高歡歡，覃冬云，陳迎春，代曉彥，吳新穎*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，山東濟南 250100）

葡萄酸腐病是果實采收期較為普遍的病害，主要表現(xiàn)為果實組織軟化腐爛，呈現(xiàn)明顯的醋酸氣味，腐爛流出的汁液到達處引起進一步的感染，導(dǎo)致整穗葡萄染病腐爛，造成產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時可導(dǎo)致絕產(chǎn)[1-3]。

由機械損傷或者氣候原因、園區(qū)管理不當(dāng)導(dǎo)致的果實裂果，給多種病原菌的侵染創(chuàng)造了有利條件，包括酵母菌、醋酸菌、真菌等[4-7]。Gao等[8]于2020年從山東煙臺地區(qū)采集腐爛葡萄，經(jīng)過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)桔青霉（Penicillium citrinum）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、尖孢枝孢菌（Cladosporium oxysporum）、青霉菌（P. georgiense）、細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（A. aculeatus）、米曲霉（A.oryzae）與葡萄酸腐病密切相關(guān)。除此之外，果蠅也被認(rèn)為是葡萄酸腐病重要的誘發(fā)因子和傳播媒介，其中最廣為人知的是黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），是因醋酸菌以及酵母菌釋放的代謝物質(zhì)吸引而來，通過取食葡萄加速其腐爛[9]。但黑腹果蠅與特定真菌病原菌的關(guān)系并未有相關(guān)報道。另外，對葡萄生長期果蠅的發(fā)生規(guī)律進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅主要發(fā)生在葡萄成熟期，而在始熟時誘集到大量的斑翅果蠅（D. suzukii）成蟲[10]。也有報道證明，黑腹果蠅更偏好在腐爛的葡萄上產(chǎn)卵，而斑翅果蠅則偏好在完好的葡萄上產(chǎn)卵，二者的取食侵害可顯著促進腐爛葡萄中醋酸菌的生長[11]。但是斑翅果蠅是否能夠影響腐爛葡萄中真菌病原菌的致病性，并沒有明確的報道。

因此，以前期發(fā)現(xiàn)的桔青霉、層生鐮刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉8種真菌為研究對象，通過將其與黑腹果蠅和斑翅果蠅分別聯(lián)合侵害葡萄的方式，觀察兩種果蠅是否影響真菌在葡萄上的發(fā)病情況，從而明確兩種果蠅與真菌病原菌的關(guān)系，為葡萄酸腐病的致病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黑腹果蠅和斑翅果蠅

黑腹果蠅和斑翅果蠅來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所的實驗室種群。飼養(yǎng)條件：溫度為25±1 ℃，相對濕度為60%±2%，光周期為16 h∶8 h（白天/黑夜）。

1.2 真菌

桔青霉、層生鐮刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉菌株為山東省葡萄研究院自存菌株。用打孔器收取菌餅分別放置于PDA培養(yǎng)基中央，在溫度為25±1 ℃，相對濕度為60%±2%的人工氣候箱中培養(yǎng)3～7 d，在菌落直徑超過4 cm時取出，用于致病性試驗。

1.3 葡萄樣品

葡萄品種為‘玫瑰香’，于2020年8月采摘于濟南仲宮實驗站。采摘大小均一、成熟度一致的果穗（可溶性固形物16%）。剪取無損傷的果粒，用1%的NaClO溶液表面消毒1 min，然后在70%的酒精中浸泡1 min，用無菌水沖洗2次并晾干，用于致病性試驗。

1.4 致病性試驗

1.4.1 黑腹果蠅對8種真菌致病性的影響

用消毒解剖針在表面消毒過的健康葡萄中央刺一個2～3 mm深的小孔，以此模擬田間的機械損傷，用于下列試驗。處理1（DM）：將10粒刺傷的葡萄放置于直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，收集10頭黑腹果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）放入其中；處理2（Fungus1）：每種真菌分別制備濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液，浸泡葡萄30 s，每10粒為1個重復(fù)；處理3（Fungus＋DM）：在葡萄上接種真菌后，收集10頭黑腹果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）放入其中；處理4（CK）：以不接種真菌和黑腹果蠅的葡萄為對照。所有處理重復(fù)3次，置于27 ℃/25 ℃（白天/黑夜）和80% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在5 d和7 d后觀察葡萄的發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用5級記載法[12-13]。0級：無病斑；1級：病斑面積占果實面積5%以下；3級：病斑面積占果實面積5%～25%；5級：病斑面積占果實面積25%～50%；7級：病斑面積占果實面積50%～75%；9級：病斑面積占果實面積75%以上。發(fā)病率和病情指數(shù)按照如下公式統(tǒng)計：

