王博，馬劍，馬曉欣

110022 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 婦產(chǎn)科

婦科腫瘤包括子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等，嚴(yán)重威脅全球婦女的健康。其中子宮頸癌是女性第四大常見癌癥，每年約有超過528 000例以上的新發(fā)病例和266 000例死亡病例;卵巢癌病例僅在2018年就新增295 414例，死亡184 799例[1];而子宮內(nèi)膜癌在西方國家以及我國部分發(fā)達(dá)城市中，發(fā)病率更是高居?jì)D科腫瘤的首位。近年來大量研究表明m6A甲基化修飾在婦科腫瘤惡性生物學(xué)行為及腫瘤放療抵抗方面有著重大意義，已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

1 m6A甲基化概述

RNA表觀遺傳學(xué)修飾是RNA調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)[2]。而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是高等真核生物中最常見的mRNA內(nèi)部修飾[3-4],m6A修飾的腺嘌呤數(shù)量占到了腺嘌呤總數(shù)的0.2～0.5%[5]。m6A是位于腺嘌呤的第6位氮原子的甲基化修飾，主要分布于終止密碼子附近和3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′UTR)[6-8]，定位于保守的RRACH序列(R=G或A;H=A,C或U)中[9-11]，并廣泛分布于mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)中,在mRNA剪接、微小RNA(microRNA,miRNA)的加工成熟、長鏈非編RNA(long non-coding RNA,lncRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制等多種RNA的代謝過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。

2 m6A相關(guān)酶

2.1 m6A甲基化酶(Writers)

METTL3、METTL14以及WTAP形成m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物[14-16]，這種甲基化酶也被稱為“Writers”[17]，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物通過S-腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)移酶上的甲基基團(tuán)，在靶mRNA上添加m6A甲基化[18]。METTL3是該復(fù)合物的催化核心酶，METTL14是METTL3的結(jié)構(gòu)支持伴侶，METTL3-METTL14可誘導(dǎo)哺乳動物核RNA上的m6A沉積[19-20]。除了這三個經(jīng)典的甲基化酶以外，也有實(shí)驗(yàn)證明VIRMA、HAKAI、ZC3H13等也在m6A甲基化的過程中發(fā)揮重要的作用[21-22]。

2.2 m6A去甲基轉(zhuǎn)移酶(Erasers)

FTO(ALKBH9)和ALKBH5被報(bào)道具有去甲基化的活性[23-24]，F(xiàn)TO基因被敲低后，mRNA中m6A水平升高，而過表達(dá)野生型的FTO中，mRNA中m6A水平顯著降低，證明了FTO具有去甲基化的功能[23]。ALKBH5定位于細(xì)胞核中，沉默或者過表達(dá)ALKBH5均可改變m6A水平[24]。

2.3 m6A識別蛋白(Readers)

m6A識別蛋白通過讀取m6A甲基化從而調(diào)控mRNA的相關(guān)生物學(xué)行為及行使相應(yīng)功能，能與RNA結(jié)合的YTH結(jié)構(gòu)域家族是第一個被發(fā)現(xiàn)能直接識別m6A的“Readers”[25]，YTH家族蛋白包括YTHDF1～3和細(xì)胞核成員YTHDC1～2[26-28]。也有實(shí)驗(yàn)表明IGF2BPs也可以作為m6A甲基化的識別蛋白，發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能[29]。此外在哺乳動物細(xì)胞中與m6A關(guān)聯(lián)的蛋白還有eIF3等[30]。

3 m6A調(diào)控RNA的生物學(xué)行為及可能機(jī)制

m6A甲基化修飾在調(diào)控RNA生物學(xué)行為中起到了重要作用。近些年來的研究表明，mRNA生物學(xué)行為調(diào)控的全過程都受到m6A甲基化修飾的調(diào)控[31]。此外,m6A在lncRNA和miRNA的生成及功能等方面也發(fā)揮了重要調(diào)控作用[32]。

