張濤，顧沛雯，杜娟，陳思杰，李金，賈寶森

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

由藻界卵菌門葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）侵染引起的霜霉病是葡萄生長過程中的毀滅性病害，全世界各葡萄種植區(qū)均有發(fā)生，是葡萄生長過程中的第一大病害[1]。由于該病屬單年流行病害，具有潛育期短、再侵染頻繁、病菌繁殖率高的特點，雨熱同季的氣候易造成病害迅速流行，嚴重影響葡萄的產量和品質[2-3]。葡萄霜霉菌無性繁殖產生的孢子囊抗逆性差、壽命短，自然條件下難以越冬。有性生殖是通過藏卵器與雄器交配產生厚壁卵孢子。卵孢子能夠抵抗不良環(huán)境條件，在病殘體及病田土壤中越冬，但在自然條件下，葡萄霜霉菌的卵孢子較少見。Lehoezky最早發(fā)現(xiàn)卵孢子的存在[4]，隨后Burruano等[5]、Kennelly等[6]、Hong等[7]也相繼在葡萄葉片組織中觀察到卵孢子。在國內，劉延琳等[8]首次在陜西楊凌地區(qū)的葡萄霜霉病葉中發(fā)現(xiàn)卵孢子，隨后金恭璽等[9]采用病部研磨-過篩-離心-鏡檢的方法證明葡萄霜霉菌卵孢子在病殘體上越冬。

目前，國內外學者普遍認為，葡萄霜霉病菌的卵孢子主要在土壤和植物病殘體中越冬。卵孢子萌發(fā)產生的游動孢子可滲入土壤，感染與土壤接觸的莖和葉，造成當年葡萄霜霉病發(fā)生與流行[9-11]。在自然條件下，卵孢子一般有4種生活狀態(tài)：死亡、休眠、萌動和萌發(fā)[12]。處于萌發(fā)狀態(tài)的卵孢子有芽管等侵入結構的產生，可以通過顯微觀察來確定。而處于休眠、萌動和死亡階段的卵孢子在外觀上沒有明顯區(qū)別，無法辨認，在一定程度上阻礙葡萄霜霉病菌病原學和遺傳學的研究。雖然在一些地區(qū)發(fā)現(xiàn)葡萄霜霉菌卵孢子的存在，但未見對釀酒葡萄霜霉菌卵孢子形成及生活力的影響因素進行系統(tǒng)研究的報道，卵孢子在釀酒葡萄霜霉病的生活史和病害循環(huán)中的作用尚未達成共識。以釀酒葡萄品種‘赤霞珠’霜霉病葉為材料，在人工模擬條件下研究霜霉菌卵孢子形成和生活力的影響因素，以期為揭示葡萄霜霉病菌卵孢子萌發(fā)條件和初侵染源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試植物材料

2020年9月在寧夏志輝源石酒莊葡萄園采集的釀酒葡萄品種‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）感染霜霉病葉片。

1.1.2 供試試劑

乳酚油（生工生物工程有限公司，上海），噻唑蘭（MTT）染色劑（生工生物工程有限公司，上海），H2O2溶液（科密歐化學試劑公司，天津），冰乙酸（廣諾科技有限公司，上海），NaOH（雙雙化工有限公司，煙臺）等。

1.1.3 供試儀器

Olympus BX53熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），F(xiàn)SH-2A可調高速均漿機（常州越新儀器制造公司，江蘇），Sigma 3K 15離心機（Sigma公司，美國），RQX-250智能人工氣候箱（躍進醫(yī)療器械有限公司，上海）等。

1.2 影響葡萄霜霉菌卵孢子形成的因素

1.2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子觀察

參照劉紹芹等方法[13]。將霜霉病葉片的病斑部位，用無菌剪刀剪成大小為0.5 mm2的葉盤，后放置于250 mL燒杯中，加入少許乳酚油試劑，在小型控溫電熱爐上煮沸5～10 min，至葉片完全透明。以水為浮載劑，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 不同條件對葡萄霜霉病菌卵孢子形成的影響

取鏡檢無卵孢子形成的葡萄霜霉病葉在室內人工模擬條件下進行試驗。采用4因素4水平正交試驗設計，因素水平設計如表1。溫、濕度處理在人工氣候箱中進行，不同成熟度葉片分別從相同發(fā)病植株的上、中、下和底部采集，接觸物為土壤、沙土、沙子、空白。將不同成熟度的葉片置于裝有不同接觸物培養(yǎng)皿表面，于不同溫濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后鏡檢病斑位置，記錄單位面積的卵孢子數(shù)量。每處理10個葉片，重復3次。

