王 珊 李文娟 梁海港 黃婷婷 吳澤東

安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司，安徽合肥 230000

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生等有直接關(guān)系的重要激酶[1-2]，其血清水平在診斷心肌損傷及骨關(guān)節(jié)炎等方面具有重要的臨床意義[3-7]。目前檢測CK方法主要有國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）參考方法和常規(guī)生化方法，其中常規(guī)生化方法操作簡便，成本低，故臨床應(yīng)用廣泛[8-11]。由于CK檢測結(jié)果易受濃度、pH值、溫度等多種因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果差異大。本文采用A、B兩種測量系統(tǒng)同時(shí)測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、新鮮血清以及IFCC國際參考實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（IFCC-RELA）樣本，將結(jié)果與IFCC參考方法測定結(jié)果進(jìn)行比對，最終按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP09-A3文件對正確度進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本日立公司HITACHI 7180 全自動生化分析儀、日本島津UV 2700型紫外可見分光光度計(jì)、美國FLUKE 1523型點(diǎn)溫度計(jì)、瑞士梅特勒XSE205DU型分析天平、瑞士梅特勒型S220型pH計(jì)、美國Hamilton公司Microlab 600稀釋配液儀、德國Eppendorf移液器、日本ASONE容量瓶。

1.2 試劑

參考方法試劑：氯化鈉、氫氧化鈉、甘油、醋酸鎂、D-葡萄糖、β-D-葡萄糖-6-磷酸鈉鹽和二水乙二胺四乙酸二鈉鹽均購自美國Sigma公司；咪唑、醋酸和N-乙酰-L-半胱氨酸均購自德國Merck公司；六水5"-單磷酸腺苷、三水三磷酸腺苷二鈉、二磷酸腺苷單鉀鹽和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉鹽均購自瑞士Sorachim公司；P1，P5-二腺苷-5"五磷酸五鋰鹽、己糖激酶（HK）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）均購自瑞士Roche公司；四水磷酸肌酸二鈉鹽購自日本OYC公司；常規(guī)方法試劑：A公司、B公司生產(chǎn)的CK試劑盒。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)控品和血清樣品

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD455k購自歐盟委員會（European commission），認(rèn)定值為（314.00±6.00）U/L；2018年CK國際參考實(shí)驗(yàn)室室間比對樣本RELA A和RELA B由IFCC提供，德國臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)會（German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicin，DGKL）認(rèn) 定 值 為（357.12±6.24）U/L和（326.88±5.70）U/L。質(zhì)控品：英國朗道（貨號：HN1530-1285UN和HE1532-983UE）。

血清樣品：40例不同濃度新鮮單人份血清，CK催化活性濃度范圍為10～1000 U/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 參考方法檢測方案 按照IFCC參考方法準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)條件，用2018年RELA樣品確認(rèn)參考方法測量結(jié)果的精密度，要求樣品每天測定5次，連續(xù)測定2 d，10次測定結(jié)果變異系數(shù)（CV）≤1%。用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD455k確認(rèn)參考方法的正確度，3次測量結(jié)果在“認(rèn)定值±不確定度”范圍內(nèi)。在參考方法精密度和正確度達(dá)到要求后進(jìn)行40份血清樣品測定。測定順序?yàn)橘|(zhì)控→樣品→質(zhì)控，每個(gè)樣品重復(fù)測定2次，每10份血清加測一個(gè)質(zhì)控。

1.4.2 常規(guī)方法測量方案 A、B兩個(gè)測量系統(tǒng)分別由 A、B廠家校準(zhǔn)品、質(zhì)控品及試劑盒、日立7180全自動生化儀組成，亦稱為A法、B法；兩種測量系統(tǒng)在同一臺儀器的不同測量通道上同時(shí)進(jìn)行。儀器進(jìn)行相應(yīng)校準(zhǔn)后，對40份新鮮血清樣品和RELA樣本進(jìn)行測定，測量順序?yàn)椋嘿|(zhì)控→樣品→質(zhì)控，每個(gè)樣品重復(fù)測量2次，其均值作為評價(jià)數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)CLSI EP09-A3文件，將兩個(gè)測量系統(tǒng)的測定結(jié)果分別與IFCC測定結(jié)果進(jìn)行比較，從而評價(jià)兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度，并用Excel繪制的直線回歸圖和Origin 8繪制改良Bland-Altman圖形共同進(jìn)行分析驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 測定數(shù)據(jù)有效性檢驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)全部數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)無離群值。