3.1 m6A調(diào)控mRNA的生物學(xué)行為及可能機(jī)制

m6A可以調(diào)控mRNA的剪接及成熟。例如，F(xiàn)TO控制RUNXITI的可變剪接(RUNXITI是一種與脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)，影響脂肪形成[33]，也有實(shí)驗(yàn)表明敲除FTO可顯著調(diào)節(jié)pre-mRNA剪切過程中的外顯子跳躍事件，并且上調(diào)3′末端外顯子的表達(dá)[34]。

mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)是連接轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵過程[35]，這個過程可選擇性地調(diào)控基因的表達(dá)。METTL3的缺失可抑制mRNA的核輸出[36]，細(xì)胞內(nèi)ALKBH5的敲除可加速靶mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。

m6A可通過多種機(jī)制促進(jìn)翻譯，主要包括：YTHDF1可以促進(jìn)核糖體裝載，并招募43S復(fù)合物促進(jìn)翻譯[6]，YTHDF3可以通過與YTHDF1和eIf4A3結(jié)合促進(jìn)翻譯起始[28]。

mRNA的穩(wěn)定性與m6A依賴的降解過程密切相關(guān)。與未甲基化的mRNA相比，YTHDF2與m6A標(biāo)記的mRNA的親和力高約16倍，衰減率明顯提高，半衰期縮短[37-38](圖1)。

圖1 “Writers”、“Erasers”和“Readers”在RNA上m6A甲基化修飾中作用的分子機(jī)制

3.2 m6A調(diào)控lncRNA和miRNA的生物學(xué)行為及可能機(jī)制

除了mRNA外，lncRNA和miRNA也受到m6A的調(diào)控。例如，有研究表明METTL3通過上調(diào)lncRNA ABHD11-AS1上的m6A甲基化修飾，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性，進(jìn)而增加了非小細(xì)胞肺癌的增殖和Warburg效應(yīng)[39]。當(dāng)然lncRNA上有m6A修飾位點(diǎn)，功能受到m6A甲基化的調(diào)節(jié)，同樣lncRNA作為一種功能性RNA也可以調(diào)節(jié)m6A相關(guān)酶的活性，來調(diào)控其他分子水平的m6A修飾。有研究表明DMDRMR可以結(jié)合m6A識別蛋白IGF2BP3來增強(qiáng)其活性，通過m6A依賴的方式來穩(wěn)定細(xì)胞周期激酶CDK4和3種細(xì)胞外基質(zhì)成分(COL6A1,LAMA5和FN1),從而增強(qiáng)了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞中G1/S過度，促進(jìn)細(xì)胞增殖[40]。另一方面有實(shí)驗(yàn)表明m6A甲基化酶METTL14調(diào)控has-miR-146a-5p表達(dá)，從而影響乳腺癌細(xì)胞的遷徙和侵襲[41]。m6A甲基化修飾一方面可以調(diào)控mRNA,lncRNA和miRNA的生物學(xué)行為，另一方面mRNA,lncRNA和miRNA之間本身也存在復(fù)雜的調(diào)控，m6A甲基化修飾也參與復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的發(fā)生，是其中的重要環(huán)節(jié)?？傊荒芄铝⒌目创齧6A甲基化修飾，m6A甲基化修飾作為復(fù)雜RNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)，在未來仍需要進(jìn)一步研究。

4 mRNA上m6A甲基化修飾在婦科腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

4.1 m6A甲基化與宮頸癌

近期不少研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，有研究就表明m6A水平降低與FIGO分期、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)浸潤及腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[42]。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)METTL3靶向己糖激酶2(HK2)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)并招募m6A閱讀器YTHDF1來增強(qiáng)HK2的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和好氧糖酵解。另一項(xiàng)研究也表明METTL3促進(jìn)PDK4的5’UTR的m6A修飾，進(jìn)而增加其mRNA的穩(wěn)定性促進(jìn)其表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[44]。也有研究發(fā)現(xiàn)m6A去甲基化酶FTO通過調(diào)控m6A修飾E2F1和Myc轉(zhuǎn)錄本，在調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要的致癌作用[45](圖2)。在宮頸癌相關(guān)研究中，m6A甲基化修飾是一把雙刃劍，過度修飾或者修飾水平過低都可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞中整體m6A甲基化修飾水平和局部m6A甲基化修飾水平都是我們進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

4.2 m6A甲基化與卵巢癌

復(fù)雜且可逆的m6A修飾是卵巢癌中一個新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控方式。有研究就發(fā)現(xiàn)METTL3總體水平升高是子宮內(nèi)膜樣上皮性卵巢癌患者生存期相關(guān)的獨(dú)立因素[46]。其他研究也揭示了METTL3與卵巢癌進(jìn)展相關(guān)，Liang等[47]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3下調(diào)可能通過激活線粒體凋亡途徑和AKT信號通路使卵巢癌細(xì)胞凋亡增加，另一方面Hua等[48]研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過上調(diào)受體酪氨酸激酶AXL促進(jìn)卵巢癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。生物信息學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)同為甲基化酶的WTAP表達(dá)升高與卵巢癌預(yù)后惡化之間存在顯著相關(guān)性[49]。

