韋 磊，王 絢，陳 雄，湛 雯，韓 望*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，溫州 325006

動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥性疾病，主要發(fā)生在中、大動(dòng)脈的分支或彎曲部位，是導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率和死亡率增加的主要原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素疾病，涉及慢性炎癥、氧化應(yīng)激、遺傳易感性、代謝紊亂、表觀遺傳學(xué)和各種非遺傳危險(xiǎn)因素(環(huán)境污染、吸煙、心理健康、飲食和生活方式)等[2,3]。當(dāng)內(nèi)皮功能發(fā)生障礙時(shí)，單核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮并遷移至內(nèi)皮下隨后分化為單核巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)從而形成脂肪條紋[3-5]。隨后，中層血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮下間隙遷移，形成粥樣斑塊。當(dāng)纖維帽覆蓋的壞死核增多時(shí)，斑塊容易破裂，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)和心肌梗死等危險(xiǎn)事件[4,6]。其中，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中占據(jù)著主導(dǎo)作用[7]。無(wú)論在內(nèi)皮功能障礙和脂紋形成期間，還是在粥樣斑塊形成和斑塊破裂時(shí)期，炎癥因子均有著不同程度的釋放[8,9]，但至今具體的機(jī)制還未被研究清晰，且臨床缺乏治療方案。漢黃芩素(wogonin)是從黃芩根中提取的一種有效成分，被證明具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗菌、心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)作用等[10-12]。先前有研究報(bào)道漢黃芩素可抑制炎癥緩解異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟損傷[12]；雖然漢黃芩素抗炎活性的作用機(jī)制仍不清晰，但細(xì)胞核因子κB蛋白(nuclear factor-κB，NF-κB)驅(qū)動(dòng)的炎癥可能是其抗炎的作用靶點(diǎn)[13,14]。為了研究漢黃芩素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的可能作用與機(jī)制，本項(xiàng)目擬觀察漢黃芩素干預(yù)治療高脂飲食(high-fat diet，HFD)喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展程度，動(dòng)脈炎癥以及NF-κB信號(hào)通路的激活情況。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

漢黃芩素(批號(hào)：632-85-9，南京春秋生物工程有限公司)；油紅O染色試劑盒(美國(guó)sigma公司，批號(hào)：MKCG9293)；HE染色試劑盒(批號(hào)：G1005-500，武漢塞維爾生物科技有限公司)；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190809，南京建成生物工程研究院)；低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein，LDL)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190813，南京建成生物工程研究院)；總膽固醇(total cholesterol，TCH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190814，南京建成生物工程研究院)；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190813，南京建成生物工程研究院)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：H6906340，上海Yeasen公司)；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(批號(hào)：H7825250，上海Yeasen公司)；Trizol(批號(hào)：AI61056A，大連Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇8周齡的雄性ApoE-/-小鼠(購(gòu)自集萃藥康生物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008)，18～22 g，SPF級(jí)。在本研究中，48只C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠在實(shí)驗(yàn)室馴化2周后開展實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立

將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組：(1)高脂飲食(能量配比：40%脂肪，40%碳水化合物，20%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[11,12]灌胃給予漢黃芩素(以1%CMC-Na溶液配置成懸濁液，濃度為2 mg/mL)，劑量為10 mg/kg/天，持續(xù)12周(HFD+wogonin 10 mg/kg組，n=12)；(2)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[11,12]灌胃給予漢黃芩素(以1%CMC-Na溶液配置成懸濁液，濃度為4 mg/mL)，劑量為20 mg/kg/天，持續(xù)12周(HFD+wogonin 20 mg/kg組，n=12)；(3)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠(HFD組，n=12)，同時(shí)灌胃給予與給藥組等體積的1%CMC-Na溶液；(4)正常飲食(normal diet，ND)(能量配比：10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠(ND組，n=12)，同時(shí)灌胃給予與給藥組等體積的1%CMC-Na溶液；連續(xù)喂養(yǎng)12周。

動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖動(dòng)脈并拍照，將動(dòng)脈組織置于液氮中快速冷凍，進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析和/或放入4%多聚甲醛中進(jìn)行病理分析。此外，在死亡前，用含肝素的注射器從右心室采集血液。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定

