吳珍珍 劉志宏 孫麗

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（廣州510515）

胃癌是我國乃至全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)排第4 位，死亡率則高居世界第二［1］。近年來隨著免疫治療、靶向治療等新興治療手段的興起，胃癌患者的生存較前有所延長，但目前通過綜合治療，胃癌患者總體生存尚不理想［2］。目前仍需進(jìn)一步探索新的預(yù)后標(biāo)志物指導(dǎo)胃癌精準(zhǔn)個體化治療。

氧化應(yīng)激是機體內(nèi)活性氧生成與抗氧化機制之間相互平衡的適應(yīng)性反應(yīng)過程，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一［3］。研究顯示，胃腺癌患者體內(nèi)存在過高的氧化應(yīng)激水平及過低的抗氧化水平［4］，而過度的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，提高胃癌細(xì)胞對氧化應(yīng)激的適應(yīng)能力，加速其進(jìn)展［5］。因此，抑制氧化應(yīng)激及其下游信號通路有望成為胃癌治療的新方向。

PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN?induced kinas 1，PINK1）是一種參與細(xì)胞內(nèi)多個線粒體相關(guān)信號通路的蛋白［6］。研究顯示，氧化應(yīng)激下，PINK1 通過上調(diào)Bcl?xL等凋亡相關(guān)蛋白，調(diào)控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進(jìn)細(xì)胞存活［7-9］。然而，目前PINK1 是否調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)的腫瘤進(jìn)展尚未明確，PINK1 是否參與胃癌發(fā)生發(fā)展亦鮮有研究。本研究旨在分析PINK1 在胃癌中的表達(dá)情況及其對胃癌患者預(yù)后和化療療效的預(yù)測作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與材料

1.1.1 組織標(biāo)本3 對新鮮胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本和153 例胃癌石蠟病理標(biāo)本均取自南方醫(yī)院。經(jīng)組織病理明確病理類型為胃腺癌。組織學(xué)分類及分級、臨床及病理分期參考世界衛(wèi)生組織（WHO）胃癌病理標(biāo)準(zhǔn)及國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC/AJCC）制定的第七版胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)。所有病例隨訪資料齊全，并已通過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的申請。

1.1.2 主要試劑基因引物序列見表1，購自上海生工生物工程股份有限公司。PINK1 蛋白、GAP?DH 蛋白抗體均購自Abcam 公司。

表1 引物序列列表Tab.1 Primer′s sequences

1.2 方法

1.2.1 KM?Plotter 網(wǎng)站數(shù)據(jù)分析登陸KM?Plotter在線生存分析網(wǎng)站（http：//kmplot.com/analysis/）進(jìn)行生存分析［10］。共納入876 例隨訪資料齊全的胃癌患者測序結(jié)果進(jìn)行分析。以PINK1 基因中位表達(dá)作為分界線，定義PINK1 低表達(dá)及高表達(dá)。

1.2.2 qRT?PCR提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT?PCR）檢測細(xì)胞中PINK1 mRNA 表達(dá)量，選取GAPDH 作為內(nèi)參測算相對定量值。

1.2.3 Western blot提取胃癌組織總蛋白后高溫變性并上樣至聚丙烯酰胺分離凝膠。蛋白電泳分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，洗滌，熒光二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3 次。紅外激光成像分析系統(tǒng)（雙色odyssey）下顯示PINK1 和GAPDH 的蛋白顯影條帶。

1.2.4 免疫組化染色石蠟病理標(biāo)本切片（厚度4 μm）并進(jìn)行脫蠟至水及抗原修復(fù)。PINK1 一抗4 ℃孵育過夜，洗滌。二抗4 ℃孵育1 h 后室溫孵育1 h。經(jīng)過二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染后進(jìn)行梯度脫水及樹膠封片。由3 位不同研究者鏡下觀察，結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行PINK1 免疫組化評分，根據(jù)其表達(dá)強弱分為0～6 分，其中0 分為陰性表達(dá)，1～5 分為陽性表達(dá)，6 分為強陽性表達(dá)。

