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        九蒸九曬熟地黃中的紫羅蘭酮類化合物

        2021-06-07 02:47:06張靖柯呂錦錦魏俊俊鄭曉珂馮衛(wèi)生
        關(guān)鍵詞:信號(hào)

        張靖柯,呂錦錦,李 孟,魏俊俊,鄭曉珂,馮衛(wèi)生

        河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心,鄭州 450046

        地黃是玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根,在中國傳統(tǒng)用藥中具有幾千年的藥用歷史。產(chǎn)地主要集中在河南、山西、山東等地,以河南焦作為其道地產(chǎn)區(qū),目前各地也多有栽培。在臨床用藥中,地黃有鮮地黃,生地黃以及熟地黃三種飲片形式,其臨床應(yīng)用以及藥性藥效均存在較大的差異。鮮地黃味甘,性苦、寒。歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱生津,涼血止血的功效。生地黃味甘性寒。歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱涼血,養(yǎng)陰生津的功效。熟地黃Rehmanniae Radix Praeparata為生地黃的炮制加工品,味甘性微溫,歸肝、腎經(jīng)。補(bǔ)血滋陰,益精填髓[1]。前期課題組對(duì)鮮地黃、地黃葉以及生地黃都進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究[2-6],并且從九蒸九曬熟地黃中也分離得到了6個(gè)生物堿類化合物[7]。目前研究報(bào)道熟地黃主要含有多糖類[8],苯乙醇苷類[9]、核苷類[10]、環(huán)烯醚萜類[11]、紫羅蘭酮類[12]以及多種微量元素等化合物。熟地黃現(xiàn)代藥理活性主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗抑郁和抗突變[13-16]等方面的作用。

        紫羅蘭酮類化合物廣泛存在于地黃屬植物中,具有環(huán)化異戊二烯結(jié)構(gòu)單元,有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[17,18]。有研究表明[19]紫羅蘭酮類化合物對(duì)鼠黑色素瘤(B16)細(xì)胞具有抑制作用。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)從九蒸九曬熟地黃中分離得到的紫羅蘭酮類化合物進(jìn)行了人黑色素瘤A375細(xì)胞細(xì)胞毒活性的篩選研究。豐富和完善了“九蒸九曬”熟地黃的相關(guān)化學(xué)成分研究,并為其開展進(jìn)一步的抗腫瘤研究提供一定的參考價(jià)值。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 儀器

        Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))(Bruker);Bruker maxis HD mass spectrometer,Shimadzu UV-2401PC apparatus;Waters Alliance系列2695高效液相系統(tǒng);Thermo NicoletIS 10紅光譜儀(美國);旋光儀(Rudolph,美國);Thermo EVO 300紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific,美國);LC-52半制備液相色譜儀(賽普銳思科技有限公司);Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(德國);CHIRALPAK AD-H色譜柱(大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本,東京理化);二氧化碳培養(yǎng)箱(上海STIK);超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán));倒置顯微鏡(Nikon)。

        1.1.2 試劑

        柱層析填料Diaion HP-20(日本,三菱化學(xué)公司);Toyopearl HW-40(日本,TOSOH公司);Sephadex LH-20(瑞士,Parmacia Biotech公司);柱層析用硅膠(100~200、200~300目)、薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)。

        甲醇(色譜純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甲醇(分析純,天津市富宇化工有限公司);乙腈(色譜純,美國天地有限公司);A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT);培養(yǎng)皿(Corning);E-Plate板96孔板;胰蛋白酶;DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);DMSO(Solarbio);PBS緩沖液等為自配。

        1.1.3 藥材

        本實(shí)驗(yàn)所用熟地黃2017年8月購自河南省禹州市青山藥業(yè)有限公司(經(jīng)九蒸九曬方法炮制),標(biāo)本(編號(hào)20170907)存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 提取和分離

