李大山，曾天艷，馬 莎，王文靜，邵立東

云南中醫(yī)藥大學中藥學院云南省南藥資源可持續(xù)利用重點實驗室，昆明 650500

肉豆蔻屬于肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristicafragrans)的干燥種仁，被《中國藥典》2015年版一部收錄，功能與主治：溫中行氣，澀腸止瀉，用于脾胃虛寒，久瀉不止，脘腹脹痛，食少嘔吐[1]。據(jù)文獻報道，肉豆蔻的化學成分主要是木質素、苯并呋喃類新木質素、非苯并呋喃類新木質素[2,3]，而二芳基丙烷類成分的報道比較少見[4]。肉豆蔻中的化學成分特別是酚類成分具有廣泛的生物活性，目前的活性研究主要集中在抗炎[5]和抗腫瘤活性[6]兩方面。除此之外，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面如神經(jīng)保護[7]、抗焦慮[8]、抗菌[9]和治療糖尿病[10]等方面也有相關報道。

炎癥已被研究證明是自體免疫紊亂[11]和腫瘤[12]等疾病發(fā)生過程中共同的病理機制。當免疫細胞受到炎癥介質等物質刺激時，會促進一氧化氮合酶(iNOS)的大量表達，釋放一氧化氮(NO)引起免疫應答，因此抑制NO生成是評價化合物抗炎活性的直接指標[13]。

傳統(tǒng)的抗炎藥物環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑對心血管系統(tǒng)和胃粘膜存在著副作用[14]，需研究開發(fā)新型抗炎藥物。鑒于前期關于肉豆蔻中酚類成分的抗炎活性報道，而同為酚類的二芳基丙烷成分的研究較少[4]，為了豐富其二芳基丙烷類化學成分，發(fā)現(xiàn)新型抗炎活性的先導化合物，本文對肉豆蔻果實丙酮提取物乙酸乙酯部位的二芳基丙烷類成分進行了分離純化和結構鑒定，并測試了分離化合物對小鼠RAW264.7巨噬細胞的NO生成抑制活性。

1 實驗部分

1.1 材料

肉豆蔻采購于昆明螺螄灣藥材市場，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學王文靜教授鑒定為肉豆蔻(Myristicafragrans)，原植物標本(20190503)現(xiàn)存于云南中醫(yī)藥大學中藥學院科研實驗室。

1.2 儀器與試劑

AM-500 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司)；UV-2401A紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Affinity-1S紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)；VG Auto Spec-3000質譜儀(英國VG PRIMA公司)；薄層層析硅膠GF254和柱層析硅膠(200(300目，青島海洋化工有限公司)；RP-18反相材料(40～63 μm，德國Merk公司)；Sephadex LH-20(40～70 μm，瑞士Amersham Biosciences AB公司)；提取和柱層析溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇(工業(yè)級，重蒸后使用)；其余試劑均為分析純。

1.3 提取與分離

干燥的肉豆蔻果實3.0 kg，粉碎后用70%的丙酮/水溶液(10 L)室溫浸泡提取3次(每次2天)，提取液合并，減壓蒸餾出去大部分丙酮/水得浸膏，加入2 L水，然后分別用石油醚，乙酸乙酯各萃取3次(3×2 L)，減壓回收萃取溶劑后得乙酸乙酯部分230 g。

乙酸乙酯部分用500 g硅膠(200～300目)拌樣，1.0 kg硅膠(200～300目)進行硅膠柱層析，石油醚/丙酮(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脫，TLC檢測并合并相同的部分，得到5個組分Fr.1～5。

Fr.4(33 g)采用反相RP-18進行柱層析，MeOH/H2O(30∶70→95∶5)梯度洗脫，得到4個組分Fr.4.1～Fr.4.4。Fr.4.2(2.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(CHCl3/MeOH，3∶2)凝膠柱層析得到3個組分Fr.4.2.1～Fr.4.2.3。Fr.4.2.2(243 mg)依次通過硅膠柱層析(石油醚/丙酮，20∶1→5∶1；氯仿/丙酮，15∶1→5∶1)得到化合物1(8 mg)、2(11 mg)和4(16 mg)。

Fr.5(26 g)采用反相RP-18進行柱層析，MeOH/H2O(20∶80→95∶5)梯度洗脫，得到4個組分Fr.5.1～Fr.5.4。Fr.5.2(1.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20(CHCl3/MeOH，3:2)凝膠柱層析得到3個組分Fr.5.2.1～Fr.5.2.3。Fr.5.2.2(122 mg)依次通過硅膠柱層析(氯仿/甲醇，20∶1→5∶1；氯仿/丙酮，10∶1→1∶1)得到化合物3(21 mg)和5(18 mg)。