1.3 影響葡萄霜霉菌卵孢子生活力的因素

1.3.1 卵孢子懸浮液制備

采集霜霉病葉，用無菌剪將病斑部位剪下，稱取3 g，加入pH7的磷酸緩沖液，使碎葉全部浸潤，15 min后濾掉緩沖液，置于冰箱中速凍2 h，采用高速勻漿機5000 r/min下勻漿30 min。將所得勻漿液分別通過200目、300目、600目和800目網篩過濾，用自來水反復清洗各個網篩，后用蒸餾水緩慢沖下600目和800目網篩上的卵孢子于50 mL離心管中，5000 r/min離心5 min，棄掉上清液，后加入少量蒸餾水定容至5 mL，備用。

表1 不同因素處理水平Table 1 Treatment levels of different factors

1.3.2 卵孢子生活力的測定

采用張艷菊等[14]的噻唑蘭（MTT）染色法。將制成的卵孢子懸浮液用0.05%的MTT染色劑36 ℃染色48 h，后吸取30 μL在顯微鏡下觀察。每次鏡檢100個卵孢子，3次重復，觀察并記錄死亡（黑色）、休眠（紅色）和萌動（藍色）的卵孢子個數(shù)。

1.3.3 溫度對卵孢子生活力的影響

以室溫25 ℃為對照，共設5個溫度水平：-20、4、10、20、36 ℃。將含有卵孢子的霜霉病葉片置于不同溫度的人工氣候箱中，處理時間為1、3、7、9 d后制成卵孢子懸浮液（同1.2.1）。用MTT染色后鏡檢，并計算死亡率、休眠率和萌動率。每次處理30片葉，重復3次。

1.3.4 濕度對卵孢子生活力的影響

以室內濕度（RH45%）為對照，共設5個濕度水平：30%、60%、80%、90%和100%。將同期采集的霜霉病葉置于不同濕度的人工氣候箱中，處理時間分別為1、3、7、9 d，其余步驟同上。

1.3.5 pH對卵孢子生活力的影響

以pH為7的清水處理為對照，將含有卵孢子的霜霉病葉片置于pH為：4.5、5.5、6.5、7.0、8.5和9.5的溶液中，30 min后用清水沖洗葉片，其余步驟同上。

1.3.6 H2O2對卵孢子生活力的影響

以清水為對照，分別用濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的H2O2溶液處理病斑部位病葉。將葉片全部浸潤在H2O2溶液中，30 min后取出葉片，用蒸餾水反復沖洗2～3次，其余步驟同上。

1.3.7 葉組織提取液對卵孢子生活力的影響

葉組織提取液的制備：稱取10 g健康的葡萄葉片，將表面泥土等雜質沖洗干凈，加入一定量的蒸餾水搗碎，充分研磨后過濾，取濾液，高壓滅菌30 min。以清水處理卵孢子懸浮液為對照，將葉組織提取液與卵孢子懸浮液體積比1∶1混合，分別處理1、4、7、10 d后，MTT染色，測定卵孢子的生活力狀況，重復3次。

1.3.8 土壤浸漬液對卵孢子生活力的影響

土壤浸漬液制備：采集葡萄根際土壤100 g，加100 mL蒸餾水，200 r/min振蕩2 h，過濾，收集濾液，備用。以清水處理為對照，將制備的土壤浸漬液與卵孢子懸浮液分別以體積比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，分別處理3、7、9 d后用MTT染色，測定卵孢子的生活力狀況，重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0軟件進行t檢驗和Duncan氏新復極差法統(tǒng)計分析，并利用OriginPro 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子形成的觀察

利用乳酚油對病斑部位進行透明處理，鏡檢結果表明，能夠清楚的觀察到病斑部位產生的卵孢子（圖1）。

MTT染色結果如圖2所示，若卵孢子被染成紅色或者紫紅色，則其處于休眠狀態(tài)（圖2A）；若為黑色或未著色，則其處于死亡狀態(tài)（圖2B）；若被染成藍色，則其正處于萌動階段（圖2C）。

