石夏，劉帥斌，郝曉明，李虎，胡麗娜

400000 重慶, 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科

宮頸癌為全球女性第四大最常見癌癥，也是全世界面臨的重大公共衛(wèi)生問題。根據(jù)國際癌癥研究署估計，2018年全球約有56.9萬新發(fā)病例，與宮頸癌相關(guān)死亡人數(shù)約31.1萬[1]。2020年11月17日，WHO提出“加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略”，標(biāo)志全球194個國家首次承諾消除一種癌癥，包括三項關(guān)鍵措施：疫苗接種、篩查和治療。到2050年，成功實施這三項舉措預(yù)計可以減少40%以上宮頸癌新病例和500萬相關(guān)死亡[2]。

接種HPV預(yù)防性疫苗可實現(xiàn)宮頸癌一級預(yù)防[3]。對免疫前HPV感染率及亞型分布的調(diào)查是評估HPV疫苗接種后影響的基礎(chǔ)。越來越多研究對不同地區(qū)HPV感染狀況進(jìn)行了調(diào)查，但其中關(guān)于HPV多重感染數(shù)據(jù)有限。多種HPV亞型感染的累積可以作為子宮頸上皮內(nèi)瘤變風(fēng)險增加的替代標(biāo)志物。因此，本研究旨在回顧性分析2010～2018年本院機(jī)會性篩查的64 911名女性中HPV多重感染情況，以幫助開發(fā)HPV疫苗，并為今后疫苗接種效果的長期監(jiān)測提供基線數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2010年1月至2018年12月期間于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院因各種婦科疾病和健康體檢接受HPV亞型檢測的64 911名女性。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：1)有性行為史；2)同意接受HPV檢測并自愿參加這項研究。懷孕或有宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變病史或接種過HPV疫苗的婦女被排除在外；已專門對相同就診號的患者信息進(jìn)行剔除。被篩查者的年齡為16～75歲，平均(46.29±9.27)歲。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 在非月經(jīng)期采樣，采樣前3天禁止使用陰道栓劑，采樣前1天禁止性生活。用無菌棉拭子擦拭宮頸口分泌物，再使用宮頸刷于宮頸口單向旋轉(zhuǎn)5周，取得足量宮頸脫落上皮細(xì)胞，并將其保存于盛有細(xì)胞保護(hù)液的試管內(nèi)，立即送檢。

1.2.2 HPV亞型檢測 本院采用凱普HPV分型檢測試劑盒、thermal cycler S1000 PCR擴(kuò)增儀和HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀,進(jìn)行PCR-反向點雜交試驗。共檢測23種HPV亞型，分別為HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83。

1.2.3 質(zhì)量控制 檢驗設(shè)備和試劑均通過國家臨檢中心認(rèn)證；檢驗人員均經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)且取得相關(guān)證件；每次實驗設(shè)有陰性及陽性對照。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 24.0統(tǒng)計軟件包上進(jìn)行計算，其中率的比較采取卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV感染類型總體分布情況

在64 911例HPV分型檢測的女性中，HPV感染共18 891例，總感染率為29.10%(18 891/64 911)。其中單一HPV感染占70.01%(13 225/18 891)，多重感染占29.99%(5 666/18 891)。二重感染是主要感染形式，共3 895例，占68.74%(3 895/5 666)。多重感染中，隨著合并感染HPV型別數(shù)增加，感染例數(shù)明顯減少(表1)。

表1 HPV感染類型總體分布情況

2.2 不同年份HPV多重感染情況

2010～2018年期間，進(jìn)行HPV檢測的總例數(shù)逐年增加，2018年較2010年增長5倍，HPV總感染率波動在24%～37%(表2)。不同年份HPV總感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=375.344，P<0.001)，整體感染率呈下降趨勢。多重感染率2014年最高(13.02%)，2018年最低(6.71%)，不同年份單一感染和多重感染差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=130.946，P<0.001)。

表2 不同年份HPV多重感染情況

2.3 不同年齡段HPV多重感染情況

在64 911例中，具有完整年齡信息者共40 275例。按年齡段分為5個亞組：<30歲、30～39歲、40～49歲、50～59歲和≥60歲。

各年齡段總感染率和多重感染率趨勢一致，呈“U”形分布。多重感染率最高在≥60歲組(12.91%)，其次為<30歲組(9.97%)；多重感染率最低在40～49歲組(5.39%)。不同年齡段HPV單一感染和多重感染差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=174.72，P<0.001)(表3)。

表3 不同年齡段HPV多重感染情況

2.4 HPV多重感染亞型分布情況

在5 666例多重感染中，最常見的HPV亞型是：HPV52、16、58、81、56，以高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)感染為主。在HR-HPV感染中，前3位常見亞型是：HPV52、16、58；在低危型人乳頭瘤病毒(low-risk human papillomavirus,LR-HPV)感染中，前3位常見亞型是：HPV81、43、6。HPV18型在多重感染中僅有583例，排在第11位(表4)。