動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下，收集小鼠血液，用相應(yīng)的試劑盒根據(jù)說明書提示步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血液中的高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG)水平。

1.2.4 油紅O染色

處死小鼠后每組收集6只ApoE-/-小鼠整主動(dòng)脈，對(duì)于整主動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分析，取心臟主動(dòng)脈弓至髂總動(dòng)脈的整個(gè)主動(dòng)脈，將其剝離出并至于封口膜上鋪平后于4%多聚甲醛中固定過夜。次日，先于純水中清洗5 min后，首先用異丙醇配置0.5%的油紅O染液，以純水∶0.5%油紅O染液為2∶3的比例配置油紅O工作液，60%異丙醇預(yù)處理動(dòng)脈1 min，于油紅O工作液染色15 min，再于60%異丙醇浸泡1 min，純水清洗至沒有油紅O染液殘余，觀察主動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況，利用Image J分析斑塊面積，斑塊面積=(斑塊面積/鋪平的動(dòng)脈總面積)×100%。

1.2.5 HE染色

處死小鼠后每組收集6只ApoE-/-小鼠心臟和近端主動(dòng)脈，于4%多聚甲醛中固定過夜，次日用20%蔗糖脫水12 h后利用冰凍包埋劑制備心臟冰凍切片樣本，切至主動(dòng)脈根部并收取主動(dòng)脈三尖瓣切片(8 μm)。將收集主動(dòng)脈根部的8 μm厚度的冷凍切片于蘇木精染色5 min后，含1%HCL的無(wú)水乙醇分化1 min，再于1%氨水的純水返藍(lán)1 min，純水清洗5 min，于80%無(wú)水乙醇和90%無(wú)水乙醇脫水后置于伊紅染色5 min后，繼續(xù)后續(xù)脫水程序，100%無(wú)水乙醇2次，每次5 min，最后于二甲苯浸泡2次，每次5 min后封片觀察組織病理學(xué)變化，利用Image J分析斑塊絕對(duì)面積與相對(duì)面積，相對(duì)面積計(jì)算方式為斑塊面積=(斑塊面積/動(dòng)脈管腔總面積)×100%。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

每組收集6只ApoE-/-小鼠動(dòng)脈組織由Trizol提取RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明利用2 ×SuperMix將RNA以25 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min的程序逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過SYBR Green以1 μL cDNA+2 μL 10 μM引物雙鏈+5 μL SYBR Green+2 μL RNase free ddH2O的體系和95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，×40循環(huán)；溶解曲線的程序檢測(cè)cDNA的白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule -1，VCAM -1)的mRNA水平，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物序列Table 1 Primer sequence of real-time quantitative PCR

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)

每組收集6只ApoE-/-小鼠動(dòng)脈組織，利用蛋白裂解液裂解組織提取組織總蛋白，通過BCA測(cè)蛋白濃度并將每個(gè)樣本的上樣總蛋白量保持一致。利用10%SDS膠將所有樣本的蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，隨后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(0.2 μm孔徑的膜用于小分子量蛋白，0.45 μm孔徑的膜用于分子量大的蛋白)。濕轉(zhuǎn)達(dá)90 min后停止然后用5%脫脂牛奶孵育2 h起封閉作用，待封閉結(jié)束后TBST洗滌，隨后加入一抗(抗p-NF-κB兔單克隆抗體，抗NF-κB兔單克隆抗體，抗IκB-α鼠單克隆抗體和抗β-actin兔單克隆抗體，均以5%脫脂牛奶的TBST溶液稀釋1 000倍)孵育，于搖床室溫孵育2 h后放至4 ℃過夜處理。第二日TBST洗滌后，用HRP結(jié)合的二抗(均為1∶5 000稀釋)孵育1 h，二抗孵育結(jié)束后用TBST洗滌3次。利用ECL發(fā)光液(A液∶B液=1∶1)與發(fā)光成像儀收集圖像并用ImageJ進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 組織免疫熒光染色

