張 捷，劉洪新，劉昭明，李賽妮，陳玉嬋，章衛(wèi)民*，郭波紅

1廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；2廣東省科學(xué)院微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

中藥砂仁屬于姜科(Zingiberaceae)植物成熟的果實(shí)，廣泛分布于中國南方地區(qū)，老撾、越南、柬埔寨、泰國。以廣東省陽春市所產(chǎn)的陽春砂仁最為有名，春砂仁具有化濕和胃，理氣安胎等功效[1-3]。寄生于春砂仁根部內(nèi)生真菌也成為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎及活性顯著的研究對象，植物內(nèi)生真菌是寄居在植物組織與植物共生的真菌種類[4]，植物內(nèi)生真菌具有豐富的物種多樣性，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜、活性多樣的次生代謝產(chǎn)物，因此已成為發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源[5]。真菌Letendraeahelminthicola屬于稀缺的種屬[6]，有研究報道[7,8]表明與海綿相關(guān)的該種屬真菌產(chǎn)生了兩個具有污水防治作用的化合物3-methyl-N-(2-phenylethyl) butanamide和cyclo(D-Pro-D-Phe)；Huang等[9]報道了從海蟹腸道真菌Letendraeasp.分離到兩個新的含有苯二氫比喃環(huán)和四氫呋喃環(huán)骨架的螺環(huán)聚酮立體異構(gòu)體letenketals A和B，經(jīng)過抗菌和抗腫瘤活性測試顯示幾乎沒有抗菌活性，在40 μM時有較弱的抗腫瘤作用；Xu等[10]從海洋來源的真菌Letendraeasp.5XNZ4-2中分離得到七個新的聚酮類化合物，分別是phomopsiketones D～G和letendronols A～C，其中phomopsiketone E顯示較弱的抑制脂多糖活化巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生的活性。本課題組以從春砂仁中分離得到的一株內(nèi)生真菌LetendraeahelminthicolaA696為研究對象，對其化學(xué)成分及抗腫瘤和抗菌活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

核磁共振波譜儀(AVANCE Ⅲ型400 MHz或AVANCE Ⅲ型600 MHz，瑞士Brucker公司)；液質(zhì)聯(lián)用儀(12900-6430A三重四級桿型，美國Agilent Technologies公司)；高效液相色譜儀(LC 3000制備型，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；高效液相色譜儀(LC-20A半制備型，日本島津公司)；YMC-pack ODS-AQ制備柱(250 mm × 20 mm，5 μm)；YMC-pack ODS-AQ半制備柱(250 mm × 10 mm，5 μm)(日本YMC公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(OSB-2100型，日本東京理化器械株式會社)；大容量普通搖床(PZ1000B旋轉(zhuǎn)式，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)；Sephadexdex LH-20(18～110 μm，瑞典Amersham Bioscience公司)；C18反相硅膠(40～75 μm，日本富士硅化學(xué)株式會社)；柱色譜硅膠(100～200、200～300目，山東青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板(GF254，德國 Merck公司)；石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、甲醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈、正己烷、異丙醇(色譜純，美國BCR公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

春砂仁內(nèi)生真菌A696于2016年4月自廣東省陽春市馬水鎮(zhèn)采集的春砂仁根分離得到，春砂仁由廣東藥科大學(xué)嚴(yán)寒靜教授鑒定為Amomumvillosum。將分離得到的菌株通過液氮凍融法提取菌株的基因組DNA，采用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增其rDNA ITS區(qū)，并對產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交GenBank，登錄號為KU529827，通過BLAST(核苷酸序列比對程序)進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示該菌株與LetendraeahelminthicolaB1A0062SNA2CC1081(GenBank號：KP263123)的序列相似度為100%，因此該菌株被鑒定為Letendraeahelminthicola，菌株保藏于廣東省科學(xué)院微生物研究所。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VitB110 mg/L、海鹽 0.3%。

1.3.2 發(fā)酵條件

在無菌條件下，將活化后的菌株接種至裝有250 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在28 ℃、120 rpm條件下振蕩培養(yǎng)5天，獲得種子液。將適量種子液轉(zhuǎn)接到裝有1.5 L馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的3 L三角瓶中，在相同條件下培養(yǎng)20天，共發(fā)酵55 L。