        干燥熟地黃飲片10 kg,剪碎后加10倍量70%的含水丙酮加熱回流提取3次,提取液過濾,合并濾液進(jìn)行減壓濃縮,真空干燥,得到熟地黃總提取物浸膏4.4 kg。將總提物浸膏加3 L水溶解分散,加95%乙醇調(diào)節(jié)至醇濃度80%進(jìn)行醇沉,靜置24 h后,取上清液,減壓濃縮得到總浸膏。浸膏加8 L水溶解,然后經(jīng)Diaion HP-20大孔吸附樹脂柱,依次用水、10%、20%、30%、50%、70%以及95% EtOH進(jìn)行梯度洗脫,得到7個(gè)洗脫組分,即Fr.1~Fr.7。20% EtOH(Fr.3)水溶解后用Sephadex LH-20凝膠柱[甲醇∶水(V/V)=0∶100→100∶0] 梯度洗脫,洗脫組分經(jīng)薄層硅膠色譜檢識(shí),合并相同組分得到Fr.3-1~Fr.3-4。其中Fr.3-1組分5%甲醇溶解用中壓制備(ODS)柱,甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫得到Fr.3-1-1~3-1-3。Fr.3-1-2經(jīng)半制備液相Reprosil-Pur 120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=12∶88)流速為:3 mL/min,保留時(shí)間(tR=27.87 min)洗脫得到化合物1(3.40 mg)。Fr.3.3溶解后經(jīng)Toyopearl HW-40C凝膠柱,30%甲醇洗脫得到Fr.3-3-1~Fr.3-3-4。Fr.3-3-2用半制備液相Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=10∶90)流速:3 mL/min,保留時(shí)間(tR=21.36 min)得到化合物2(4.23 mg)。95% EtOH洗脫組分(Fr.7)甲醇溶解后上硅膠柱。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫得到Fr.7-1~Fr.7-4。其中Fr.7-1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱甲醇洗脫,得到Fr.7-1-1。Fr.7-1-1甲醇溶解,進(jìn)行硅膠柱層析,二氯甲烷-甲醇(40∶1)等度洗脫,最終得到化合物3(7.91 mg)。

        1.2.2 細(xì)胞毒活性檢測(cè)

        采用MTT法探究化合物1~3對(duì)A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用[20]。將A375細(xì)胞置于培養(yǎng)基中37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,接種于E-Plate 96孔板中,24 h后,實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組和三個(gè)給藥組?;衔?~3(25 μM)分別刺激A375細(xì)胞48 h,通過MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

        1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        利用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,分析數(shù)據(jù)顯著性差異,P< 0.01表明具有極顯著性差異。

        2 結(jié)果

        2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

        2.1.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

        化合物1無色結(jié)晶性粉末; -64.0(c0.02,CH3OH);HR-ESI-MS:m/z469.203 9 [M+Na]+(calcd for C21H34O10Na,469.204 4)確定化合物的分子式為C21H34O10;UVλmax(CH3OH)/nm(logε)197(0.35),263(1.05);IRνmax:3 387、2 929、1 679、1 522、1 459、1 263、1 078、849 cm-1;IR光譜提示存在羥基(3 387 cm-1)和羰基信號(hào)(1 611 cm-1);1H NMR(500 MHz,CD3OD):δ6.68(1H,d,J=16.1,H-7)和6.39(1H,d,J=16.1 Hz,H-8)提示化合物中存在一個(gè)反式雙鍵;δH5.80(1H,s,H-10)推測(cè)為雙鍵上的氫信號(hào);δH1.03(3H,s,1α-CH3)、0.89(3H,s,1β-CH3)、0.96(3H,s,5-CH3)以及2.30(3H,s,9-CH3)為四個(gè)甲基氫信號(hào);δH4.30(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′)為糖的端基氫信號(hào),δH3.85(1H,d,J=11.8 Hz,H-6′a)和3.67(1H,dd,J=11.8,5.3 Hz,H-6′b)為葡萄糖6位特征氫信號(hào),結(jié)合δH3.18~3.73(4H,m,H-2′~5′)推測(cè)該化合物中存在一個(gè)葡萄糖的結(jié)構(gòu)片段。根據(jù)偶合常數(shù)J=7.8 Hz,判斷該葡萄糖為β構(gòu)型。13C NMR(125 MHz,CD3OD)共顯示21個(gè)碳信號(hào),結(jié)合DEPT 135譜可知,δC18.8(1α-CH3)、22.7(1β-CH3)、26.9(5-CH3)和14.3(9-CH3)為4個(gè)甲基信號(hào);δC27.0(C-3),35.9(C-4),62.8(C-6′)為3個(gè)仲碳信號(hào);δC85.4(C-2),139.3(C-7),134.6(C-8),119.7(C-10),106.6(C-1′),75.4(C-2′),78.2(C-3′),71.7(C-4′),77.7(C-5′)為9個(gè)叔碳信號(hào);δC45.2(C-1),75.6(C-5),82.4(C-6′),153.8(C-9),170.7(C-11)為5個(gè)季碳信號(hào);其中δC170.7為-COOH的特征碳信號(hào),結(jié)合其信號(hào)特征,推測(cè)該化合物可能為倍半萜苷類化合物(見圖1)。將其碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]中sec-hydroxyaeginetic acid進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)化合物1中多一組葡萄糖的碳信號(hào)(δC106.6、75.4、78.2、71.7、77.7、62.8)且δC74.5(C-2)處的碳信號(hào)向低場(chǎng)區(qū)發(fā)生位移至δC85.4處,根據(jù)苷化位移以及HMBC譜,葡萄糖端基氫δH4.30(H-1′)與δC85.4(C-2)處的碳遠(yuǎn)程相關(guān)(見圖2),確定葡萄糖連接在sec-hydroxyaeginetic acid苷元的C-2位上。

        圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compound 1

        圖2 化合物1的HMBC、1H-1H COSY相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

        化合物1的相對(duì)構(gòu)型主要是通過NOESY譜進(jìn)行確定。在NOESY譜中,δH3.53(H-2)與δH0.82(1β-CH3)、3.78(6-OH)具有NOE關(guān)系位于同側(cè),并且3.78(6-OH)與0.90(5-CH3)、δH3.53(H-2)具有NOE相關(guān),由此可判斷H-2/1β-CH3/5-CH3/6-OH空間取向一致為β;同時(shí)δH4.14(5-OH)與δH1.04(1α-CH3)具有NOE關(guān)系提示5-OH/1α-CH3位于一側(cè)為α。由此可以判斷化合物1的相對(duì)構(gòu)型。根據(jù)以上解析,確定化合物1的結(jié)構(gòu)。經(jīng)查閱scifinder未見相關(guān)報(bào)道,確定為新化合物并將其命名為sec-hydroxyaeginetic acid-2-O-β-D-glucopyranoside,其碳?xì)鋽?shù)據(jù)歸屬見表1?;衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

        表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H and 13C NMR spectroscopic data of compound 1

        化合物2無定型粉末; -76.5(c0.018,CH3OH);HR-ESI-MS:m/z323.146 3 [M+Na]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:3.50(1H,d,J=9.8 Hz,H-2),3.86(1H,m,H-3),1.90(1H,t,H-4α),1.81(1H,dd,J=13.0,4.8 Hz,H-4β),6.68(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),6.40(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),5.80(1H,s,H-10),2.30(3H,s,H-12),1.12(3H,s,1α-CH3),0.90(3H,s,1β-CH3),1.07(3H,s,5-CH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:45.6(C-1),79.4(C-2),69.3(C-3),44.1(C-4),77.1(C-5),81.9(C-6),139.3(C-7),134.8(C-8),153.7(C-9),119.8(C-10),170.6(C-11),14.2(C-12),18.9(1α-CH3),23.3(1β-CH3),26.9(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[22],確定化合物為frehmaglutin A。

        化合物3無色晶體; -32.1(c0.025,CH3OH);HR-ESI-MS:m/z249.146 4 [M+Na]+;1H NMR(500 MHz,CD3OD),δ:1.17(1H,m,H-2a),1.69(1H,m,H-2b),1.89(1H,m,H-3a),1.38(1H,m,H-3b),1.47(1H,m,H-4a),1.80(1H,m,H-4b),7.42(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.32(1H,d,J=16.2 Hz,H-8),δH2.30(3H,s,H-10),1.24(3H,s,1α-CH3),0.80(3H,s,1β-CH3),1.06(3H,s,5-CH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD),δ:39.6(C-1),37.3(C-2),18.9(C-3),36.6(C-4),75.5(C-5),80.6(C-6),153.3(C-7),131.8(C-8),201.4(C-9),δC27.4(C-10),25.7(1α-CH3),27.4(1β-CH3),27.0(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[21],確定化合物為dihydroxy-β-ionone。