表4 HPV多重感染亞型分布情況

2.5 二重感染中HPV亞型組合

二重感染是主要的多重感染形式(3 895例)，其中有235種不同組合。表5列出了前20位特定組合，最常見的是HPV16+52，其次為16+58、52+81、52+58，再次為52+53。二重感染中最常見的為HPV52型合并感染(1 076例)，其次是HPV16型合并感染(845例)。

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表5 二重感染中常見HPV亞型組合

3 討 論

人乳頭瘤病毒感染是全世界最常見的性傳播病毒感染，持續(xù)高危型HPV感染如16、18型，可引起宮頸癌等HPV相關(guān)癌癥[3]。世界范圍內(nèi)HPV感染率波動在14%(東南亞)至24%(撒哈拉以南非洲)[4-5]。一項包含170萬中國婦女的薈萃分析顯示，全國HPV總感染率為15.54%，且隨地區(qū)而異，波動在6.2%(香港)至31.3%(海南)[6]。本研究中HPV總感染率為29.1%，明顯高于大多數(shù)地區(qū)，這可能與選擇的研究人群為醫(yī)院機(jī)會篩查者有關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)29.99%HPV陽性婦女同時感染了多種HPV亞型；據(jù)報道，HPV多重感染的發(fā)生率比偶然預(yù)測要高得多，全球20%～50%HPV陽性婦女可同時感染多種HPV亞型[7]。從2010～2018年，HPV總感染率、多重感染率整體呈下降趨勢，可能與宮頸癌篩查策略改變有關(guān)。2011年推薦篩查策略是細(xì)胞學(xué)結(jié)合HPV檢測，HPV檢測是對細(xì)胞學(xué)異常婦女的進(jìn)一步分流。近年HPV檢測與細(xì)胞學(xué)檢查已并列為宮頸癌篩查的最重要手段，甚至有取代細(xì)胞學(xué)檢查作為一線篩查的趨勢。隨著人們對宮頸癌篩查的日益重視以及HPV疫苗的國內(nèi)上市，越來越多女性接受HPV篩查，包括曾經(jīng)HPV陽性婦女因免疫系統(tǒng)清除或接受治療(局部物理治療、錐切術(shù))后進(jìn)行重復(fù)檢測，結(jié)果可轉(zhuǎn)為陰性，促使HPV流行趨向于自然感染。全球女性人群中最常見的HPV亞型為HPV16、18、31、58和52。在美國以HPV16、18、58、31和33最常見，在歐洲則是HPV16、18、31、33和58[8]。而HPV16、52、58、18和33是我國最常見的HPV感染亞型，其分布與世界其他地區(qū)不同[6]。本研究調(diào)查分析的是5 666例多重感染中HPV亞型分布情況，以HPV52、16、58、81、56最常見,并且HPV多重感染中18型少見，僅排在第11位。

多重感染在年輕女性和老年女性中更常見。這種感染“雙峰”模式可能是基于HPV感染的自然發(fā)展歷史；年輕女性對HPV感染非常敏感，可能因為免疫保護(hù)不成熟，同時活躍的性行為導(dǎo)致多種HPV亞型的性傳播。而老年女性免疫力下降，消除既往和新感染的能力也隨之下降[9]，HPV持續(xù)感染或者是潛伏病毒的重新激活導(dǎo)致了其多重感染率也較高。

多重感染機(jī)制尚不明確，但已有研究報道，持續(xù)感染HPV女性更容易有攜帶額外亞型的傾向。在哥斯達(dá)黎加年輕女性HPV感染樣本中，研究者們發(fā)現(xiàn)多性伴侶、吸煙者患多重感染風(fēng)險較高，而與年齡、婚姻狀況、懷孕次數(shù)、口服避孕藥、首次性行為年齡和避孕套使用無關(guān)[10]。這可能是由于HPV常見感染形式是性傳播，性活躍婦女可同時感染多種HPV。吸煙可以增加HPV感染風(fēng)險、持久性和病毒載量[11]。陰道微生態(tài)和HPV的清除之間也具有相關(guān)性，陰道清潔度異常、乳酸桿菌減少使HPV持續(xù)感染率增加[12]。乳桿菌通過分解陰道上皮糖原產(chǎn)生乳酸，使陰道處于正常pH值(3.8～4.5)，從而抑制病菌生長、清潔陰道。Clarke等[13]發(fā)現(xiàn)，陰道pH在5.0～5.5時，HPV感染率及多重感染率顯著升高。同時，合并陰道炎可能是HPV持續(xù)感染的因素之一，常見的陰道炎包括細(xì)菌性陰道病、外陰陰道假絲酵母菌病及滴蟲性陰道炎等，HPV感染機(jī)制包括乳酸桿菌減少、厭氧微環(huán)境、宿主易感性增加、蛋白降解引起的抗原反應(yīng)等[12]。有研究指出，多重感染也有可能由免疫機(jī)制決定，在免疫抑制的HIV感染婦女中HPV多重感染率很高[14]。但是還需要更多研究來確定多重感染的免疫機(jī)制。