1.4 分離純化

將A696菌株發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，分別得到濾液和菌絲體。用等體積的乙酸乙酯萃取濾液3次，再減壓回收溶劑后得浸膏7.5 g。浸膏經(jīng)硅膠柱層析(100～200目)，以石油醚-乙酸乙酯，體積比1∶0→1∶3梯度洗脫，并用薄層色譜(TLC)檢測，合并相似組分，得到7個粗組分Fr.1～7。Fr.1經(jīng)正相硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比20∶1→5∶1)得到Fr.1.2，F(xiàn)r.1.2通過Ace 5 C18PFP半制備柱(乙腈-水，體積比7∶1，2.0 mL/min)到化合物2(2.2 mg)。Fr.3經(jīng)硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，10∶1→3∶1)得到Fr.3.1，F(xiàn)r.3.1通過Ace 5 C18PFP半制備柱(乙腈-水，體積比60∶40，2.0 mL/min)得到化合物3(1.2 mg)。Fr.5組分通過硅膠柱正相柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比10∶1→1∶1)得到Fr.5.1、Fr.5.2和Fr.5.3。Fr.5.1通過Sephadex LH-20純化得到化合物8(3.5 mg)；Fr.5.2通過半制備柱(正己烷/異丙醇，體積比5∶1，2.0 mL/min)得到化合物6(2.4 mg)；Fr.5.3通過C18半制備柱(甲醇-水，體積比45∶55，2.0 mL/min)分別得到化合物5(1.8 mg)，化合物4(1.2 mg)，化合物7(1.5 mg)。Fr.7經(jīng)正相硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比5∶1→1∶3)得到Fr.7.2；Fr.7.2通過Schiral A半制備柱(正己烷-異丙醇，體積比5∶1，2.0 mL/min)得到Fr.7.2.1。Fr.7.2.1經(jīng)Sephadex LH-20柱純化后得到化合物1(3.1 mg)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-8

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(CD3OD)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖2 化合物1的1H-1H COSY and HMBC的主要相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物2棕色油狀物;ESI-MS：m/z291.3 [M-H]-，分子式C18H28O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.84(2H，s，H-2，6)，1.42(18H，s，H-8，8′)，2.87(2H，m，H-9)，2.61(2H，m，H-10)，3.69(3H，s，H-12)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：151.9(C-4)，135.8(C-3)，131.1(C-1)，124.4(C-2，6)，34.2(C-7，7′)，30.9(C-8，8′)，36.3(C-9)，30.9(C-10)，51.5(C-12)，173.6(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定化合物2為3-(2,6-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸甲酯。

化合物3黃色油狀物;ESI-MS：m/z175 [M + Na]+，分子式C8H8O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.23(1H，dq，J=6.7，1.4 Hz，H-4)，6.93(1H，d，J=6.7 Hz，H-5)，2.46(3H，s，H3-2′)，2.14(3H，s，H3-3′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：161.3(C-2)，137.8(C-3)，138.0(C-4)，107.3(C-5)，153.0(C-6)，191.4(C-1′)，25.6(C-2′)17.5(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照基本一致，故鑒定化合物3為gibepyrone F。

化合物4無色油狀物;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.41(1H，dt，J=7.1,1.1 Hz)，6.71(1H，d，J=7.0 Hz)，6.61(1H，s，H-8)，2.36(3H，s，H-7)，2.11(3H，s，H-3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.02(C-9)，166.78(C-2)，161.06(C-6)，146.06(C-7)，143.79(C-4)，130.55(C-3)，122.60(C-8)，109.76(C-5)，19.23(3-CH3)，16.09(7-CH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對照基本一致，故鑒定化合物4為gibepyrone D。

化合物5白色粉末;分子式C7H6O4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.78 (1H，s，H-7)，7.79(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，5)，6.93(2H，d，J=8.6 Hz，2H，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：192.8(C-7)，165.2(C-4)，133.4(C-2，6)，130.3(C-1)，116.9(C-3，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[15]基本一致，將鑒定化合物5為對羥基苯甲醛。

化合物6白色粉末;ESI-MS：165 [M-H]-，分子式C9H10O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.77(2H，d，8.4 Hz，H-3，5)，3.69(3H，s，OMe)，3.55(2H，s，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.8(C-8)，155.1(C-4)，130.8(C-1)，126.4(C-2，6)，115.8(C-3，5)，52.4(OMe)，40.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[16]一致，將化合物6鑒定為對甲氧基苯乙酸。