x是相對級值；n是每一級值中發(fā)病葡萄的粒數(shù)；N是調(diào)查的葡萄總粒數(shù)。

1.4.2 斑翅果蠅對8種真菌致病性的影響

試驗設(shè)計參考1.4.1。處理5（DS）：將10粒表面消毒過的健康葡萄放置于直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，同時放入10頭斑翅果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）；處理6（Fungus 2）：每種真菌分別制備濃度為1×106cfu/mL的孢子懸浮液，將消毒過的葡萄在孢子懸浮液中浸泡30 s，取出后置于上述條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每10粒葡萄為1個重復(fù)；處理7（Fungus＋DS）：在葡萄上接種真菌后，放入10頭斑翅果蠅成蟲（雌雄比為1∶1）；處理8（CK2）：以不接種真菌和斑翅果蠅的葡萄為對照。每個處理重復(fù)3次。樣品培養(yǎng)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

4種處理條件下，對8種真菌的發(fā)病率、病情指數(shù)的顯著性差異進行S-N-K檢驗，顯著水平為P＜0.05。數(shù)據(jù)分析所用的軟件為SPSS 20.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑腹果蠅對真菌致病性的影響

在模擬田間條件使葡萄存在機械損傷的情況下，各處理中葡萄的發(fā)病率均為100%。待培養(yǎng)5 d后，黑腹果蠅取食后葡萄的病情指數(shù)明顯高于對照。單獨接種8種真菌對葡萄的致病性明顯高于黑腹果蠅的為害程度。與真菌單獨侵染相比，黑腹果蠅和桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、米曲霉聯(lián)合侵害葡萄，使其病情指數(shù)顯著降低。其中，青霉菌和黑腹果蠅復(fù)合侵害后葡萄的腐爛程度甚至低于單獨黑腹果蠅的為害程度。另外，黑腹果蠅對尖孢枝孢屬、細極鏈格孢、黑曲霉、棘孢曲霉的致病性沒有顯著影響（圖1）。

真菌和黑腹果蠅聯(lián)合侵害5 d時，由于黑腹果蠅的添加，真菌的菌絲面積減少；而取食7 d后，黑腹果蠅幼蟲的孵化使葡萄的腐爛程度迅速增加。此時，8種真菌聯(lián)合侵染的病情指數(shù)均高于單獨侵染時的數(shù)值，其中桔青霉、層生鐮刀菌、黑曲霉和棘孢曲霉的病情指數(shù)均高達100（圖2）。

2.2 斑翅果蠅對真菌發(fā)病率的影響

培養(yǎng)5 d后，斑翅果蠅可對所有的葡萄造成危害，發(fā)病率均為100%，顯著高于對照。尖孢枝孢菌和黑曲霉侵染葡萄后明顯低于斑翅果蠅的致腐率。與真菌單獨侵染相比，斑翅果蠅與真菌聯(lián)合侵害并沒有顯著影響葡萄的發(fā)病率。培養(yǎng)7 d后，斑翅果蠅和黑曲霉聯(lián)合侵害葡萄后，降低了黑曲霉的發(fā)病率。斑翅果蠅對其他7種真菌的發(fā)病率均無影響（圖3）。

2.3 斑翅果蠅對真菌病情指數(shù)的影響

在無機械損傷的前提下，分別接種真菌和斑翅果蠅，培養(yǎng)5 d后，真菌單獨侵染的病情指數(shù)高于對照組，卻明顯低于斑翅果蠅侵害后造成的葡萄病情指數(shù)。而斑翅果蠅與桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢和棘孢曲霉聯(lián)合侵害后，與單獨接種真菌相比，葡萄腐爛程度明顯增加。斑翅果蠅與尖孢枝孢菌、米曲霉聯(lián)合侵害葡萄并沒有增加其致病能力，而黑曲霉在斑翅果蠅聯(lián)合侵害下反而降低了黑曲霉的致病能力（圖4）。

