黃家晉，黃智霖，陳鴻庚，劉 坤，王立抗，郅 慧，丁利君，鄭俊霞*

1廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院；2廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

涼粉草(MesonachinensisBenth.)，是唇形科涼粉草屬草本植物，分布在印度東北部，東南亞和中國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東、廣西和云南。涼粉草作為一種中藥材，被譽(yù)為“仙草”，具有收斂、甘甜、清寒、清熱、涼血、解毒的功效[1]，并且已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為食品、天然保健品甚至是臨床藥品?，F(xiàn)有研究證明，它的根、莖、葉及花各個(gè)組織含有大量的生物活性物質(zhì)，包括多糖、黃酮、萜類(lèi)、維生素和酚類(lèi)[2]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥保健價(jià)值。

酚類(lèi)化合物對(duì)植物的生長(zhǎng)起著重要的作用，對(duì)人體的各個(gè)器官也有十分強(qiáng)的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，有學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)涼粉草含有降血糖和高血壓物質(zhì)，包括β-谷甾醇、豆甾醇、α-和β-淀粉蛋白、齊墩果酸、馬兜鈴酸和β-谷甾醇糖苷[3]。同時(shí)，也有學(xué)者從涼粉草的水提液中鑒定出山奈酚、芹菜素、咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、齊墩果酸和熊果酸九種活性化合物[4]，其中咖啡酸、原兒茶酸、山奈酚等被認(rèn)為是涼粉草抗氧化活性的重要組成部分，包括降低LDL氧化和炎癥，從而提供預(yù)防心血管疾病的保護(hù)。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)，具有靈敏度高、分辨率高、分離效率高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[5]，同時(shí)還能得到化合物的分子量、元素組成以及離子碎片等信息，可快速確定化合物的結(jié)構(gòu)，在藥物分析領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。目前尚不完全了解涼粉草多酚的成分，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)涼粉草中的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地定性分析，為涼粉草酚類(lèi)化學(xué)成分的研究提供重要參考。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

涼粉草樣品于2019年6月采自福建省龍巖市，經(jīng)暨南大學(xué)張英副教授鑒定為涼粉草(MesonachinensisBenth.)。

1.2 主要試劑

乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、甲酸(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、甲醇(色譜純)瑞典Oceanpak公司；單體對(duì)照品：caffeic acid、quercetin-3-O-rutinoside、isoquercetin、quercetin和kaempferol國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(純度≥98.0%)；AB-8大孔樹(shù)脂購(gòu)自東鴻化工有限公司；純水為Milli-Q系統(tǒng)純化水。其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Nexera UHPLC LC-30A+AB SCIEX Triple TOFTM5600+)；PHS-3B雷磁pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ML-104電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10純水系統(tǒng)；普通層析柱(40 mm×60 cm)。

2 方法

2.1 涼粉草多酚提取

將涼粉草全草進(jìn)行清洗后，在陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，切碎，干燥保存。準(zhǔn)確稱(chēng)重涼粉草60 g，用1.5 L去離子水在微沸狀態(tài)下提取3次，每次2 h[6]。參照Li等[7]和Bai等[8]純化方法，略有改動(dòng)，采用AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，按質(zhì)量比1/40(樣品/填料)進(jìn)行上樣，先用去離子水洗至洗脫液無(wú)多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用75%乙醇進(jìn)行多酚化合物的洗脫，將洗脫液富集、濃縮和冷凍干燥得多酚提取物。

2.2 供試品和對(duì)照品溶液的制備

將涼粉草多酚提取物和對(duì)照品用甲醇充分溶解，稀釋至50 μg/mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜即得，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流速為0.3 mL/min。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為3 μL。洗脫液為A，0.1%的甲酸乙腈溶液和B，0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脫條件：0.01～1 min，5%→10%A；1～5 min，10%→30%A；5～8 min，30%A；8～9 min，30%→50%A；9～12 min，50%→60%A；12～20 min，60%→80%A；20～21 min，80%→90%A；21～22 min，90%→95%A[9]。

2.3.2 質(zhì)譜條件

以負(fù)ESI模式運(yùn)行，并配備DuoSprayTM離子源(AB Sciex，加利福尼亞州福斯特城)。 MS-MS檢測(cè)器的條件如下：離子噴霧電壓為-4.5 kV；離子源加熱器，40 ℃；簾氣，35 psi；霧化氣體(GS1)，55 psi；TIS氣體(GS2)，55 psi；碰撞能量(CE)，35 eV；碰撞能量擴(kuò)散(CES)，15 eV。質(zhì)量范圍設(shè)置為m/z100～2 000[9]。采用Peak View分析軟件和Scifinder網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和分析。