1.4 NO生成抑制活性檢測

采用Griess法對分離化合物1～5進行體外抗炎活性篩選，評價其抑制NO生成活性。將小鼠RAW264.7巨噬細胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS進行誘導刺激，同時加入待測化合物(2.5、5.0、10.0和20.0 μM)處理，設置不含藥物組和L-NMMA陽性藥物組做對照。細胞過夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基檢測NO生成，在540 nm處測定吸光值，實驗重復三次。在剩余培養(yǎng)基中加入MTS進行細胞存活率檢測，排除化合物對細胞的毒性影響。NO生成抑制率=[(非藥物處理組OD540nm-樣品組OD540nm)/非藥物處理組OD540nm]× 100%。半數(shù)抑制濃度(IC50，50% concentration of inhibition)按Reed&Muench法計算[13]。

2 結果與討論

2.1 化合物結構解析

化合物1～5的結構如圖1所示(*標示的是新化合物)。

圖1 肉豆蔻果實中化合物1～5的結構Fig.1 Structures of compounds 1-5 from the fruits of M.fragrans

化合物1淡黃色無定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε)202(4.55)，223(3.98)nm；IR(KBr)νmax3 371，2 932，2 848，1 608，1 511，1 450，1 370，1 286，1 238，1 180，1 111，1 029，816；1H和13C NMR見表1。結合HR-EI-MS：m/z258.125 5 [M]+(calcd for C16H18O3，258.125 6)和1H NMR、13C NMR(DEPT)譜，確定分子式為C16H18O3。紅外光譜在νmax3 371cm-1有吸收，表明有羥基的存在。在其1H NMR譜(見表1)中可觀察到一個ABX自旋系統(tǒng)6.70(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.61(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6′)和一個AA′BB′自旋系統(tǒng)7.09(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2″和H-6″)，6.83(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3″和H-5″)以及1個甲氧基信號3.80(3H，s，4″-OMe)。在其13C NMR(DEPT)譜(見表1)中可觀察到14個碳信號，包括10個芳基碳信號[其中δC129.4(d，C-2″和C-6″)和113.9(d，C-3″和C-5″)分別為兩個碳信號的重疊，即這10個芳基碳信號共包含12個碳原子]，3個亞甲基和1個甲氧基。綜合以上的高分辨質譜和核磁數(shù)據(jù)分析，可以推測化合物1是二芳基丙烷類化合物。

表1 化合物1的1H(500 MHz)和13C(125 MHz)NMR的核磁數(shù)據(jù)(CDCl3)Table 1 1H (500 MHz) and 13C (125 MHz) NMR data of compound 1 (CDCl3)

通過文獻查閱比較化合物1和已報道的化合物horsfielenide E(1-(3′,4′-methylenedioxyphenyl)-3-(4′′-methoxyphenyl)propane)[15]的1H NMR和13C NMR(DEPT)譜數(shù)據(jù)，可以看出化合物1和horsfielenide E具有相似的分子骨架，兩者不同之處在于horsfielenide E的C-3′和C-4′位連接的是亞甲二氧基(-OCH2O-)，而化合物1的C-3′和C-4′分別為酚羥基取代。

通過二維核磁1H-1H COSY、HSQC、HMBC譜對化合物的碳、氫信號進行了全歸屬(見表1)。在1H-1H COSY譜中(見圖2)，H-1/H-2，H-2/H-3的相關信號確證了C1-C2-C3的連接方式。在HMBC譜中，δH2.52(2H，t，J= 7.5 Hz，H-1)與135.8(s，C-1′)，115.7(d，C-2′)，121.0(d，C-6′)有相關信號，表明C-1連接在一個芳環(huán)的C-1′位上；2.57(2H，t，J= 7.5 Hz，H-3)與134.6(s，C-1″)，129.4(d，C-2″和C-6″)有相關信號，表明C-3連接在另一個芳環(huán)的C-1″上。3.80(3H，s，4″-OMe)與157.8(s，C-4″)有相關信號，表明甲氧基連接在C-4″上。綜上所述，化合物1的被確定為如圖1所示結構，命名為1-(3′,4′-dihydroxyphenyl)-3-(4″-methoxyphenyl)-propane?；衔?的詳細結構鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1關鍵的1H-1H COSY和HMBC相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations for 1

化合物2無色無定形粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.02(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.83(1H，d，H-5′)，6.74(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2′)，6.70(1H，dd，J= 8.0，1.9 Hz，H-6′)，6.44(1H，dd，J= 8.2，2.5 Hz，H-5″)，6.40(1H，d，J= 2.5 Hz，H-3″)，3.88、3.75(各3H，s，3′，4″-OMe)，2.75～2.51(4H，m，H-1，3)，2.09～1.70(2H， m， H-2)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.2(s，C-4″)，154.6(s，C-2″)，146.7(s，C-3′)，144.9(s，C-4′)，134.5(s，C-1′)，130.7(d，C-6″)，121.5(s，C-6′)，120.8(d，C-1″)，114.6(d，C-5′)，111.4(d，C-2′)，106.3(d，C-5″)，102.2(d，C-3″)，56.0(q，C-4″-OMe)，55.3(q，C-3′-OMe)，35.4(d，C-3)，32.0(d，C-1)，28.9(d，C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16,17]報道基本一致，故鑒定化合物2為1-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-3-(2″-hydroxy-4″-methoxyphenyl)-propane。

