朱沛煌，陳 妤，季孔庶

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037)

萜類(lèi)化合物(terpenoids)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)極為豐富的天然產(chǎn)物，目前已在細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)以及植物等生命體中發(fā)現(xiàn)8萬(wàn)余種天然萜類(lèi)化合物及其衍生物[1-5]。萜類(lèi)是植物合成種類(lèi)最多的一類(lèi)代謝物，少部分萜類(lèi)作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的初級(jí)代謝物發(fā)揮生理作用，如赤霉素、脫落酸、類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素等[6]；絕大多數(shù)萜類(lèi)作為植物的次生代謝產(chǎn)物，在植物適應(yīng)環(huán)境、傳遞信息和化學(xué)防御等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如一些揮發(fā)性萜類(lèi)作為花香產(chǎn)生的主要物質(zhì)能夠吸引授粉生物，有些具有毒性的萜類(lèi)可以作為植物毒素來(lái)防御食草動(dòng)物、有害昆蟲(chóng)和病原微生物等，某些萜類(lèi)還具有介導(dǎo)植物與周?chē)锖头巧镆蛩叵嗷プ饔玫纳鷳B(tài)功能[7-9]。植物萜類(lèi)化合物在人類(lèi)社會(huì)中也具有重要的價(jià)值，例如馬尾松(Pinusmassoniana)、濕地松(P.elliottii)等針葉樹(shù)產(chǎn)生的松脂中含有大量的單萜和二萜，可以用來(lái)提取松節(jié)油和松香應(yīng)用于化工和生物燃料等領(lǐng)域[10]，一些特殊的萜類(lèi)化合物具有重要的藥用功能，如紫杉醇、雷公藤素以及青蒿素等[11-13]。

位于Rue du Faubourg大街的Lemarié羽飾坊收藏有許多珍稀的羽毛，如白鷺與風(fēng)鳥(niǎo)、兀鷲、天鵝、孔雀的羽毛。這些經(jīng)過(guò)Lemarié“羽毛工人”染色、修剪、卷毛和壓碎后，都成為了時(shí)裝的裝飾要素。

但由于不同主體在回應(yīng)鄉(xiāng)村問(wèn)題時(shí)采取不同的策略，差異化的鄉(xiāng)建模式有各自的優(yōu)點(diǎn)和運(yùn)用局限（表2）。鄉(xiāng)建沒(méi)有統(tǒng)一的模板，應(yīng)基于不同村莊的自然、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、文化背景，從而探索出適應(yīng)自身發(fā)展的道路[19，20]。任何一種鄉(xiāng)村實(shí)踐，都不可能面面俱到，需要分清主次、懂得取舍，在傳承過(guò)去、踐行現(xiàn)在、發(fā)展未來(lái)之間取得平衡

松科(Pinaceae)是裸子植物(gymnosperms)中最大的科，有10屬約230種，我國(guó)有10屬約113種。松科植物是重要的紙漿、實(shí)木用材樹(shù)種，多數(shù)是重要的綠化造林樹(shù)種，有些可采割松脂用于提取松節(jié)油與松脂，具有重要的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14-15]。萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)多樣性的形成主要依賴萜類(lèi)合成酶(terpene synthases，TPSs)[16]，近年來(lái)以基因組學(xué)技術(shù)為代表的生物技術(shù)發(fā)展迅速促進(jìn)了松科植物萜類(lèi)合成酶基因家族成員的發(fā)現(xiàn)和研究。本研究重點(diǎn)介紹近年松科植物萜類(lèi)合成酶及其基因家族的研究進(jìn)展，以期為松科植物萜類(lèi)化合物生物合成分子機(jī)制的完善和國(guó)內(nèi)松科植物的相關(guān)遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

對(duì)于已經(jīng)實(shí)施計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)微課資源開(kāi)發(fā)的高職院校，其先進(jìn)的教學(xué)理念是值得認(rèn)可的，但是其對(duì)于微課資源的開(kāi)發(fā)方面還存在一定的不足，對(duì)微課的認(rèn)識(shí)上存在一定的問(wèn)題，導(dǎo)致計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)微課資源開(kāi)發(fā)的效果并不理想[1]。