        2.1.2 酸水解

        化合物1(1 mg),加入1 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L),加熱回流3 h,所得水解液用乙酸乙酯萃取3次,將水層濃縮至干[23]。加少量乙醇溶解,經(jīng)HPLC分析采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,色譜柱為CHIRALPAKAD-H(250 mm × 4.6 mm),流動(dòng)相為正己烷-乙醇-三氟乙酸(750∶250∶0.25),流速0.5 mL/min。通過比較樣品與D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,確定化合物1中葡萄糖的絕對(duì)構(gòu)型為D-葡萄糖(tR=18.3 min,D-glucose)。

        2.1.3 絕對(duì)構(gòu)型的確定

        化合物1的絕對(duì)構(gòu)型通過與文獻(xiàn)對(duì)比ECD圖譜確定。在ECD譜中(見圖3),222 nm處有一個(gè)正的Cotton效應(yīng),265 nm處有一個(gè)負(fù)的Cotton效應(yīng),與sec-hydroxyaeginetic acid[21]的ECD圖譜一致從而確定該化合物的絕對(duì)構(gòu)型為2S,5R,6R。

        圖3 化合物1的ECD譜圖Fig.3 ECD spectra of the compound 1

        2.2 細(xì)胞毒活性

        本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了從九蒸九曬熟地黃中分離得到的三個(gè)紫羅蘭酮類化合物的細(xì)胞毒活性,結(jié)果顯示,化合物1~3在25 μM濃度下能顯著性降低人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的細(xì)胞活力,提示其可能具有抗人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的活性(如表3所示)。

        表3 化合物1~3對(duì)A375細(xì)胞活力的影響Table 3 Cytotoxic activity of compounds 1-3 on A375 cells

        3 結(jié)論與討論

        地黃為玄參科地黃屬植物地黃的新鮮或干燥塊根,經(jīng)炮制加工以鮮地黃,生地黃以及熟地黃三種飲片形式應(yīng)用于臨床。地黃在炮制加工過程中,其藥性藥效均發(fā)生了改變,這種改變可能與其內(nèi)在化學(xué)成分的改變密切相關(guān)。有研究表明[24],炮制加工過程中熟地黃5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量顯著高于生地黃,Zou等[25]利用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定熟地黃中4種苯乙醇苷研究,結(jié)果表明地黃經(jīng)炮制加工后4種苯乙醇苷成分含量均有所下降。Li等[26]研究表明,生地黃中的地黃苷A和地黃苷D的含量均比熟地黃中含量高。Jia等[14]對(duì)鮮地黃,生地黃和熟地黃中水蘇糖在炮制過程中的變化研究,結(jié)果表明鮮地黃中水蘇糖含量最高,其次是生地黃,熟地黃中含量最低。Zhang等[27]采用HPLC建立了同時(shí)測(cè)定了生地黃和熟地黃中5個(gè)苷類成分含量的方法,為開展生地黃、不同炮制方法制備熟地黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。為補(bǔ)充和完善熟地黃的化學(xué)成分,尋找地黃在炮制過程中的差異性成分,開展熟地黃相關(guān)化學(xué)成分研究是非常有必要的。本實(shí)驗(yàn)建立在前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)九蒸九曬熟地黃進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)成分分離純化研究,分離得到3個(gè)紫羅蘭酮類化合物。并對(duì)其進(jìn)行了A375細(xì)胞毒活性的初步篩選評(píng)價(jià)研究。研究結(jié)果表明化合物1~3均能顯著的抑制A375細(xì)胞活力,具有潛在的抗人黑色素瘤細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)為熟地黃中紫羅蘭酮類化合物對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞毒活性的相關(guān)機(jī)制研究提供參考價(jià)值,也為熟地黃藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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