2.2 影響葡萄霜霉病菌卵孢子形成的因素

以正交設計進行試驗，測定卵孢子的形成數(shù)量，結果如表2所示。溫度為10 ℃時產生的卵孢子最多為17個/cm2；其次是90%濕度為15個/cm2，-20 ℃沒有卵孢子形成。復合因素條件下，以10 ℃、飽和濕度（100%），與壤土接觸的中部葉片產生的卵孢子最多為7個/cm2；其次是10 ℃、90%濕度，與沙土接觸的上部葉片產生了6個/cm2。由極差大小可知，溫度＞濕度＞接觸物＞葉片成熟度，表明溫度對卵孢子的形成影響程度最大，依次為濕度、接觸物和葉片成熟度。

2.3 溫度對卵孢子生活力的影響

圖3結果顯示，與對照處理（CK）相比，不同溫度處理對卵孢子生活力有顯著影響，36 ℃高溫處理萌動率和死亡率最高，休眠率最低。處理3 d時，萌動率最高為10%；處理9 d時，死亡率最高為22%，休眠率最低為76%。4 ℃低溫處理3 d和7 d時，休眠率最高，均為94%；死亡率均最低，均為4%；-20 ℃所有處理均無卵孢子萌動，且隨著處理時間的延長，死亡率明顯升高。在4～10 ℃有利于卵孢子的休眠，平均休眠率超過90%以上；在4～36 ℃范圍內，隨著溫度升高，打破休眠，卵孢子萌動率增加，且死亡率也伴隨增加。

圖1 葡萄霜霉病菌卵孢子觀察Figure 1 Observation on oospores of downy mildew

圖2 葡萄霜霉病菌卵孢子MTT染色Figure 2 MTT staining of oospores of downy mildew of grapevine

2.5 濕度對卵孢子生活力的影響

圖4結果顯示，濕度在45%～100%時，隨著濕度的升高，萌動率逐漸升高，休眠率逐漸降低，死亡率也有明顯降低。飽和濕度處理3 d時，萌動率最高達12%，且死亡率最低為2%。濕度低于60%時，卵孢子死亡率普遍較高，且不利于萌發(fā)，其中以濕度為30%、處理9 d時死亡率達到最高，為23%。在60%～100%濕度范圍內，隨著濕度增加，卵孢子萌動率升高，而45%以下的濕度有利于卵孢子休眠，且隨著濕度減低，死亡率上升。

2.6 pH對卵孢子生活力的影響

圖5結果顯示，pH在6.5～7范圍內有利于卵孢子存活，其中pH為6.5時，卵孢子休眠率最高為92%；pH為7時，萌動率最高為6%，死亡率最低為4%，說明中性環(huán)境有利于卵孢子的存活和萌動。pH高于8.5或低于5.5時，卵孢子生活力均顯著減低。其中pH 4.5時，卵孢子死亡率最高達到32%；其次是pH為9.5時，達到26%。

2.7 H2O2對卵孢子生活力的影響

圖6結果顯示，在0.5%～0.9%H2O2濃度時，隨著濃度的增加，卵孢子的萌動率和死亡率均升高，休眠率下降。其中H2O2溶液濃度為0.9%時，卵孢子的死亡率和萌動率最高，分別為19%和24%；休眠率最低為57%。而對照處理的休眠率最高，為91%；死亡率和萌動率最低，分別為5%和4%。

2.8 葉組織提取液對卵孢子的生活力影響

圖7結果顯示，葉組織提取液和對照處理相比沒有顯著差異，對照處理7 d萌動率最高為5%，休眠率和死亡率之間無顯著差異。

2.9 土壤浸漬液對卵孢子生活力的影響

由圖8可知，與對照處理相比，土壤浸漬液對卵孢子的萌動有較為顯著的影響。當體積比為1∶4處理3 d時，萌動率最高為14%；處理9 d時，死亡率最高為11%。其次，體積比1∶3處理9 d，萌動率為12%；體積比1∶1處理9 d，休眠率最高為94%；處理7 d時，萌動率最低為2%。但各種處理對死亡和休眠的影響并不顯著。

表2 溫度、濕度、葉片成熟度、接觸物對葡萄霜霉菌卵孢子形成的影響Table 2 Effects of temperature, humidity, leaf maturity, and contact materials on oospore formation of downy mildew of grapevine

圖3 不同溫度對釀酒葡萄卵孢子生活力的影響Figure 3 Effect of different temperatures on the viability of wine grape oospores

圖4 不同濕度對卵孢子生活力的影響Figure 4 Effect of different humidity on the viability of oospores

圖5 不同pH對卵孢子生活力的影響Figure 5 Effect of different pH on the viability of oospores

圖6 不同濃度H2O2對卵孢子生活力的影響Figure 6 Effect of different concentrations of H2O2 on the viability of oospores