英語新聞中很多新詞的創(chuàng)造是基于隱喻之上的，與此同時，隱喻為很多原有詞匯披上了一層面紗，賦予其新的意義。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計分析及圖表繪制使用SPSS 23.0及GraphPad Prism 7 軟件。采用兩獨立樣本t檢驗或Mann?WhitneyU檢驗進(jìn)行兩組間比較，采用單因素方差分析進(jìn)行兩組以上比較。采用χ2檢驗進(jìn)行組間比較。繪制受試者工作特征（ROC）曲線并計算曲線下面積，采用最大Youden 指數(shù)法計算截斷值，以評估預(yù)后預(yù)測價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KM?Plotter 網(wǎng)站分析PINK1 在胃癌中的表達(dá)及與預(yù)后、化療療效的相關(guān)性為明確PINK1 是否在胃癌中高表達(dá)并與胃癌患者預(yù)后及化療療效相關(guān)，首先在KM?Plotter 網(wǎng)站上進(jìn)行初步分析。共有876 例隨訪資料齊全的胃癌患者測序結(jié)果納入分析，患者基線特征見表2。以PINK1 基因中位表達(dá)作為分界線，定義PINK1 低表達(dá)及高表達(dá)。結(jié)果顯示，對于所有納入分析的患者，PINK1 基因高表達(dá)者的中位生存期為26 個月，短于低表達(dá)者的46 個月，生存風(fēng)險比為0.56，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.000 1，圖1A）。進(jìn)一步分層分析顯示，在不同臨床分期、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不同病理分型亞組中，PINK1 高表達(dá)患者的生存期均顯著低于低表達(dá)患者（圖1B?D），但不同分化程度亞組中PINK1 高低表達(dá)兩組胃癌患者預(yù)后無顯著性差異（圖1E）。對于Her2 高表達(dá)的這部分患者，PINK1高表達(dá)患者雖然有更差的生存期，但數(shù)據(jù)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.075，圖2A）。對于接受了以5?Fu 為基礎(chǔ)的輔助治療的患者中，PINK1 高表達(dá)者生存期較低表達(dá)者顯著延長（P=0.036，圖2B）。

表2 KM?Plotter 網(wǎng)站分析中胃癌患者的基線特征Tab.2 Baseline characteristics of gastric cancer patients in KM plotter website analysis 例（%）

2.2 臨床資料驗證PINK1 在胃癌的表達(dá)情況及預(yù)后分析首先收集了3 對新鮮胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，進(jìn)行PINK1 mRNA qPCR 檢測，結(jié)果顯示，PINK1 的基因表達(dá)在胃癌組織中明顯升高（P＜0.001，圖3A）。隨后，在3對胃癌及癌旁組織中進(jìn)行PINK1蛋白表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，PINK1 蛋白在胃癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05，圖3B-C）。

此外，收集了隨訪資料齊全的153 例胃癌患者隨訪資料齊全的胃癌石蠟標(biāo)本，并進(jìn)行切片、PINK1免疫組化染色、讀片，患者基線特征見表3。結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，胃癌組織的PINK1 表達(dá)量顯著增加（P＜0.05，圖4A?B），且其表達(dá)強度與腫瘤浸潤深度及分期呈正相關(guān)（圖4C，P＜0.05）；PINK1在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖4D）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖4E）的胃癌患者中表達(dá)量顯著高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。PINK1蛋白高表達(dá)的胃癌患者其總生存期較低表達(dá)患者顯著縮短（圖4F）。接受以5?Fu輔助化療的胃癌患者中，PINK1蛋白高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)患者顯著延長（圖4G）。

表3 臨床資料分析中胃癌患者的基線特征Tab.3 Baseline characteristics of gastric cancer patients in clinical data analysis 例（%）

2.3 臨床數(shù)據(jù)分析PINK1 在預(yù)測胃癌患者預(yù)后及化療療效中的作用PINK1免疫組化評分預(yù)測胃癌患者預(yù)后ROC 曲線見圖5A，截斷值為4.50，AUC（曲線下面積）為0.772（95%CI：0.642～0.901），敏感性為69.2%，特異性為76.0%，Youden 指數(shù)為0.452（表4）。PINK1 免疫組化評分預(yù)測胃癌患者5?Fu化療療效ROC 曲線如圖5B，截斷值為5.50，AUC為0.735（95%CI：0.598 ～0.872），敏感性為60.0%，特異性為76.9%，Youden 指數(shù)為0.369（表4）。

3 討論

圖1 KM?Plotter 數(shù)據(jù)庫分析提示PINK1 表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)Fig.1 KM?Plotter data analysis indicate that PINK1 is associated with adverse prognosis of gastric cancer patients

表4 PINK1 預(yù)測胃癌患者預(yù)后及化療療效分析Tab.4 PINK1 predicts the prognosis of patients with gastric cancer and the efficacy of chemotherapy

