曾紅棱，張婷，鄧銳杰，任堯，賈利蓉

（四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）

單增李斯特菌（L.monocytogenes）是一種重要的食源性致病菌，其廣泛存在于土壤、植物、水，人及動(dòng)物糞便中，主要污染食品基質(zhì)為肉類、熟食、乳制品及海鮮類食品[1]，感染可導(dǎo)致敗血癥，腦膜炎，腸胃炎和流產(chǎn)[2]，其在冷藏溫度和高鹽濃度（10% NaCl）下仍能保持生存和增長(zhǎng)[3]，因此，單增李斯特菌污染對(duì)于食品安全及人類健康皆構(gòu)成了巨大威脅。為了有效防止單增李斯特菌的危害，迫切需要發(fā)展一種高度特異性、快速、準(zhǔn)確的食品中檢測(cè)方法。

單增李斯特菌的檢測(cè)方法依賴培養(yǎng)富集，然后是傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法培養(yǎng)、免疫學(xué)法或以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法[4]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，約為4～6 d[5]，無法滿足大量樣品的檢測(cè)。免疫學(xué)法[6]主要包括ELISA，免疫膠體金技術(shù)和免疫磁分離技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)不依賴培養(yǎng)的單增李斯特菌檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，然而，抗體比較昂貴，較難保存，限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。針對(duì)核酸的檢測(cè)技術(shù)[7]傳統(tǒng)PCR，多重PCR（mPCR）和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）可鑒定和高靈敏檢測(cè)不同微生物。Liu Z等[8]開發(fā)了基于DNAzyme的PCR信號(hào)級(jí)聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)肉眼檢測(cè)食品中的李斯特菌。但PCR引物的設(shè)計(jì)極為關(guān)鍵，否則容易非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，且對(duì)于溫度和儀器要求較高。等溫核酸擴(kuò)增的出現(xiàn)可消除核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)控溫設(shè)備的依賴。Feng J等[9]將核酸適配體與LAMP檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，建立了對(duì)單增李斯特菌的AMC-LAMP可視化檢測(cè)體系，檢出限為5 CFU/mL。此外，一些基于熒光、比色、表面等離子共振、電化學(xué)的傳感器檢測(cè)技術(shù)[10-13]也得到了發(fā)展。GUO Y[14]結(jié)合免疫磁捕獲和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特，無需任何預(yù)富集，且具有良好的選擇性，加標(biāo)回收率在95.37%至101.90 %。

但以DNA為檢測(cè)模板的核酸分析方法無法區(qū)分死菌和活菌，假陽性率較高，且通常認(rèn)為活菌對(duì)于食品安全及人類健康風(fēng)險(xiǎn)更大[15]。由于RNA分子通常具有較短的半衰期，在死菌中迅速降解，因?yàn)檎J(rèn)為RNA檢測(cè)更適用于準(zhǔn)確檢測(cè)活致病菌[16]。CRISPRCas（成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列）是一類特殊的核酸蛋白復(fù)合體，可依賴靶標(biāo)單鏈RNA，切割無關(guān)的ssRNA，適用于RNA檢測(cè)[17]。Zhou J等[18]建立了一種基于CRISPR-Cas13a檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，通過靶標(biāo)RNA激活Cas13a-crRNA復(fù)合物的切割能力，切割熒光探針，導(dǎo)致熒光值增加，該方法具有較高的靈敏性，特異性，可在4 h內(nèi)完成檢測(cè)。但目前基于CRISPR-Cas13a的檢測(cè)方法仍然需要通過逆轉(zhuǎn)錄過程獲得cDNA，再進(jìn)一步核酸擴(kuò)增，此外一般需要在RNA報(bào)告探針的兩端修飾熒光基因和淬滅基團(tuán)，檢測(cè)成本昂貴，操作流程也較為繁瑣，無法滿足同時(shí)具有高效率、高靈敏度、強(qiáng)特異性和低成本的需求。

因此設(shè)計(jì)了一種CRISPR-Cas 13直接切割RNA序列以檢測(cè)活性致病菌的方法，以Broccoli適配體作為信號(hào)探針，后者可特異結(jié)合熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)[19]，無需化學(xué)合成和修飾。該方案無逆轉(zhuǎn)錄、無核酸擴(kuò)增，可定量檢測(cè)活的單增李斯特菌，檢測(cè)耗時(shí)短，具有較高的選擇性和靈敏度，有望實(shí)現(xiàn)食品中單增李斯特菌的實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

單增李斯特菌（L.monocytogenes）（ATCC 19115）、大腸桿菌（E.coli）（ATCC 25922）、鼠傷寒沙門氏菌（S.enterica）（ATCC 14028）和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）（ATCC 14579）由中國(guó)工業(yè)培養(yǎng)收藏中心（CICC）提供；所有DNA寡核苷酸序列（表1）均購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司（并通過PAGE進(jìn)行純化）；Cas 13（cat.no.32117）購(gòu)于Tolobio，中國(guó)上海；phi 29 DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific（Waltham，USA）；DNase I，dNTPs和rNTPs購(gòu)自New England Biolabs（Ipswich,MAUSA）；5-二氟-4-羥基芐基咪唑烷酮（DFHBI-1T）購(gòu)自Lucerna（美國(guó)布魯克林）；細(xì)菌總RNA分離試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；所有溶液采用分子生物級(jí)水（美國(guó)紐約康寧）配制。