3 結(jié)果與討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)測(cè)定涼粉草總酚提取物成分的保留時(shí)間、前體離子、MS/MS產(chǎn)物離子。涼粉草多酚樣品在負(fù)離子模式下的總離子電流色譜圖如圖1所示，共鑒定出51個(gè)化合物，包括8個(gè)苯丙酸、3個(gè)苯丙酸二聚體、4個(gè)苯丙酸三聚體、1個(gè)苯丙酸四聚體、17個(gè)黃酮類(lèi)、7個(gè)酚酸類(lèi)、3個(gè)萜類(lèi)和8個(gè)其它化合物。相關(guān)化合物質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1和圖2。

圖1 涼粉草多酚負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of polyphenols from M.chinensis in negative ion modes

圖2 涼粉草多酚化合物的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of polyphenols from M.chinensis

表1 涼粉草 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析結(jié)果Table 1 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis results of Meisona chinensis

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.1 苯丙酸

在涼粉草多酚樣品中，化合物3、6、7、9、18、42、45和51屬于苯丙酸類(lèi)化合物，分別是丹參素[10]、咖啡酰己糖苷[11]、6,7-二羥基香豆素[11]、咖啡酸、丁香酚[12]、7-羥基香豆素[13]、oleoeuropein aglycone[14]和阿魏酸葡萄糖苷[15]。以咖啡酸和咖啡酰己糖苷為例，二者質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3?？Х弱＜禾擒漳鸽x子[M-H]-為m/z341.087 1，再失去一個(gè)己糖得到碎片m/z179.034 3，這是咖啡酸的母離子?？Х人徇M(jìn)一步裂解，丟失一個(gè)羥基得到m/z161.033 3，m/z135.044 9則是裂解一個(gè)羧基后得到的離子碎片[11]。

圖3 咖啡酸和咖啡酰己糖苷的質(zhì)譜裂解途徑圖Fig.3 Fragmentation pathways of caffeic acid and caffeoyl hexoside

3.2 苯丙酸二聚體

以異迷迭香酸苷[15]和迷迭香酸[15]為苯丙酸二聚體的裂解例子，裂解情況見(jiàn)圖4，異迷迭香酸苷在二級(jí)離子碎片中存在m/z179.034 3，表現(xiàn)為異迷迭香酸苷脫去一個(gè)己糖，得到迷迭香酸(m/z359.077 0)。迷迭香酸進(jìn)一步裂解，得到離子峰為m/z197.045 5的丹參素碎片和m/z161.023 9的碎片，再丟失一個(gè)羰基得到離子碎片m/z135.044 6[15]。同時(shí)，化合物27初步鑒定為丹酚酸F[16]。

圖4 迷迭香酸己糖苷和迷迭香酸的質(zhì)譜裂解途徑圖Fig.4 Fragmentation pathways of rosmarinic acid-O-hexoside and rosmarinic acid

3.3 苯丙酸三聚體

4個(gè)三聚體在涼粉草多酚樣品中被鑒定，分別是紫草酸[17]、丹酚酸H[18]、丹酚酸A[19]和丹酚酸C[11]。丹酚酸C的裂解規(guī)律如圖5，[M-H]-為m/z491.174 2，類(lèi)似迷迭香酸，在丹參素分子處發(fā)生裂解得到m/z179.032 7和311.054 3，進(jìn)一步裂解羧基得到m/z135.045 6和179.032 7。同時(shí)，因碰撞碎裂產(chǎn)生的子離子還有m/z293.044 0和265.049 5[11]。

圖5 丹酚酸C的質(zhì)譜裂解途徑圖Fig.5 Fragmentation pathways of salvianolic acid C

3.4 苯丙酸四聚體

化合物26的母離子[M-H]-為m/z717.145 3，分子式C36H30O16，MS/MS離子產(chǎn)物有m/z519.093 0、339.049 5、321.039 4和179.032 0等，初步鑒定為丹酚酸B[17]，質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 丹酚酸B的質(zhì)譜裂解途徑圖Fig.6 Fragmentation pathways of salvianolic acid C