每組收集6只ApoE-/-小鼠心臟和近端主動(dòng)脈，同“1.2.5”方法得8 μm厚度的冰凍切片用以免疫熒光染色分析。首先用5%驢血清白蛋白封閉切片45 min。隨后，將冰凍切片與一抗(抗VCAM-1兔單克隆抗體、抗Moma-2大鼠單克隆抗體，均為1∶200稀釋)在4 ℃下孵育過夜。之后，PBS清洗三次，每次5 min，將帶有Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗(1∶200稀釋)在室溫下孵育1 h。然后，利用DAPI染色5 min后，PBS清洗三次，每次5 min，封片后顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展

首先我們探究了漢黃芩素對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響。高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周后處死小鼠，小鼠解剖圖可觀察到高脂飲食喂養(yǎng)可促使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓處動(dòng)脈粥樣斑塊的形成(見圖1A)，而根據(jù)文獻(xiàn)[11,12]選用漢黃芩素(10 mg/kg和20 mg/kg)處理后主動(dòng)脈弓分叉處動(dòng)脈粥樣硬化病變面積減少。此外，通過HE染色觀察高脂飲食喂養(yǎng)可促使ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊的形成，而給予漢黃芩素后主動(dòng)脈根部的斑塊絕對(duì)面積與相對(duì)面積均有顯著降低(P<0.05，圖1B～D)。整主動(dòng)脈的油紅染色結(jié)果顯示與HFD組比較，HFD+wogonin組ApoE-/-小鼠整主動(dòng)脈的斑塊的相對(duì)面積明顯較低(P<0.05，圖1E-F)。以上結(jié)果表明，在高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的ApoE-/-小鼠模型中，漢黃芩素能有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

圖1 給予漢黃芩素顯著緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展Fig.1 Administration of wogonin significantly alleviated the development of atherosclerosis in ApoE-/- mice fed with high-fat diet注：A：主動(dòng)脈弓；B～D：主動(dòng)脈根部組織切片的HE染色圖與定量分析，50×；E～F：整主動(dòng)脈的油紅O染色與定量分析。a：正常飲食組；b：高脂飲食組；c：高脂飲食+漢黃芩素10 mg/kg組；d：高脂飲食+漢黃芩素20 mg/kg組，下同；每組n=6；與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Not: A: Representative pictures of the aortic arch; B-D: Representative pictures of H&E staining of aortic root and oil red O staining area analysis of aortic root,50×.a: ND group; b: HFD group; c: HFD+wogonin 10 mg/kg group; d: HFD+wogonin 20 mg/kg group,the same below; n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,** P < 0.01,*** P < 0.001.

2.2 漢黃芩素不影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂

隨后我們探討漢黃芩素對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊的緩解作用是否與血脂有關(guān)。在小鼠處死前收集了血清以檢測(cè)血脂水平。如表2所示，HFD組與HFD+wogonin組ApoE-/-小鼠的血脂水平(TG/TC/LDL/HDL)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明漢黃芩素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的緩解作用不是通過影響血脂水平。

表2 ApoE-/-小鼠血脂水平Table 2 Serum lipid levels in ApoE-/- mice = 12)

2.3 漢黃芩素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈炎癥

炎癥反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的整個(gè)過程中[10]。我們進(jìn)一步研究漢黃芩素對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈炎癥的影響。主動(dòng)脈根部的抗Moma-2免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)可引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)單核/單核巨噬細(xì)胞的招募與浸潤(rùn)，經(jīng)過漢黃芩素處理后，斑塊內(nèi)單核/單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少(P<0.05，圖2)。另外，RT-qPCR分析顯示，與HFD組相比，漢黃芩素處理后，炎癥因子(TNF-α和IL-6)和粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)在動(dòng)脈中的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05，表3)。與此同時(shí)，抗VCAM-1免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部VCAM-1表達(dá)明顯增多，而漢黃芩素處理后，VCAM-1表達(dá)有所減少(P<0.05，圖3)。以上結(jié)果表明漢黃芩素顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈炎癥，且這可能與其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用有關(guān)。

圖2 ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈根部抗Moma-2免疫熒光染色(50×)Fig.2 Anti-Moma-2 immunofluorescence staining of aortic root in ApoE-/- mice (50×)注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,***P < 0.001.