去甲基化酶也在卵巢癌進(jìn)展中起到重要作用，Huang等[50]研究發(fā)現(xiàn)FTO升高通過降低3’UTR m6A水平和兩個磷酸二酯酶基因(PDE1C和PDE4B)mRNA穩(wěn)定性，增強(qiáng)第二信使3’，5’cAMP信號通路，抑制了卵巢癌干細(xì)胞特性。有趣的是同樣作為去甲基化酶的ALKBH5則表現(xiàn)出相反的功能，Jiang等[51]研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)toll樣受體(TLR4)激活NF-κB通路，上調(diào)ALKBH5的表達(dá)，mRNA去甲基化后NANOG表達(dá)增加，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲性。

作為“Readers”的YTHDF1也在卵巢癌進(jìn)展中也起到重要作用，Hao等[52]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過m6A甲基化修飾的TRIM29可以招募YTHDF1,來促進(jìn)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞中的TRIM29的翻譯。另一項(xiàng)研究也顯示YTHDF1能促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[53](圖3)?？傊琺6A甲基化在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和耐藥性中起到重要作用。

4.3 m6A甲基化與子宮內(nèi)膜癌

除了卵巢癌，m6A甲基化在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用。Liu等[54]研究發(fā)現(xiàn)METTL3/METTL14表達(dá)減少使得m6A甲基化修飾水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致AKT負(fù)性調(diào)控因子PHLPP2的表達(dá)減少，而AKT正調(diào)控因子mTORC2表達(dá)量增加，激活A(yù)KT通路導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和致腫瘤性增強(qiáng)。去甲基化酶也同樣發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)FTO可以催化HOXB13 mRNA 3‘UTR區(qū)域的去甲基化修飾，從而消除YTHDF2蛋白對m6A修飾的識別，減少了HOXB13 mRNA的衰變和增加HOXB13蛋白的表達(dá)進(jìn)而激活WNT信號通路和下游蛋白的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[55]。另一種去甲基化酶ALKBH5也發(fā)揮促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的作用，Chen等[56]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過mRNA去甲基化來促進(jìn)SOX2轉(zhuǎn)錄，從而維持子宮內(nèi)膜癌干細(xì)胞狀態(tài)和腫瘤特性。另一研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5能去除IGF1R mRNA上的m6A修飾，從而增加mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)IGF1R翻譯，激活I(lǐng)GF1R信號通路進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[57](圖2)。整體上看，m6A水平降低是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的重要特性。

總之mRNA上m6A甲基化修飾在婦科腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，未來m6A甲基化進(jìn)一步機(jī)制的闡明、相關(guān)藥物治療、診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的發(fā)掘在未來仍需要進(jìn)一步的研究。

5 LncRNA上m6A甲基化修飾在婦科腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

除了mRNA外，lncRNA也受m6A的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)ZAFS1能抑制miR-647，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這種RNA-RNA相互作用受到METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的調(diào)控[58]。也有研究表明lncRNA GAS5-AS1的下調(diào)與宮頸癌FIGO分期顯著相關(guān)，GAS5-AS1與腫瘤抑制因子GAS5相互作用，在體外功能上顯著降低宮頸癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲，在體內(nèi)顯著抑制宮頸癌的致腫瘤性和轉(zhuǎn)移。LncRNA GAS5-AS1與RNA去甲基化酶ALKBH5相互作用，降低了GAS5的m6A修飾，提高其穩(wěn)定性。此外m6A介導(dǎo)的GAS5 RNA的降解依賴于m6A閱讀器YTHDF2依賴的通路[59]。此外，lncRNA KCNMB2-AS1可作用于下游miR-130b-5p和miR-4294,miR-130b-5p和miR-4294又可以作用于更下游的靶點(diǎn)IGF2BP3。IGF2BP3是一種RNA結(jié)合蛋白，可作為m6A的閱讀器，而lncRNA KCNMB2-AS1具有m6A位點(diǎn)，IGF2BP3通過m6A修飾阻止KCNMB2-AS1的降解。因此KCNMB2-AS1與IGF2BP3之間形成了一個由m6A修飾介導(dǎo)的前饋調(diào)控回路。m6A修飾的KCNMB2-AS1在宮頸癌中通過調(diào)控miR-130b-5p/miR-4294/IGF2BP3信號軸發(fā)揮促癌lncRNA作用[60](圖2)。有研究表明lncRNA RHPN1-AS1上的m6A修飾可以減少自身的降解，提高自身穩(wěn)定性，能導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞中RHPN1-AS1上調(diào)。RHPN1-AS1作為海綿miR-596的ceRNA,能增加LETM1的表達(dá)并激活FAK/P13K/Akt信號通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[61](圖3)。