1 植物萜類(lèi)化合物前體的合成及其關(guān)鍵酶基因

TPS-a、TPS-b和TPS-g這3個(gè)亞家族在系統(tǒng)發(fā)育上與其他4個(gè)亞家族有較大差異，其中絕大部分基因都是被子植物中與次生代謝相關(guān)的單萜合成酶、倍半萜合成酶或者二萜合成酶基因。其中基因數(shù)量最多的是TPS-a亞家族，大多數(shù)都是倍半萜合成酶基因，幾乎占到被子植物萜類(lèi)合成酶總數(shù)的一半，并且又可根據(jù)單/雙子葉植物分成TPS-a1和TPS-a2組[16]。TPS-b亞家族大多是環(huán)狀單萜合成酶基因和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，絕大多數(shù)TPS-b基因分布在雙子葉植物中，但在單子葉植物高粱(Sorghumbicolor)中也發(fā)現(xiàn)過(guò)TPS-b基因[62]。TPS-g亞家族基因缺失“RR(X)8W”基序，包含單萜合成酶、倍半萜合成酶以及二萜合成酶，但產(chǎn)物幾乎都是非環(huán)狀萜類(lèi)[16]。

圖1 植物萜類(lèi)合成途徑(據(jù)文獻(xiàn)[61, 66]整理)Fig.1 Terpenoids biosynthesis pathways in plants(adapted from [61, 66])

2 植物萜類(lèi)合成酶的結(jié)構(gòu)和類(lèi)型

植物萜類(lèi)合成酶基因家族大小不等，除小立碗蘚較為特別，從其基因組中只鑒定出1個(gè)有功能的萜類(lèi)合成酶基因，其他植物基因組中鑒定到的萜類(lèi)合成酶基因(含假基因)數(shù)量為18～172[32,38,48]。被子植物中已經(jīng)報(bào)道可能有功能的植物萜類(lèi)合成酶基因家族有擬南芥32個(gè)[49]、巨桉(Eucalyptusgrandis)113個(gè)[48]、葡萄(Vitisvinifera)69個(gè)[44]、毛果楊(Populustrichocarpa)38個(gè)[50]、番茄(Lycopersiconesculentum)29個(gè)[51]、鳳梨(Ananascomosus)21個(gè)[52]以及水稻(Oryzasativa)32個(gè)[16]等。被子植物基因組中有相當(dāng)數(shù)量的萜類(lèi)合成酶基因在較短的基因組區(qū)域中串聯(lián)排列，通常這些串聯(lián)基因都具有較高的同源性，例如葡萄中有85%的萜類(lèi)合成酶在基因組中是串聯(lián)的，其18號(hào)染色體上有45個(gè)萜類(lèi)合成酶基因串聯(lián)出現(xiàn)在1個(gè)690 kb的基因簇中[44]；而水稻也有66%的萜類(lèi)合成酶基因在基因組中串排列，其4號(hào)染色體的1個(gè)480 kb的基因簇上發(fā)現(xiàn)了14個(gè)萜類(lèi)合成酶基因[16]。植物萜類(lèi)合成酶高度串聯(lián)和較高同源性的情況，可能是其進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生基因復(fù)制事件的證據(jù)之一。

左圖為大冷杉(Abies grandis)二萜合成酶AgAS晶體結(jié)構(gòu)[28]。The crystal structure of diterpene synthase AgAS from Abies grandis is shown on the left[28].圖2 植物萜類(lèi)合成酶結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of terpene synthases in plants

Class I型酶的催化活性位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)C端的α結(jié)構(gòu)域，具有1個(gè)高度保守并富含天冬氨酸的活性位點(diǎn)基序“DDXXD”，同一個(gè)結(jié)構(gòu)域中還包含1個(gè)保守程度不高的“NSE/DTE”基序，這兩個(gè)基序位于活性中心袋口的兩個(gè)反向螺旋上。Class Ⅰ型萜類(lèi)合成酶包括了所有的單萜合成酶與倍半萜合成酶，以及部分二萜合成酶[5,29](圖2)。Class I型萜類(lèi)合成酶α結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)基序能夠結(jié)合3個(gè)Mg2+，并通過(guò)Mg2+與異戊烯基二磷酸底物的二磷酸(PPi)基團(tuán)作用幫助底物進(jìn)入活性中心，然后PPi基團(tuán)離子化從底物分子上發(fā)生裂解，生成高度活化的碳正離子中間體并發(fā)生環(huán)化反應(yīng)[30]。