化合物3無色油狀物；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.07(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，6.97(1H，J= 8.4 Hz，H-6″)，6.90(1H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6′)，6.83(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′)，6.44(1H，dd，J= 8.4，2.6 Hz，H-5″)，6.38(1H，d，J= 2.5 Hz，H-3″)，4.96(1H，dd，J= 10.3，2.3 Hz，H-1)，3.86(3H，s，3′-OMe)，3.74(3H，s，4″-OMe)，2.93～2.86(1H，m，H-3a)，2.70(1H，dt，J= 16.2，4.3 Hz，H-3b)，2.17～2.12(1H，m，H-2a)，2.05～1.98(1H，m，H-2b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：160.1(s，C-4″)，157.0(s，C-2″)，148.3(s，C-3′)，147.3(s，C-4′)，134.3(s，C-1′)，130.9(d，C-6″)，119.7(d，C-6′)，115.5(d，C-5′)，114.7(s，C-1″)，110.6(d，C-2′)，107.7(d，C-5″)，102.4(d，C-3″)，78.6(d，C-1)，56.3(q，C-3′-OMe)，55.4(q，C-4″-OMe)，30.8(t，C-3)，25.1(t，C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物3為horsfielenidine A。

化合物4淡黃色無定型粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.91(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.69～6.65(3H，m，H-2′，5′，6′)，6.51(1H，d，J= 1.8 Hz，H-3″)，6.42(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-5″)，5.92(2H，s，H-7(-OCH2O-)，4.10(1H，m，H-2)，3.77(3H，s，4″-OMe)，2.76～2.54(4H，m，H-1，3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.9(s，C-4″)，156.6(s，C-2″)，147.5(s，C-3′ or 4′)，145.8(s，C-C-4′ or 3′)，132.0(s，C-1′)，131.4(d，C-6″)，122.2(d，C-6′)，117.3(s，C-1″)，109.5(d，C-2′ or 5′)，108.5(d，C-5′ or 2′)，106.2(d，C-5″)，102.8(d，C-3″)，100.8(t，C-7′-OCH2O-)，74.9(d，C-2)，55.2(q，C-4″-OMe)，42.9(t，C-1 or 3)，38.1(t，C-3 or 1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物4為1-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)-3-(3″,4″-methylenedioxyphenyl)-propan-2-ol。

化合物5黃色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.83(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2′)，6.80(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.73(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.66(1H，dd，J= 8.0，1.9 Hz，H-6′)，6.34(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3″)，6.26(1H，dd，J= 8.1，2.5 Hz，H-5″)，4.13～4.09(1H，m，H-2)，3.82(3H，s，3′-OMe)，2.78～2.63(4H，m，H-2，H-3)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：158.3(s，C-4′′)，158.1(s，C-2′′)，148.2(s，C-3′)，145.9(s，C-4′)，133.0(d，C-6′′)，131.3(s，C-1′)，122.9(d，C-6′)，117.8(s，C-1′′)，115.7(d，C-5′)，114.0(d，C-2′)，107.5(d，C-5′′)，104.6(d，C-3′′)，75.2(d，C-2)，56.3(q，3′-OMe)，43.9(t，C-1)，39.1(t，C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物5為virolanol B。

2.2 抗炎活性評價

采用Griess法測定了化合物1對小鼠RAW264.7巨噬細胞NO生成抑制活性的篩選，結果見表2。與陽性對照一氧化氮合酶抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA，IC50=10.18 μmol/L)相比，化合物1對RAW264.7細胞有明顯的NO生成抑制作用(IC50=4.00 μmol/L)。

表2 化合物1體外NO生成抑制活性Table 2 In vitro NO production inhibitory activities of compound 1

3 結論

本文對肉豆蔻果實70%丙酮提取物的乙酸乙酯部位進行了化學成分的研究，共分離和鑒定了5個二芳基丙烷類化合物，其中化合物1為新化合物。對化合物的NO生成抑制活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物1(IC50=4.00 μmol/L)對小鼠RAW264.7巨噬細胞的NO生成抑制作用明顯強于陽性對照L-NMMA(IC50=10.18 μmol/L)。本研究結果可以為拓寬中藥肉豆蔻抗炎的藥用范圍提供物質基礎。