圖2 m6A調(diào)控蛋白在子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌中的作用

6 miRNA上m6A甲基化修飾在婦科腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

不僅lncRNA受到m6A甲基化修飾的調(diào)控，miRNA也受到m6A甲基化修飾的調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)METTL3能促進(jìn)miR-126-5p的成熟，進(jìn)而靶向作用于PTEN，激活P13K/Akt/mTOR通路，促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展和腫瘤發(fā)生[62]。同樣，Li等[63]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中YTHDF2升高能顯著促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞系的增殖和遷移，而YTHDF2還可以和miR-145形成雙負(fù)反饋回路,通過間接調(diào)控m6A水平參與上皮性卵巢癌的進(jìn)展(圖3)。

圖3 m6A調(diào)控蛋白在卵巢癌中的作用

7 總結(jié)與展望

在m6A甲基化酶、m6A去甲基轉(zhuǎn)移酶和m6A識別蛋白的共同可逆調(diào)節(jié)下，m6A甲基化修飾涵蓋了mRNA、lncRNA和miRNA等各種RNA生命歷程的各個階段。通過這種表觀遺傳學(xué)m6A甲基化修飾，來調(diào)節(jié)mRNA、lncRNA和miRNA等各種RNA發(fā)揮相應(yīng)的功能，進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有趣的是在宮頸癌的不同研究中，甲基化酶METTL3和去甲基轉(zhuǎn)移酶FTO表達(dá)增高均能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[43,45]。在卵巢癌的不同研究中METTL3增高有時可以作為促進(jìn)癌癥進(jìn)展的因素，有時可以作為抑制的癌癥因素[46-47]。已有的研究提示：1)m6A甲基化修飾是一把雙刃劍，過度修飾或者修飾水平過低都可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展；2)同一m6A甲基化相關(guān)酶，在不同作用通路上可能具有不同功能；3)m6A甲基化修飾不僅局限于mRNA上，也存在于lncRNA、miRNA和其他RNA上，這為我們研究提供了廣泛的研究空間；4)m6A甲基化相關(guān)酶也可以作為lncRNA、miRNA調(diào)控靶點(diǎn)，影響其他RNA的m6A甲基化水平；5)m6A甲基化酶除了調(diào)控m6A水平外，還可能具有其他獨(dú)立功能，例如METTL3除了具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，還能增強(qiáng)癌癥基因的翻譯，獨(dú)立于其催化亞基影響癌癥進(jìn)展[64]。這也為我們拓展了m6A的研究思路。

m6A甲基化在婦科腫瘤中的作用研究已經(jīng)取得不少進(jìn)展，然而也存在許多機(jī)遇與挑戰(zhàn)：1)m6A在婦科腫瘤中的作用仍有爭議，這些功能特點(diǎn)是m6A在mRNA和亞細(xì)胞閱讀器的不同區(qū)域波動分布造成的，考慮到代謝網(wǎng)絡(luò)之間廣泛相互影響，維持代謝過程之間的內(nèi)環(huán)境平衡尤為重要，這也是我們未來要考慮的因素之一；2)m6A及其調(diào)控因子是否可以作為婦科腫瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物的特異性和敏感性有待探索；3)有研究表明m6A調(diào)控因子及相關(guān)通路可作為治療靶點(diǎn)，但缺乏在大樣本的臨床實(shí)踐中的具體應(yīng)用，其副作用在很大程度上尚不清楚；4)m6A甲基化修飾和其他表觀遺傳學(xué)修飾之間存在聯(lián)合效應(yīng)還是相減效應(yīng)有待進(jìn)一步探索；5)已有的婦科腫瘤研究大多針對甲基化酶與去甲基轉(zhuǎn)移酶，而對于閱讀器的研究較少，這也是我們未來探索的方向之一。相信隨著對m6A修飾RNA后功能變化研究的不斷深入，一定可以為我們早期診斷婦科惡性腫瘤和尋找治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

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