瘤，應歸類為伴變應性皮炎的免疫缺陷病11B。

本文涉及的實驗及文獻中報道的研究結果，均提示這些功能缺失性突變的致病機制可能不依賴NF-κB通路，且致病突變在基因中的相對位置并不局限在經典的導致BENTA或DLBCL的結構域，提示C端的結構域對于CARD11基因功能的發(fā)揮亦有重要作用，除NF-κB通路外，CARD11基因還可能通過其他通路影響免疫功能。

值得注意的是，例1母親攜帶與患兒相同的致病突變，但無顯著的反復感染伴發(fā)熱病史，Buchbinder等[12]報告一類似家系，即相同基因型，男孩患病但母親無顯著臨床表現，提示CARD11突變導致的免疫缺陷可能存在不完全顯性。例2與其父親有相同基因型及臨床表型，結合與CARD11突變密切相關的彌漫性大B細胞淋巴瘤存在一定的性別傾向，尤其是在年輕患者中男性多于女性，治療結果也受性別影響[14, 15]，提示CARD11突變致病的臨床表現與嚴重程度可能與性別存在相關性。