Class Ⅱ活性位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)N端的β結(jié)構(gòu)域，含有1個(gè)保守的活性位點(diǎn)基序“DXDD”。Class Ⅱ型的萜類(lèi)合成酶只包括部分二萜合成酶，更接近N端的γ結(jié)構(gòu)域含有1個(gè)富含酸性氨基酸的“EDXXD”基序，可以提高Class Ⅱ活性位點(diǎn)的催化活性[1](圖2)。Class Ⅱ型萜類(lèi)合成酶中“DXDD”活性位點(diǎn)可以促使異戊烯基二磷酸底物中的雙鍵質(zhì)子化，從而形成碳正離子中間體，再進(jìn)一步發(fā)生多步連續(xù)環(huán)化，并終止于質(zhì)子消除反應(yīng)[1,31]。而Class Ⅰ/Ⅱ型酶擁有“EDXXD”、“DXDD”和“DDXXD”這3個(gè)活性基序。Class Ⅰ型和Class Ⅱ型兩種類(lèi)型的萜類(lèi)合成酶活性中心催化碳正離子中間體形成的機(jī)制不同，Class Ⅱ型酶通過(guò)催化底物質(zhì)子化引發(fā)碳正離子中間體形成，而Class Ⅰ型酶通過(guò)催化PPi基團(tuán)電離形成碳正離子中間體。

大部分單萜和二萜的直接前體GPP和GGPP在質(zhì)體中合成，而倍半萜直接前體FPP在胞質(zhì)中合成，因而大多數(shù)單萜/二萜合成酶與倍半萜合成酶在細(xì)胞內(nèi)的定位不同。質(zhì)體定位的單萜/二萜合成酶蛋白質(zhì)N端具有質(zhì)體信號(hào)肽[36](圖2)。有研究認(rèn)為信號(hào)肽從N端“RRX8W”基序中的切除與否對(duì)單萜合成酶的催化活性有顯著影響[37]。

有學(xué)者在江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)基因組中發(fā)現(xiàn)1種新型的類(lèi)微生物萜類(lèi)合成酶(microbial-like terpene synthases，MTPSLs)基因，其更接近微生物萜類(lèi)合成酶基因，基因內(nèi)含子數(shù)目、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)目與典型的植物萜類(lèi)合成酶基因差異較大。類(lèi)微生物萜類(lèi)合成酶編碼酶蛋白除了Class I型酶中典型的“DDXXD”基序，在其1級(jí)結(jié)構(gòu)中還發(fā)現(xiàn)了“DDXXXD”和“DDXXX”基序[32]。近年來(lái)在更多古老非種子陸地植物，如地錢(qián)(Marchantiapolymorpha)、角苔(Anthocerospunctatus)、巖蕨(Woodsiailvensis)和三葉粉葉蕨(Pityrogrammatrifoliata)等中發(fā)現(xiàn)了微生物型萜類(lèi)合成酶基因[33-35]。

有學(xué)者認(rèn)為小立碗蘚(Physcomitriumpatens)唯一的雙功能Class Ⅰ/Ⅱ型二萜合成酶柯巴基焦磷酸合酶/貝殼杉烯合成酶(copalyl diphosphate synthase/ kaurene synthase，CPS/KS)可能是植物萜類(lèi)合成酶的祖先基因，并且認(rèn)為植物萜類(lèi)合成酶祖先基因出現(xiàn)于裸子植物與被子植物分化之前[38-41]。有學(xué)者進(jìn)一步提出細(xì)菌、真菌和植物間可能有一個(gè)共同的二萜合成酶祖先基因[42]。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的植物萜類(lèi)合成酶晶體結(jié)構(gòu)[28,31]，發(fā)現(xiàn)了某些γ結(jié)構(gòu)域缺失或者γ、β、α結(jié)構(gòu)域保留但缺少Class Ⅰ或Class Ⅱ活性的萜類(lèi)合成酶[43]，以及一些具有催化C10/C15或C15/C20混合底物能力的萜類(lèi)合成酶[44-45]等研究證據(jù)，推測(cè)最早由兩個(gè)分別具有γ、β結(jié)構(gòu)域和α結(jié)構(gòu)域的祖先基因融合產(chǎn)生了具有γ、β、α結(jié)構(gòu)的祖先萜類(lèi)合成酶基因，在其后進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了γ結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)基因丟失事件形成β、α結(jié)構(gòu)的萜類(lèi)合成酶基因，并且隨著信號(hào)肽與結(jié)合底物能力的改變逐漸形成了現(xiàn)有植物單萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶基因等的植物萜類(lèi)合成酶基因家族[20,46-47]。序列分析表明裸子植物和被子植物中的二萜合成酶柯巴基焦磷酸合酶和貝殼杉烯合成酶基因可能都是從祖先CPS/KS基因復(fù)制獲得，而CPS和KS酶的亞功能化分離可能是2個(gè)祖先復(fù)制基因突變導(dǎo)致其編碼酶蛋白中的1個(gè)結(jié)構(gòu)域(Class Ⅰ或Class Ⅱ)活性喪失形成的[16]。