表3 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈炎癥因子的mRNA水平Table 3 mRNA levels of arteries in ApoE-/- mice = 6)

圖3 ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈根部抗VCAM-1免疫熒光染色(50×)Fig.3 Anti-VCAM-1 immunofluorescence staining of aortic root in ApoE -/- mice (50×)注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,**P < 0.01，***P < 0.001.

2.4 漢黃芩素抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈中NF-κB信號(hào)通路的激活

為進(jìn)一步研究漢黃芩素的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了炎癥信號(hào)通路NF-κB信號(hào)通路的激活。如圖4所示，與HFD組相比，漢黃芩素處理可抑制高脂飲

食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中的NF-κB 的磷酸化和NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)的降解(P<0.05，圖4)，表明其抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活所實(shí)現(xiàn)的。

圖4 漢黃芩素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈中NF-κB的磷酸化與IκB-α的表達(dá)的影響Fig.4 The effect of wogonin on the phosphorylation of NF-κB and expression of IκB-α in arterial tissues of ApoE-/- mice induced by high-fat diet注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,**P < 0.01, ***P < 0.001.

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈慢性炎癥疾病，是目前世界范圍內(nèi)導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因之一[1,3]。血管炎癥的持續(xù)存在被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的動(dòng)力[8,9]。然而，現(xiàn)今對(duì)慢性低度炎癥的發(fā)生機(jī)制缺乏認(rèn)識(shí)，同樣地，當(dāng)前臨床治療方案也相對(duì)缺乏[15]，因此，進(jìn)一步揭示炎癥相關(guān)機(jī)制對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療干預(yù)具有重要意義。

迄今為止，許多因素與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病有關(guān)，這些因素不僅包括血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓、衰老和吸煙等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，還包括感染和慢性炎癥等非經(jīng)典危險(xiǎn)因素[16]。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞作為炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化的中樞介質(zhì)發(fā)揮著重要作用[1]。當(dāng)脂質(zhì)積累于血管內(nèi)膜后，循環(huán)單核細(xì)胞被活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞招募并遷移至內(nèi)皮下層，然后分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞隨后攝取氧化低密度脂蛋白等修飾脂蛋白，而富含膽固醇的巨噬細(xì)胞將形成泡沫細(xì)胞(動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)標(biāo)志)，然后一系列復(fù)雜的炎癥級(jí)聯(lián)被觸發(fā)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，最終導(dǎo)致斑塊破裂及其相關(guān)的心血管事件發(fā)生[17-19]。近期針對(duì)炎癥干預(yù)的臨床實(shí)驗(yàn)顯示心血管風(fēng)險(xiǎn)患者的心血管結(jié)局顯著改善，進(jìn)一步證明炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病中的因果作用[20,21]。因此，靶向炎癥的治療方案被認(rèn)為是一種有前景的治療動(dòng)脈粥樣硬化的策略[18,22]。漢黃芩素是一種天然黃酮化合物，具有顯著的抗炎的作用，此研究利用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動(dòng)物模型研究漢黃芩素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可有效緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓、根部和整主動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，提示漢黃芩素可能是一種潛在治療動(dòng)脈粥樣硬化的天然藥物。而后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)可引起單核/單核巨噬細(xì)胞招募與浸潤(rùn)增加，動(dòng)脈炎癥因子(TNF-α和IL-6)和粘附因子(ICAM-1和VCAM-1)的mRNA水平和主動(dòng)脈根部VCAM-1蛋白水平升高，而給予漢黃芩素可有效改善以上變化。NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，在此研究中，高脂飲食喂養(yǎng)可增加NF-κB的磷酸化和IκB-α的降解，而漢黃芩素處理后NF-κB的磷酸化和IκB-α的降解明顯被抑制。這些結(jié)果表明漢黃芩素可能通過抑制NF-κB調(diào)控的炎癥反應(yīng)緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上，漢黃芩素抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用可能依賴于其對(duì)NF-κB調(diào)控的炎癥反應(yīng)的抑制活性，并且漢黃芩素可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效單體。