表1 核苷酸序列表Table 1 Oligonucleotide sequences

美國(guó)伯騰Biotek Synergy H1多功能酶標(biāo)儀；美國(guó)SCILOGEX（賽洛捷克）D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)；上海一恒THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及核酸提取

所有菌株分別在NB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)得到菌液，梯度稀釋后取適宜的3個(gè)連續(xù)梯度稀釋液進(jìn)行涂布平板計(jì)數(shù)。同時(shí)取1 mL不同濃度培養(yǎng)菌液4 ℃，12000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，0.1 M，pH=7.4）洗滌沉淀，用細(xì)菌總RNA分離試劑盒提取純化總RNA。所有RNA在進(jìn)一步分析前保存在-80 ℃。

1.2.2 Broccoli適配體和crRNA的制備

50 μL反應(yīng)體系中包含5 μL 10×phi 29聚合酶緩沖液，5 μL L-Broccoli（10 μM），5 μL啟動(dòng)子（promoter）（10 μM），90 ℃變性3 min，室溫反應(yīng)30 min；加入0.3 μL phi 29 DNA聚合酶（10 U/μL）和1 μL dNTPs（dATP，dGTP，dCTP和dTTP分別為10 mM），30 ℃孵育30 min，孵育使其延伸形成雙鏈；再加入10 μL 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液，1 μL T7 RNA聚合酶（20 U/μL），2 μL rNTPs（ATP，GTP，CTP和TTP分別為25 mM）和20.7 μL水，37 ℃孵育6 h，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入2 μL DNase I在37 ℃下4 h去除DNA模板，然后在75 ℃滅活15 min，得到Broccoli適配體。分子識(shí)別探針crRNA的制備方法同上。

1.2.3 靶標(biāo)RNA的檢測(cè)

取2.2中制備得到的Broccoli適配體4 μL（50 μM），crRNA 4 μL（1.5 μM），加入0.3 μL Cas 13（10 μM），4 μL 10×Cas 13 buffer，4 μL DFHBI-1T（100 μM）以及4 μL不同濃度的靶標(biāo)RNA，加水至反應(yīng)總體系為40 μL，37 ℃孵育30 min，檢測(cè)熒光。其中激發(fā)波長(zhǎng)為468 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍498～650 nm，檢測(cè)步長(zhǎng)2 nm，記錄不同活菌濃度下的熒光值。

1.2.4 特異性檢測(cè)

每40 μL反應(yīng)體系包括0.3 μL Cas 13a（10 μM）、10×Cas 13 buffer、4 μL Broccoli適配體（50 μM）、4 μL crRNA、4 μL DFHBI-1T（100 μM），分別加入2.2中提取的不同細(xì)菌RNA，混勻，37 ℃孵育30 min，檢測(cè)熒光。

1.2.5 牛奶樣品中單增李斯特活菌的檢測(cè)

將單增李斯特菌接種至液體培養(yǎng)基過夜，將培養(yǎng)液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，采用平板計(jì)數(shù)。然后取1 mL稀釋菌液接種到9 mL牛奶中，將污染的牛奶4 ℃，12000 r/min離心20 min，棄上清[20]，用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，0.1 M，pH=7.4）洗滌沉淀，用細(xì)菌總RNA分離試劑盒提取純化總RNA，檢測(cè)樣品中RNA方法如1.2.3所述。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

檢測(cè)原理如圖1所示，靶標(biāo)RNA僅存在于活菌中，死菌中RNA會(huì)迅速降解，根據(jù)靶標(biāo)RNA的序列設(shè)計(jì)crRNA，其中crRNA包括向?qū)蛄泻湾^定序列。依賴錨定序列，crRNA可識(shí)別并結(jié)合Cas13形成Cas13-crRNA復(fù)合物，令crRNA的向?qū)蛄信c靶標(biāo)RNA反向互補(bǔ)，當(dāng)樣品中存在靶標(biāo)RNA時(shí)，其通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與Cas13-crRNA復(fù)合物結(jié)合，Cas13的非特異性RNase活性被激活，可切割無關(guān)的單鏈RNA（ssRNA）[21]。我們引入Broccoli適配體作為信號(hào)探針監(jiān)測(cè)CRISPR-Cas13的激活狀態(tài)，一旦Broccoli適配體被剪切,其結(jié)構(gòu)遭到破壞，將無法結(jié)合并打開DFHBI-1T染料的熒光，產(chǎn)生熒光淬滅。因此通過Broccoli/DFHBI-1T復(fù)合物的熒光強(qiáng)度可以指示靶標(biāo)RNA的存在，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特活菌的快速檢測(cè)。