3 萜類(lèi)合成酶基因家族的鑒定與系統(tǒng)分類(lèi)及其在松科植物中的特點(diǎn)

植物萜類(lèi)合成酶蛋白由模塊化的3個(gè)相對(duì)保守的α螺旋結(jié)構(gòu)域(γ、β和α)組成，幾乎所有萜類(lèi)合成酶都包含β和α結(jié)構(gòu)域，部分倍半萜合成酶與絕大多數(shù)二萜合成酶含有γ結(jié)構(gòu)域[5,27-28](圖2)。植物萜類(lèi)合成酶1級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)活性位點(diǎn)基序(Class Ⅰ和Class Ⅱ)，根據(jù)含其中1個(gè)或2個(gè)活性位點(diǎn)基序，可以將萜類(lèi)合成酶劃分為Class Ⅰ型、Class Ⅱ型或Class Ⅰ/Ⅱ型[16,27-28](圖2)。

松科植物由于基因組巨大，造成基因組測(cè)序組裝工作較其他植物有更大難度，近年來(lái)僅報(bào)道有白云杉(Piceaglauca，20.8 Gb)[53-54]、挪威云杉(P.excelsa，19.6 Gb)[55]與火炬松(P.taeda，22 Gb)[56-57]全基因組草圖。Warren等[53]從白云杉基因組中鑒定了83個(gè)萜類(lèi)合成酶基因，包括55個(gè)可能有功能的萜類(lèi)合成酶基因以及28個(gè)假基因，陳小娥[58]從火炬松基因組中鑒定了68個(gè)萜類(lèi)合成酶基因，為其他松科植物萜類(lèi)合成酶基因數(shù)量提供了參考。Keeling等[59]與Celedon等[60]分析云杉轉(zhuǎn)錄組中萜類(lèi)合成酶轉(zhuǎn)錄本信息，結(jié)果表明云杉個(gè)體中可能有超過(guò)60個(gè)不同的萜類(lèi)合成酶轉(zhuǎn)錄本。

根據(jù)對(duì)已有植物萜類(lèi)合成酶基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，通?？蓪⒅参镙祁?lèi)合成酶基因分為7個(gè)基因亞家族，即TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 和TPS-h，其中TPS-a、TPS-b和TPS-g是被子植物特有的亞家族，TPS-d是裸子植物特有的亞家族，TPS-c和TPS-e/f是被子植物與裸子植物所共有的亞家族，而TPS-h亞家族的萜類(lèi)合成酶基因僅在江南卷柏中發(fā)現(xiàn)[16,32](表1)。

表1 植物萜類(lèi)合成酶基因亞家族的成員分布、結(jié)構(gòu)與功能(根據(jù)文獻(xiàn)[16, 61]整理)