圖1 培養(yǎng)5 d后黑腹果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 1 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating five days

圖2 培養(yǎng)7 d后黑腹果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 2 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating sevne days

圖3 斑翅果蠅對8種真菌發(fā)病率的影響Figure 3 Effects of D. suzukii on morbidity of eight fugus species

圖4 培養(yǎng)5 d后斑翅果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 4 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating five days

圖5 培養(yǎng)7 d后斑翅果蠅對8種真菌病情指數(shù)的影響Figure 5 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating seven days

培養(yǎng)7 d后，各處理的葡萄病情指數(shù)均有所上升（圖5）。桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢、棘孢曲霉與斑翅果蠅聯(lián)合侵害葡萄的病情指數(shù)明顯高于真菌單獨危害和斑翅果蠅單獨侵害。尖孢枝孢菌、黑曲霉、米曲霉與斑翅果蠅聯(lián)合侵害的病情指數(shù)與真菌單獨危害均無顯著差異，但仍低于斑翅果蠅對葡萄造成的損傷。

3 討論與結(jié)論

黑腹果蠅為腐生昆蟲，喜食腐爛食物，實則是取食腐爛食物中滋生的微生物或其代謝物質(zhì)，例如酵母以及醋酸菌的代謝產(chǎn)物[14]。研究中，黑腹果蠅真菌感染的葡萄上產(chǎn)卵初期，導(dǎo)致真菌菌絲面積明顯減少，桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、米曲霉4種真菌的病情指數(shù)顯著降低，說明在卵未孵化時，黑腹果蠅的成蟲取食真菌菌絲而導(dǎo)致其發(fā)育受到抑制。而在黑腹果蠅產(chǎn)卵7 d后，孵化為幼蟲取食果肉，增強8種真菌的致病力。

目前，果蠅與葡萄酸腐病之間關(guān)系的研究主要以醋酸菌為研究對象。Ioriatti等[15]發(fā)現(xiàn)，完整的葡萄果實對醋酸菌的敏感性較低，而斑翅果蠅的產(chǎn)卵增加醋酸菌侵染的風(fēng)險，而且斑翅果蠅卵孵化為幼蟲后，醋酸菌的數(shù)量以及乙酸的濃度比卵未孵化時要高，醋酸菌的代謝物質(zhì)誘集大量黑腹果蠅產(chǎn)卵取食，加重酸腐病的發(fā)生程度和面積[16]。但果蠅的取食并不能促進腐爛葡萄中畢赤酵母（Pichia terricola）、孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、株假絲酵母屬（Candida zemplinina）和結(jié)合囊酵母（Zygoascus hellenicus）等酵母屬真菌的發(fā)育[17]。以真菌為研究對象發(fā)現(xiàn)，完整新鮮的葡萄對8種真菌的敏感性明顯低于斑翅果蠅。斑翅果蠅的取食，可為桔青霉、層生鐮刀菌、青霉菌、細極鏈格孢和棘孢曲霉侵染提供更為有利的環(huán)境。但尖孢枝孢菌、米曲霉和黑曲霉并沒有由于斑翅果蠅的取食而增加其致病力。說明斑翅果蠅并不能促進腐爛葡萄中所有微生物的發(fā)育，且抑制黑曲霉的發(fā)育，可能是因為斑翅果蠅分泌的代謝物質(zhì)具有抑菌作用，但仍需要進一步的驗證。

另外，在人工飼料中的白地霉（Geotrichum candidum）和放射狀毛霉（Actinomucor elegans）增加了斑翅果蠅的繁殖量，而籃狀菌屬（Talaromyces minioluteus）則抑制了斑翅果蠅的發(fā)育[18]，但腐爛葡萄中真菌的侵染是否影響兩種果蠅的生長發(fā)育也需要進一步的研究。試驗首次將與葡萄酸腐病相關(guān)的真菌病害為對象，研究結(jié)果可為探索兩種果蠅、葡萄與真菌之間的關(guān)系提供重要的理論基礎(chǔ)。