化合物7白色粉末;ESI-MS：m/z175.1 [M+Na]+，分子式為C8H8O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.55(2H，s，H-7)，7.09(2H，m，H-2，6)，6.74(2H，t，J=7.5，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：176.2(C-8)，156.6(C-4)，131.9(C-2)，129.0(C-6)，122.7(C-1)，120.2(C-3)，115.8(C-5)，36.5(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道一致，故鑒定化合物7為間羥基苯乙酸。

化合物8棕色固體物質(zhì);ESI-MS：m/z395.1 [M-H]-，分子式為C28H44O。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.62(3H，s，H3-18)，0.83(6H，d，J=6.4 Hz，H3-26,H3-27)，0.9(3H，d，J=6.9 Hz，H3-28)，0.94(3H，s，H3-19)，1.03(3H，d，J=6.7 Hz，H3-21)，3.63(1H，m，H-3)，5.19(2H，dd，J=9.2，7.1Hz，H-22/H-23)，5.38(1H，m，H-7)，5.57(1H，m，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：12.2(C-18)，16.4(C-19)，17.8(C-28)，19.8(C-21)，20.1(C-26)，21.2(C-11，C-15),23.1(C-27)，28.4(C-12)，32.1(C-2)，33.2(C-25)，37.1(C-10)，38.5(C-1)，39.2(C-16)，40.6(C-20)，40.9(C-4)，42.9(C-24，C-13)，46.3(C-9)，54.7(C-14)，55.8(C-17)，70.6(C-3)，116.4(C-7)，119.7(C-6)，132.1(C-23)，135.7(C-22)，139.9(C-8)，141.5(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道的基本一致，故鑒定化合物8為麥角甾醇。

2.2 細(xì)胞毒和抗菌活性測試

采取SRB法[19]測試化合物1～5對四種腫瘤細(xì)胞株包括人神經(jīng)癌細(xì)胞(SF-268)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人肝癌細(xì)胞(HepG-2)和人肺癌細(xì)胞株(A594)的細(xì)胞毒活性，結(jié)果顯示：化合物1～5在100 μg/mL下對四種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制率均在20%以下，陽性對照為順鉑(IC50：3.20 μM)，表明無細(xì)胞毒活性。

采用微量稀釋法[20]測定化合物1～5對銅綠假單胞桿菌CMCC10104(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌CMCC44102(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌CMCC26003(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌CMCC63501(Bacillussubtilis)的抗菌活性，結(jié)果顯示化合物1～5在濃度為100 μg/mL時對上述受試菌的抑制率低于40%，陽性對照為氨芐西林(MIC：1 μg/mL)，表明化合物1～5無抗菌活性。

3 討論與結(jié)論

真菌Letendraeahelminthicola屬于稀缺的微生物種屬，本文是關(guān)于該屬真菌關(guān)于次級代謝產(chǎn)物的第四次報道，該屬真菌產(chǎn)生過二酮哌嗪類、螺環(huán)聚酮類化合物[7-10]，本研究從春砂仁內(nèi)生真菌A696發(fā)酵液中分離得到8個單體化合物，豐富了該屬真菌的次級代謝產(chǎn)物類型，其中化合物1為新的倍半萜類化合物；化合物2是一種抗氧化劑，也是合成抗氧化劑1076和1010等的主要原料；化合物3和4均為α-吡喃酮結(jié)構(gòu)化合物，化合物3被報道是首次從天然產(chǎn)物中分到的α-吡喃酮結(jié)構(gòu)，通常以gibepyrone B為原料進(jìn)行合成；化合物5、6、7均為芳香苯環(huán)小分子化合物；化合物8為麥角甾醇，在醫(yī)藥化學(xué)上已經(jīng)得到應(yīng)用，已經(jīng)做為維生素D2的前體，也是生產(chǎn)激素類藥物中間體。該菌的粗提物顯示一定的抗菌抗腫瘤活性，但化合物1通過活性測試發(fā)現(xiàn)沒有抗菌和抗腫瘤活性，很可能是一些具有抗菌抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物并沒有從粗提物中成功分離到。因此，可以從發(fā)酵產(chǎn)物量上進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，以期得到活性次級代謝產(chǎn)物；本次液體發(fā)酵的時間長達(dá)20天可能也是導(dǎo)致培養(yǎng)基中產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)簡單的基本代謝產(chǎn)物的原因，這為以后的發(fā)酵時長提供前車之鑒；另一方面，研究表明倍半萜類化合物具有抗菌、抗癌、殺蟲、調(diào)節(jié)植物生長等活性[21]，今后可以對該化合物進(jìn)行其他活性測試，以挖掘該化合物其他的生物活性。