萜類(lèi)化合物由2個(gè)或2個(gè)以上的5碳異戊二烯單元首尾拼接而成，根據(jù)5碳異戊二烯單元的數(shù)目可將萜類(lèi)分成單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)以及多萜等[6]。植物細(xì)胞內(nèi)用于生產(chǎn)萜類(lèi)物質(zhì)的5碳異戊二烯前體的異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲丙烯二磷酸(dimethylally pyrophosphate，DMAPP)是通過(guò)位于胞質(zhì)中甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)和質(zhì)體中甲基赤蘚糖磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)這2條獨(dú)立途徑合成，這2條途徑的初始底物不同，但最終產(chǎn)物都是互為同分異構(gòu)體的IPP與DMAPP[17-18](圖1)。一定數(shù)量的IPP和DMAPP在不同異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isoprene synthases，IPSs)的催化下形成不同碳鏈長(zhǎng)度的香葉基二磷酸(geranyl pyrophate，GPP，C10)、法尼基二磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP，C15)以及香葉基香葉基二磷酸 (geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP，C20)等萜類(lèi)物質(zhì)合成前體[19-20]。單萜合成酶(monoterpene synthases，MTPSs)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthases，STPSs)和二萜合成酶(diterpene synthases，DTPSs)等萜類(lèi)合成酶分別以GPP、FPP、GGPP等異戊烯聚合物為底物進(jìn)行環(huán)化、重排和消除等反應(yīng)形成多樣化的萜類(lèi)分子骨架，植物中大多數(shù)二萜與某些單萜、倍半萜類(lèi)分子骨架需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes)的修飾最終成為具有生物功能的成熟萜類(lèi)化合物，例如松科植物中的二萜化合物主要是以二萜酸的形式存在[7,20-21](圖1)。目前，已有數(shù)目眾多的MEP、MVA途徑酶基因和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因在多種松科植物中被克隆和鑒定。王毅等[22-23]從思茅松(P.kesiyavar．langbianensis)克隆了MEP途徑中的第1個(gè)酶1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS)基因和最后1個(gè)酶4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate reductase，HDR)基因。陳曉明等[24]克隆了馬尾松GGPPS基因，并將正、反義基因片段轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsisthaliana)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義PmGGPPS的擬南芥較野生型植株葉片中2種二萜組分含量有顯著提高，而轉(zhuǎn)反義PmGGPPS的擬南芥植株較野生型則有多種二萜組分含量顯著降低，證實(shí)了PmGGPPS在二萜生物合成中的重要調(diào)節(jié)作用。Chen等[25]研究馬尾松GGPPS基因表達(dá)水平與樹(shù)脂產(chǎn)量之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著的線性分布，即馬尾松GGPPS基因表達(dá)水平與產(chǎn)脂力呈正相關(guān)。Qi等[26]克隆了馬尾松FPPS基因并表達(dá)純化其蛋白，發(fā)現(xiàn)PmFPPS酶能在體外將底物DMAPP和IPP催化形成FPP，此外將PmFPPS基因正反義片段轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatabacum)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入正、反義PmFPPS煙草的角鯊烯含量分別顯著增加或降低，證實(shí)了PmFPPS在三萜生物合成中的調(diào)節(jié)作用。

TPS-c亞家族主要包括種子植物中參與初級(jí)代謝赤霉素合成相關(guān)的Class Ⅱ型二萜合成酶基因CPS，小立碗蘚中唯一的雙功能Class Ⅰ/Ⅱ型二萜合成酶基因CPS/KS也屬于該亞家族[16,38]。有一些被子植物的次級(jí)代謝相關(guān)的Class Ⅱ型二萜合酶基因如水稻中OsCPS1和OsCPS2屬于TPS-c亞家族[63]。松科植物中有油松(P.tabuliformis)PtCPS、白云杉PgCPS，北美云杉(P.pungens)PsCPS等二萜合成酶基因?qū)儆赥PS-c亞家族[41,64]。TPS-e/f亞家族主要包括種子植物中參與初級(jí)代謝赤霉素合成相關(guān)的Class Ⅰ型二萜合成酶基因KS，還包括一些次級(jí)代謝相關(guān)的萜類(lèi)合成酶。松科植物中白云杉PgKS和北美云杉PsKS等基因?qū)儆赥PS-e/f亞家族[41,64]。

2014年，在全國(guó)留學(xué)工作會(huì)議上習(xí)近平重點(diǎn)指出：“留學(xué)工作要適應(yīng)國(guó)家發(fā)展大勢(shì)與黨和國(guó)家工作大局……培養(yǎng)造就更多優(yōu)秀人才，努力開(kāi)創(chuàng)留學(xué)工作新局面?！绷?xí)近平這番話也為接下來(lái)的“一帶一路”背景下高校來(lái)華留學(xué)生教育工作指明了方向。目前在“一帶一路”背景下，我國(guó)高校為加強(qiáng)來(lái)華留學(xué)生教育采取很多有效教育措施，具體措施主要如下。