3.5 黃酮

一共有4個(gè)黃酮類(lèi)化合物被鑒定?；衔?0通過(guò)二級(jí)離子碎片m/z503.116 5、473.107 8和297.078 8，初步鑒定為apigenin-6,8-di-C-hexoside[20]?；衔?1、39和47分別被鑒定為nobiletin、scutellarein和isoscutellarein-8-methyl ether。

12個(gè)黃酮醇類(lèi)化合物在涼粉草多酚中被鑒定。化合物13、15、20、21、34和35都有槲皮素的二級(jí)特征離子m/z301，部分還有m/z295或者255，是槲皮素和它的衍生物，分別被鑒定為槲皮素戊聚糖[13]、蘆丁、槲皮黃苷[22]、quercetin-3-O-hexoside[23]、異槲皮素和槲皮素?；衔?6、24、25、40和44中，幾乎都有m/z285、255和239的特征離子，初步鑒定為aromadendrin-3-O-rutinoside[12]、isomer of kaempferol-3-O-glucoside[24]、紫云英苷[24]、山奈酚和kaempferol-7-O-glucoside[28]。化合物33的母離子[M-H]-為m/z579.315 6，母離子丟失一個(gè)葡萄糖得到m/z399.254 0，初步鑒定為nobiletin-3-O-β-D-glucoside。

1個(gè)二氫黃酮類(lèi)被鑒定?；衔?9的母離子[M-H]-為m/z287.149 7，二級(jí)碎片m/z269.141 1、259.061 0、227.129 1和125.021 1，初步鑒定為紅花素[25]。

3.6 酚酸類(lèi)

一共有7個(gè)酚酸類(lèi)化合物被鑒定。化合物1丟失一個(gè)羧基，生成一個(gè)特征離子m/z123.045 6，同時(shí)擁有特征離子m/z149.025 9、137.025 7、121.030 1和108.022 5，初步鑒定為香草酸[29]?；衔?的母離子[M-H]-為m/z197.045 8，分子式為C9H10O5，母離子丟失一個(gè)羧基得到m/z153.900 7，再失去一個(gè)甲氧基得到m/z123.046 2，初步鑒定為丁香酸[30]?；衔?和5都擁有的特征離子m/z119，是丟失一個(gè)羥基得到的離子，分別被鑒定為原兒茶醛[22]和對(duì)苯酚甲酸[31]?；衔?分子式為C8H8O3，失去一個(gè)甲氧基得到離子m/z121.004 2，初步鑒定為香草醛[21]?；衔?4被鑒定為對(duì)羥基苯甲醛21]。母離子[M-H]-為m/z359.076 4的化合物30，失去一個(gè)葡萄糖得到m/z197.045 1，再失去一個(gè)羧基得到m/z137.032 5，初步鑒定為丁香酸葡萄糖苷[15]。

3.7 萜類(lèi)

化合物17、38和50分別被鑒定為20-去氧鼠尾草酚[16]、3-O-D-glucopyranosyl platycodigenin methyl ester[32]和marstenacigenin A[32]，相關(guān)液質(zhì)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1和圖2。

3.8 其它

化合物12、31、36、41、43、46、48和49分別被鑒定為tuberonic acid glucoside[23]、壬二酸[26]、(E)-10,10-dihydroxy-2-decenoic acid[33]、homoisocitric acid[34]、hydroxy octadecanedioic acid[35]、蓖麻油酸[32]、α-亞麻酸[36]和(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid[26]，相關(guān)液質(zhì)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1和圖2。

4 結(jié)論

本研究建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)涼粉草多酚組分進(jìn)行分析的方法，通過(guò)分析質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，包括：相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間、元素組成、碎片離子等信息，結(jié)合對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道分析鑒定，鑒定并推測(cè)出51個(gè)化合物，證實(shí)了涼粉草多酚組分主要為黃酮類(lèi)和苯丙酸及其多聚體組成，其中咖啡酰己糖苷、丹酚酸F、丹酚酸H、apigenin-6,8-di-C-hexoside、川陳皮素、nobiletin-3-O-β-D-glucoside、20-去氧鼠尾草酚、3-O-D-glucopyranosyl platycodigenin methyl ester、marstenacigenin A尚未在涼粉草相關(guān)文獻(xiàn)中被報(bào)道，本研究認(rèn)為該9個(gè)化合物在涼粉草中首次被發(fā)現(xiàn)。研究結(jié)果為涼粉草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新藥具有重要的指導(dǎo)意義。