2.2 IFCC參考方法正確度和精密度的確認(rèn)

采用2018年RELA樣本對精密度進(jìn)行確認(rèn)，其CV＜1%，參考方法對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERMAD455k測定結(jié)果的確認(rèn)，3次測定結(jié)果均在“認(rèn)定值±不確定度”范圍內(nèi)。故符合性能要求，見表1。

表1 IFCC參考方法正確度和精密度的確認(rèn)

2.3 質(zhì)控樣本的測定結(jié)果

分別采用IFCC參考方法、A和B兩種測量系統(tǒng)檢測質(zhì)控樣本（朗道公司HN1530-1285UN和HE1532-983UE），見表2。結(jié)果表明，B法測量兩個(gè)質(zhì)控樣本和IFCC參考方法測定值均在結(jié)果要求（等效限±5.25%）范圍內(nèi)，其偏倚結(jié)果較為一致。而A法測量兩個(gè)質(zhì)控樣本測定值均在結(jié)果要求（等效限±5.25%）范圍外，且均明顯偏低。

2.4 A、B測量系統(tǒng)測定結(jié)果的比較

采用A、B測量系統(tǒng)在日立7180全自動生化儀上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進(jìn)行同時(shí)測定，見表3。

表2 質(zhì)控樣本測定結(jié)果

表3 A、B法與IFCC方法測定結(jié)果

以B法測定結(jié)果為X軸，A法測定結(jié)果為Y軸作直線回歸圖，可見A、B兩法存在明顯差異，A法的測定結(jié)果均偏低于B法，見圖1。

圖1 A、B兩測量系統(tǒng)測定結(jié)果比較

2.5 A、B測量系統(tǒng)分別與IFCC參考方法的比較

采用A、B兩測量系統(tǒng)在日立7180全自動生化儀上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進(jìn)行同時(shí)測定，見表3。以IFCC參考方法作為參比方法，A、B法作待評價(jià)方法，利用直線回歸圖和改良Bland-Altman圖形分析法進(jìn)行評價(jià)，分別以A、B法為Y軸，與X軸的參考方法作直線回歸圖（圖2、3）和Bland-Altman圖（圖4），發(fā)現(xiàn)B法與IFCC參考方法結(jié)果較為一致，其平均偏倚范圍在1.53%，在IFCC參考方法允許范圍內(nèi)，而A法與IFCC參考方法結(jié)果存在明顯偏差，其平均偏倚范圍為-6.25%，超出IFCC參考方法允許范圍（±5.25%）。

圖2 A測量系統(tǒng)與IFCC法測定結(jié)果直線回歸圖

圖3 B測量系統(tǒng)與IFCC法測定結(jié)果直線回歸圖

圖4 A、B測量系統(tǒng)與IFCC參考方法測定結(jié)果的Bland-Altman圖注：A法平均偏倚為-6.25%；B法平均偏倚為1.53%

2.6 A、B兩測量系統(tǒng)校準(zhǔn)品基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

分別用IFCC參考方法和A、B測量系統(tǒng)在日立7180全自動生化儀上對20例不同濃度新鮮單人份樣本血清進(jìn)行測定。根據(jù)CLSI EP14-A2文件對基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)，將20例不同濃度新鮮單人份樣本血清和A、B校準(zhǔn)品用進(jìn)行A、B兩測量系統(tǒng)重復(fù)性測試的均值為Y軸，用IFCC參考方法的均值為X軸作散點(diǎn)圖，采用Origin 8作圖軟件評價(jià)A、B兩校準(zhǔn)品的基質(zhì)效應(yīng)。

A、B兩校準(zhǔn)品均位于IFCC參考方法分別與A、B兩測量系統(tǒng)的直線回歸方程95%置信區(qū)間外，說明均存在基質(zhì)效應(yīng)，其中A校準(zhǔn)品的基質(zhì)效應(yīng)較明顯。見圖5、6。