4 松科植物萜類(lèi)合成酶的功能

我國(guó)具有極為豐富的松科植物資源，如馬尾松和油松等特有種，尤其是馬尾松，其分布面積與蓄積量均居我國(guó)針葉樹(shù)種前列，作為我國(guó)松脂主要來(lái)源樹(shù)種，其產(chǎn)脂量占我國(guó)松脂產(chǎn)量的70%以上，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值潛力[93]。同時(shí)我國(guó)大面積松林受到松材線蟲(chóng)病的嚴(yán)重威脅，有研究表明多種萜類(lèi)與松材線蟲(chóng)病抗性相關(guān)[94-96]，因此松科樹(shù)種萜類(lèi)合成酶及其基因的研究，對(duì)我國(guó)松樹(shù)高產(chǎn)脂與松材線蟲(chóng)抗性的遺傳改良和良種選育具有指導(dǎo)意義。目前松科植物萜類(lèi)合成酶及其基因研究已取得一定進(jìn)展，但還有幾方面問(wèn)題有待在研究過(guò)程中解決。

TPS-d亞家族幾乎包含已知所有的裸子植物次生代謝相關(guān)的萜類(lèi)合成酶基因，與TPS-c和TPS-e/f亞家族中初級(jí)代謝中赤霉素合成相關(guān)的萜類(lèi)合成酶基因具有明顯的差異，這表明裸子植物次生代謝相關(guān)的萜類(lèi)合成酶基因可能具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化過(guò)程[16,41]。TPS-d亞家族可進(jìn)一步分為3組：TPS-d1、TPS-d2和TPS-d3，TPS-d1組主要包含裸子植物單萜合成酶和少數(shù)倍半萜合成酶基因，TPS-d2組主要包括大多數(shù)裸子植物倍半萜合成酶基因，TPS-d3組主要包含裸子植物二萜合成酶和少數(shù)倍半萜合成酶基因，其中幾乎所有的針葉樹(shù)次生代謝合成相關(guān)的二萜合酶基因都是雙功能Class Ⅰ/Ⅱ型酶基因[16,41]。TPS-d亞家族3個(gè)組中都含有倍半萜合成酶基因，但TPS-d3組中已發(fā)現(xiàn)的倍半萜合成酶較TPS-d1、TPS-d2組中倍半萜合成酶長(zhǎng)約200個(gè)氨基酸殘基[16]。Martin等[65]和Keeling等[59]對(duì)云杉屬(Picea)、冷杉屬(Abies)與松屬(Pinus)等松科植物次生代謝相關(guān)的萜類(lèi)合成酶基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)其都屬于TPS-d亞家族。火炬松基因組中鑒定的68個(gè)萜類(lèi)合成酶基因也都屬于TPS-d亞家族，TPS-d1、TPS-d2和、TPS-d3組分別含有26、19和23個(gè)萜類(lèi)合成酶基因[58]。