圖7 葉組織提取液對卵孢子生活力的影響Figure 7 Effect of leaf tissue extract on the viability of oospores

圖8 土壤浸漬液對卵孢子生活力的影響Fig 8 Eeffect of soil maceration extract solution on the viability of oospores

3 討論

目前國內釀酒葡萄霜霉病的研究主要集中在病害發(fā)生危害、綜合防治、寄主抗性及預測預報等方面[1,15]。有關生物特性研究也主要針對霜霉病菌無性階段的孢子囊，而對病原菌有性階段的卵孢子研究較少。對影響卵孢子形成、萌動及存活能力因素的研究尚未見報道，所以卵孢子在生活史和病害循環(huán)中的作用尚不完全清楚。通過對‘赤霞珠’葡萄霜霉病菌卵孢子形成影響因素的研究表明，依影響程度排序為溫度＞濕度＞接觸物＞葉片成熟度。在10 ℃、飽和濕度下，與壤土接觸的中部葉片產生的卵孢子最多為7個/cm2。這與張艷菊等[14]的結果相似，說明在人工模擬條件下，采用寄主組織法在適宜的條件下能夠獲得霜霉病菌的卵孢子。

近年來，MTT染色法已被廣泛應用于卵孢子活性檢測中。Xavier等[16]利用MTT法首次對櫟樹猝死病菌（Phytophthora ramorum）卵孢子生活力進行測定。在國內，文景芝等[17]和張艷菊等[14]將其用于大豆疫霉（Phytophthora）和黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）卵孢子生活力檢測。研究利用MTT法首次對釀酒葡萄霜霉病菌卵孢子的生活力進行測定，證明MTT染色劑能準確反映卵孢子生活力狀況，是一種效果良好的細胞活性指示劑。

卵孢子是葡萄霜霉病菌抵御不良環(huán)境的一種生存機制，可以在土壤中存活2年甚至更長時間[7]。自然條件下，葡萄霜霉病菌卵孢子在形成后需要經歷一段時間的休眠，在一定的外界刺激后，才會由休眠狀態(tài)轉入萌動狀態(tài)[17]。對卵孢子生活力研究發(fā)現(xiàn)，溫度、濕度、pH、過氧化物和土壤浸漬液等對卵孢子的萌動都有一定影響。Toffolatti等[18]研究認為，溫度是決定卵孢子萌動和萌發(fā)速率的主要限制因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在4～25 ℃范圍內，隨著溫度的升高，萌動率也隨之升高，說明一定的高溫刺激可有效打破卵孢子的休眠，溫度過低則會抑制卵孢子萌動。濕度在60%以下不利于卵孢子的萌動，同時隨著處理時間的增長死亡率也逐漸升高，說明水分是影響卵孢子長期存活的重要因素，且較高的濕度更有利于卵孢子萌動，這與Burruano和Ciofalo等[19]研究結果基本一致。一定濃度的過氧化物可有效打破卵孢子的休眠，促進萌發(fā)，但濃度過高也會導致卵孢子死亡。因此可在葡萄霜霉菌卵孢子打破休眠后，應用此法促進卵孢子萌發(fā)，為今后卵孢子萌發(fā)和侵染試驗及其生理和生化特性研究奠定基礎。此外，過酸性或過堿性的環(huán)境不利于卵孢子萌動和休眠，還會導致卵孢子的迅速死亡。這可能是因為在酸性和堿性環(huán)境中，卵孢子的細胞壁和細胞膜的功能被破壞，使有害物質進入細胞內，從而導致卵孢子失活[19]。土壤浸漬液可明顯提高卵孢子的萌動率，這可能與葡萄根際土壤中所含的Ca2+有關。Berridge等[20]認為，影響卵孢子萌動的因素除了溫度、濕度等外，還與環(huán)境中的Ca2+密切相關。Ca2+進入卵孢子細胞內可以激發(fā)相應生理過程酶的活性，進而促進卵孢子萌動。但目前有關Ca2+作為外源誘因激發(fā)卵孢子萌動的機理還需要深入研究。

4 結論

溫度和濕度對卵孢子的形成有明顯影響，采用寄主組織法在適宜的條件下能夠獲得霜霉病菌的卵孢子，同時較高的溫濕度、一定濃度的過氧化物和土壤浸漬液對卵孢子的萌動有促進作用。此次研究對卵孢子的生理生化特性有了初步了解，明確了促進卵孢子形成和萌動的一些基礎因素，為后續(xù)開展卵孢子萌發(fā)試驗及初侵染來源研究奠定了基礎。