圖5 A校準(zhǔn)品基質(zhì)效應(yīng)

圖6 B校準(zhǔn)品基質(zhì)效應(yīng)

3 討論

本研究通過檢測2018年RELA確認(rèn)參考方法的精密度、檢測ERM-AD455k確認(rèn)參考方法的正確度，以IFCC-RELA對CK的等效限（± 5.25%）作為合格指標(biāo)，根據(jù)EP09-A3文件評價(jià)常規(guī)測量系統(tǒng)測定結(jié)果的正確度，采用IFCC參考方法和A、B兩測量系統(tǒng)在同一全自動生化儀不同通道上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進(jìn)行測定，結(jié)果顯示A、B兩個(gè)常規(guī)測量系統(tǒng)的測定值具有顯著差異。

為了驗(yàn)證A、B兩種方法與IFCC參考方法的一致性，本研究利用Excel繪制的直線回歸方程和Origin 8制作的改良Bland-Altman圖形進(jìn)行分析。其中A法與IFCC參考方法的直線回歸方程為YA= 0.9814X-4.0506，R2= 0.9986，B法 與IFCC參考方法的直線回歸方程為YB= 1.0124X+ 0.5383，R2= 0.9995，A法與B法的直線回歸方程為Y= 0.9791X-5.0766，R2= 0.9977。分析結(jié)果可見，A、B兩法均與IFCC參考方法有良好的相關(guān)性，且A、B兩法的相關(guān)性也符合R2＞0.95要求。但通過改良Bland-Altman圖形分析，B法測定結(jié)果的大部分散點(diǎn)位于“0”點(diǎn)之上，與參考方法的測定結(jié)果存在一定程度的正向偏倚，B法平均偏倚為1.53%；A法測定結(jié)果的散點(diǎn)均位于“0”點(diǎn)之下，與參考方法的測定結(jié)果存在著一定程度的負(fù)向偏倚，A法平均偏倚為-6.25%。根據(jù)回歸方程與改良Bland-Altman圖形分析，B法與IFCC參考方法測定結(jié)果較為一致，在 IFCC參考方法允許偏倚范圍內(nèi)，提示B法測定結(jié)果正確；而A法與IFCC參考方法測定結(jié)果正確度性能不一致，整體偏低，且結(jié)果已超出IFCC參考方法的允許偏倚范圍，提示A法測定結(jié)果不正確。

為了保證常規(guī)檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和可比性，血清酶學(xué)參考系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)酶學(xué)檢測結(jié)果溯源性的基礎(chǔ)[12]。常規(guī)檢測系統(tǒng)只有溯源至參考方法或參考物質(zhì)，才能夠有效的減小臨床檢測結(jié)果與靶值的偏倚，研究發(fā)現(xiàn)[13-15]校準(zhǔn)品是否具有互換性是影響常規(guī)方法檢測結(jié)果的重要因素，故本文對A、B兩校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性評價(jià)。依據(jù)EP14-A2文件，提示A、B校準(zhǔn)品的測定值均位于回歸方程95%置信區(qū)間外，說明都存在基質(zhì)效應(yīng)，但A校準(zhǔn)品的基質(zhì)效應(yīng)較明顯，推測可能是導(dǎo)致測定結(jié)果不正確的主要原因，B校準(zhǔn)品雖存在基質(zhì)效應(yīng)，但對檢測系統(tǒng)測定結(jié)果的正確度未產(chǎn)生太大的影響。

綜上所述，A、B兩個(gè)常規(guī)測量系統(tǒng)測定同一樣本在同一儀器上的測定結(jié)果存在著顯著的差異，這種現(xiàn)象說明常規(guī)測量系統(tǒng)缺乏溯源性，只有在特異性與參考方法相同或相近的常規(guī)方法才能通過不間斷的溯源鏈更好的實(shí)現(xiàn)溯源，故建議有關(guān)研發(fā)、生產(chǎn)單位有必要對常規(guī)測量系統(tǒng)的正確度以及校準(zhǔn)品的互換性進(jìn)行評價(jià)。