Martin等[65]鑒定了9個(gè)挪威云杉的萜類(lèi)合成酶功能特征，包括4個(gè)單萜合成酶、3個(gè)倍半萜合成酶以及2個(gè)二萜合成酶，其中PaTPS-Myr酶、PaTPS-Far酶、PaTPS-Bis酶和PaTPS-Iso酶具有單產(chǎn)物屬性，其余5個(gè)萜類(lèi)合成酶都至少具有3種產(chǎn)物。Hall等[69]針對(duì)不同程度白松木蠹象(Pissodesstrobi)抗性的北美云杉，鑒定出了4個(gè)蒈烯合成酶和2個(gè)檜烯合成酶功能，其主產(chǎn)物分別是蒈烯和檜烯，并且這6個(gè)單萜合成酶的主要副產(chǎn)物都是異松油烯；研究發(fā)現(xiàn)(+)-3-蒈烯在北美云杉抵抗白松木蠹象侵害過(guò)程中可能起到作用，抗性型北美云杉中(+)-3-蒈烯的含量顯著高于易感型植株，PsTPS-3car1基因在抗性和易感型北美云杉轉(zhuǎn)錄本中均被檢測(cè)到，而PsTPS-3car2和PsTPS-3car3分別只在抗性和易感植株中被檢測(cè)到，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)易感植株的基因組中也不存在PsTPS-3car2基因，這可能是引起不同抗性北美云杉中(+)-3-蒈烯含量差異的部分原因。Keeling等[41,59]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了3種云杉植物中涉及4個(gè)初級(jí)代謝和21個(gè)次級(jí)代謝的萜類(lèi)合成酶基因，并鑒定了重組酶蛋白功能，包括15個(gè)單萜合成酶、4個(gè)半萜合成酶以及6個(gè)二萜合成酶，其中PgTPS-Lin酶、PgTPS-Lin-1酶、PgTPS-Lin-2酶與Pg×eTPS-Far/Oci 酶具有單一的重組蛋白催化產(chǎn)物；在白云杉、北美云杉和雜交云杉(P.glauca×P.engelmannii)轉(zhuǎn)錄組中，分別鑒定出69、55和20個(gè)萜類(lèi)合成酶序列，這與已獲得基因組序列信息的物種中鑒定出的萜類(lèi)合成酶家族大小相當(dāng)，并發(fā)現(xiàn)萜類(lèi)合成酶功能差異可以由微小的氨基酸序列差異引起。Huber等[70]從花旗松(P.menziesii)中鑒定了2個(gè)單萜合成酶((-)蒎烯/(-)莰烯合成酶、異松油烯合成酶)和兩個(gè)倍半萜合成酶((E)-β-法尼烯合成酶、(E)-γ-沒(méi)藥烯合成酶)的功能，發(fā)現(xiàn)2個(gè)單萜合成酶都是至少具有5個(gè)產(chǎn)物的多產(chǎn)物酶，而2個(gè)倍半萜合成酶都是單產(chǎn)物酶。Hall等[71]同樣結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在北美短葉松(P.banksiana)和扭葉松(P.contorta)中分別發(fā)現(xiàn)了45和33個(gè)特有的萜類(lèi)合成酶基因序列，這與云杉屬植物轉(zhuǎn)錄組鑒定到的萜類(lèi)合成酶家族的大小是相似的；北美短葉松和扭葉松中分別表達(dá)了9個(gè)和8個(gè)不同的單萜合成酶重組蛋白，通過(guò)酶活性功能鑒定發(fā)現(xiàn)這17個(gè)單萜合成酶只能使用GPP作為底物催化形成不同的單萜產(chǎn)物，而對(duì)FPP和GGPP沒(méi)有發(fā)現(xiàn)酶催化活性。Phillips等[72]鑒定了火炬松中(+)-α-蒎烯合成酶、(-)-α-蒎烯合成酶以及α-松油醇合成酶功能，發(fā)現(xiàn)K+和Mn2+是獲得最佳酶活性所必須的，以Mg2+代替Mn2+時(shí)反應(yīng)速率降低。此外，對(duì)兩種產(chǎn)物旋光性不同的α-蒎烯合成酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其相似度僅有72%，而與其他裸子植物中具有相同旋光性產(chǎn)物的單萜合成酶的氨基酸序列相似度反而更高。最近，Trindade等[73]從海岸松(P.pinaster)和意大利石松(P.pinea)鑒定了α-蒎烯合成酶功能特征，發(fā)現(xiàn)其主產(chǎn)物為α-蒎烯，副產(chǎn)物為β-蒎烯，并發(fā)現(xiàn)低溫和Mn2+可以明顯促進(jìn)產(chǎn)物的積累。雷蕾等[74-75]從濕地松中克隆了2個(gè)α-蒎烯合成酶和1個(gè)β-蒎烯合成酶基因，發(fā)現(xiàn)其編碼氨基酸序列與其他松科植物同源基因相似度在75%以上，并發(fā)現(xiàn)(-)-α-蒎烯合成酶基因與實(shí)測(cè)年總產(chǎn)脂力、基礎(chǔ)產(chǎn)脂力和潛在產(chǎn)脂力具有顯著相關(guān)，可以作為產(chǎn)脂性狀關(guān)聯(lián)的候選基因。魏永成[76]對(duì)不同松材線蟲(chóng)抗性的馬尾松進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MVA、MEP途徑中HMGR、DXS以及多個(gè)萜類(lèi)合成酶如，(-)-α-蒎烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、(+)-α-蒎烯合成酶、(-)-檸檬烯合成酶、長(zhǎng)葉烯合成酶在高抗和易感型馬尾松接種線蟲(chóng)后表達(dá)量具有極顯著差異，說(shuō)明這些萜類(lèi)合成酶可能在馬尾松系統(tǒng)性防御反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。陳曉明[77