圖2 KM?Plotter 數(shù)據(jù)庫分析提示PINK1 表達(dá)與HER2 表達(dá)及5?Fu 化療療效相關(guān)Fig.2 KM?Plotter data analysis indicate that PINK1 is associated with HER2 expression and 5?Fu chemotherapy effect of gastric cancer patients

圖3 PINK1 在胃癌組織中基因水平和蛋白水平均顯著高表達(dá)Fig.3 PINK1 is significantly high?expressed on gene level and protein level in gastric cancer tissue

圖4 臨床資料分析顯示PINK1 在胃癌中高表達(dá)并與患者不良預(yù)后相關(guān)Fig.4 Clinical data analysis indicate that PINK1 is highly?expressed in gastric cancer tissue and correlated to adverse prognosis

圖5 PINK1 預(yù)測胃癌患者預(yù)后及5?Fu 輔助化療療效的ROC 曲線Fig.5 ROC curves of PINK1 predicting prognosis and 5?Fu chemotherapy efficacy

在既往的研究中，PINK1 除了在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用外，與腫瘤藥物治療敏感性相關(guān)也有基礎(chǔ)研究結(jié)果支持［14-15］。臨床數(shù)據(jù)分析顯示食管癌患者中PINK1 蛋白高表達(dá)與氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療療效不佳相關(guān)，體外細(xì)胞實驗也證實PINK1 與食管癌細(xì)胞對氟尿嘧啶化療藥物抵抗相關(guān)，而抑制線粒體自噬或敲低PINK1可增加食管癌細(xì)胞對氟尿嘧啶的化療敏感性［16］。此外，在非小細(xì)胞肺癌中，PINK 通過參與調(diào)控NF?κB 信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；而敲低PINK1 則可增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［17］。本研究顯示，PINK1 高表達(dá)的患者，在接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療后，其生存期反而較低表達(dá)患者顯著延長，提示PINK1 高表達(dá)胃癌患者可能是對氟尿嘧啶治療敏感的優(yōu)勢人群。對于PINK1 表達(dá)與接受氟尿嘧啶輔助治療患者療效相關(guān)的潛在分子機制，筆者推測可能為PINK1 在胃癌細(xì)胞中參與調(diào)控氟尿嘧啶藥物敏感性。對于接受其他輔助治療的人群，PINK1 表達(dá)量與預(yù)后無關(guān)，其潛在機制有待進(jìn)一步研究。

本研究在驗證PINK1 在胃癌中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)后，進(jìn)一步運用ROC 曲線分析PINK1 在預(yù)測胃癌患者預(yù)后及化療療效中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測胃癌患者預(yù)后方面，當(dāng)PINK1 免疫組化評分為4.50 時，AUC 為0.772，預(yù)后不良的敏感性是69.2%，特異性是76.0%；在預(yù)測胃癌患者5?Fu 輔助化療療效方面，當(dāng)PINK1 免疫組化評分為5.50 時，AUC 為0.735，療效良好的敏感性是60.0%，特異性是76.9%。結(jié)果表明，PINK1 高表達(dá)可在一定程度上預(yù)測胃癌患者不良預(yù)后和5?Fu 輔助化療療效，但敏感性及特異性等預(yù)測效能相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)不理想。

綜上，本研究通過數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析、臨床資料驗證等手段首次發(fā)現(xiàn)PINK1 在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤浸潤深度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤病理分級呈正相關(guān)；與此同時，生存分析顯示，PINK1 低表達(dá)患者，無論分期、轉(zhuǎn)移、病理分級情況如何，其生存期均顯著延長，并通過臨床資料分析在方法學(xué)上初步探討PINK1 對胃癌預(yù)后及化療療效的預(yù)測價值，驗證PINK1 在胃癌中高表達(dá)，且對胃癌患者預(yù)后及化療療效有一定的預(yù)測作用。然而，本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)PINK1 高表達(dá)此單一指標(biāo)對胃癌患者預(yù)后的預(yù)測效能不高。目前研究表明單個指標(biāo)預(yù)測效能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于多個指標(biāo)聯(lián)合的預(yù)測效能，國內(nèi)外有關(guān)腫瘤研究已經(jīng)積累了大量的包括基因組，轉(zhuǎn)錄組，表觀組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，以及相關(guān)臨床影像和病理信息等數(shù)據(jù)，未來需要通過集成、整合、分析不同來源、不同層次的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步構(gòu)建胃癌模型以達(dá)到精準(zhǔn)的預(yù)測效果。