目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)198種HPV亞型，分為五個屬：α、β、γ、μ、ν。大部分位于α屬中5、6、7、9、11種的高危型別可引起惡性腫瘤。常見的例如HPV16、52、58均屬于α9種，HPV18屬于α7種[15]。我們主要分析二重感染中HPV亞型組合(235種)，最常見的是HPV16+52(α9種)，然后依次是HPV16+58(α9種)、HPV52+81(α9種+α3種)、HPV52+58(α9種)、HPV52+53(α9種+α6種)。并且HPV52型合并感染最常見(1 076例)，其次是HPV16型合并感染(845例)，HPV18型合并感染不常見(296例)。近期一項中國多研究中心的結(jié)果顯示，最常見組合是HPV16+58，其次是HPV16+52、52+58和16+18[7]。這些發(fā)現(xiàn)表明，在系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)的HPV亞型有聚集在一起的趨勢，多重感染中α9種感染率顯著高于α7種，可能是因為α9種HPV感染清除時間慢，而持續(xù)感染更容易有多重感染傾向。一些研究表明，不同HPV亞型混合感染之間存在潛在拮抗和/或協(xié)同作用[6]。合并α9種HPV亞型的多重感染使患宮頸癌風(fēng)險顯著增加5.3倍，而合并α7種亞型的多重感染則使患宮頸癌的風(fēng)險增加2.5倍[16]。這可以解釋同種來源HPV亞型在誘發(fā)宮頸癌的協(xié)同作用。

HPV多重感染與宮頸病變之間的關(guān)系目前尚無定論。有研究指出，HPV多重感染率隨病變級別(除宮頸鱗癌組外)增加而增加，一定程度上說明多重感染對宮頸病變及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起一定促進(jìn)作用[17]。Fife等[18]也認(rèn)為，多重HR-HPV感染增加宮頸癌風(fēng)險。與單一感染的女性相比，多重感染的女性患CIN2+和HSIL+的風(fēng)險顯著增加(OR=2.2)[10]。這可能是由于HPV多重感染者出現(xiàn)持續(xù)感染的風(fēng)險較高，而HPV持續(xù)感染是宮頸病變發(fā)生的原因，因此多重感染容易導(dǎo)致宮頸病變。

但也有部分學(xué)者持相反意見，荷蘭一項大規(guī)模人群研究發(fā)現(xiàn)[19]，與細(xì)胞學(xué)正常的女性相比，在鱗狀上皮內(nèi)病變的女性中HPV亞型種類增多，可能反映了個體在進(jìn)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變的過程中對HPV感染的耐受和持續(xù)狀態(tài)，然而在HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞中，多重HPV感染較低，腫瘤組織中以HPV單一感染為主，這反映了已知的HPV所誘導(dǎo)腫瘤的單克隆生長。由于不可能清除每一次發(fā)生的HPV感染，持久的免疫力允許不同HPV類型。本文局限在于沒有進(jìn)一步分析宮頸癌前病變和宮頸癌中HPV多重感染情況，特定HPV亞型組合是否增加宮頸癌發(fā)生風(fēng)險，值得我們在后續(xù)研究中重視。

截至2020年，超過85%高收入國家將HPV疫苗接種納入其國家免疫規(guī)劃，WHO提出2030年實現(xiàn)90%女孩在15歲之前完成HPV疫苗接種目標(biāo)[3]。我國國家藥品監(jiān)督局在批準(zhǔn)二價、四價HPV疫苗上市后，于2018年批準(zhǔn)了九價疫苗進(jìn)入中國市場[20]。目前市場上HPV疫苗都是基于西方國家流行數(shù)據(jù)而開發(fā)的，而HPV感染狀況在世界各地差異很大。因此，開發(fā)涵蓋更多HPV型別或者更符合中國女性HPV感染模式的新型疫苗已成為必然，而HPV感染的特定人群流行病學(xué)數(shù)據(jù)是開發(fā)疫苗、評估疫苗接種效果的先決條件。目前還沒有針對中國婦女的多重感染數(shù)據(jù)。因此，本文對近10年醫(yī)院機(jī)會性篩查人群中5 666例HPV多重感染狀況進(jìn)行了調(diào)查分析，是目前中國特定人群中數(shù)據(jù)最全面、時間跨度最長的多重感染回顧性研究，或可為今后HPV疫苗的開發(fā)和應(yīng)用提供指導(dǎo)，同時對于動態(tài)追蹤接種疫苗后女性HPV感染的變化趨勢也非常重要。

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