圖1 檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic illustration of CRISPR-Cas13 for detection of L.monocytogenes

首先對(duì)Broccoli/DFHBI-1T的熒光指示作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。自由狀態(tài)下DFHBI-1T染料熒光信號(hào)微弱（對(duì)照組1），加入crRNA后熒光值無明顯變化（對(duì)照組2），但加入Broccoli適配體后（對(duì)照組3），熒光強(qiáng)度從214激增至16386，表明Broccoli適配體可特異性結(jié)合并打開DFHBI-1T染料，形成Broccoli/DFHBI-1T復(fù)合物，發(fā)射強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。并且Broccoli適配體可以通過體外轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，擴(kuò)增速率與PCR相當(dāng)，允許等溫?cái)U(kuò)增[23]。當(dāng)加入Cas13和crRNA，熒光信號(hào)無明顯變化（對(duì)照組5）。其次對(duì)CRISPR-Cas13的信號(hào)識(shí)別能力進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)加入一段與crRNA部分互補(bǔ)的單鏈RNA(cRNA)，Cas13的非特異性RNase活性被激活，剪切Broccoli適配體產(chǎn)生熒光淬滅（對(duì)照組4）。當(dāng)加入單增李斯特菌的RNA時(shí)，熒光強(qiáng)度減弱（從15706降至6496），說明靶標(biāo)RNA可以激活Cas 13的剪切活性，進(jìn)而剪切非靶標(biāo)Broccoli適配體。

圖2 原理驗(yàn)證圖Fig.2 Validation of CRISPR-Cas13 assays for L.monocytogenes detection

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了擴(kuò)大該檢測(cè)方法的信噪比，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。首先根據(jù)單增李斯特菌16s rRNA片段，設(shè)計(jì)了不同的L-crRNA序列，并應(yīng)用Primer-BLAST進(jìn)行比對(duì)，篩選得到10條序列，再通過體外轉(zhuǎn)錄得到crRNA，結(jié)果如圖3a所示，T8序列可特異性結(jié)合靶標(biāo)RNA，激活Cas蛋白的剪切活性，信噪比為2.25，優(yōu)化的L-crRNA的核苷酸序列如表1所示。此外，crRNA的缺乏或豐富導(dǎo)致信噪比降低[15]，因此對(duì)crRNA與Cas 13的比例進(jìn)行優(yōu)化，保持Cas13濃度為100 nM，Cas13：crRNA比值范圍為1:1～3:1。結(jié)果表明，當(dāng)Cas 13a和crRNA濃度為2:1時(shí)時(shí)，信噪比最大為3.32(圖3b)。

圖3 CRISPR-Cas13體系實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Fig.3 Optimization of CRISPR-Cas13 based assay

2.3 線性范圍與檢出限

為驗(yàn)證CRISPR-Ca13對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)的靈敏度。以系列單增李斯特菌菌液濃度為橫坐標(biāo)（0，2.3×10、2.3×102、2.3×103、2.3×104、2.3×105、2.3×106、2.3×107CFU/mL），以該濃度下的熒光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4，熒光強(qiáng)度隨著單增李斯特菌濃度的增加而降低，線性檢測(cè)范圍為2.3×102～ 2.3×106，擬合線性方程為y=-2415.2x+21854，R2= 0.9953，LOD（最低檢測(cè)限）=148 CFU/mL。由于檢測(cè)對(duì)象為RNA，提取方法以及RNA易降解的特性[24]，且未進(jìn)行核酸擴(kuò)增，導(dǎo)致該檢測(cè)方法檢測(cè)限略高。相比較利用RNA檢測(cè)單增李斯特菌的其他方法，周振森等[25]以RAN檢測(cè)為模板，利用Opti Gene Genie便攜式儀器和反轉(zhuǎn)錄LAMP擴(kuò)增，檢出限為10 CFU/mL，但該法需要特定儀器，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。徐匆等[26]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以HNB作為指示劑，對(duì)單增李斯特菌的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，建立一種單增李斯特菌的RT-LAMP-HNB檢測(cè)方法，可直接依據(jù)顏色變化判讀結(jié)果。Ma CC等[27]建立一種基于RNA檢測(cè)的RTLAMP方法，可用于檢測(cè)鮮切水果和蔬菜中的活單增李斯特活菌，檢測(cè)限低至1 CFU/mL。但由于實(shí)驗(yàn)過程中的污染及人員操作，LAMP方法的超靈敏性有時(shí)仍會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。此外，LAMP還需要4至6個(gè)引物，相比其他等溫?cái)U(kuò)增方法，引物設(shè)計(jì)更為復(fù)雜[28]，且對(duì)于反應(yīng)溫度有嚴(yán)格要求。因此，基于CRISPRCas13檢測(cè)單增李斯特菌的方法，無需逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單增李斯特菌的快速、定量檢測(cè)。

圖4 單增李斯特菌的定量檢測(cè)Fig.4 The relationship between [L.monocytogenes] and fluorescence response of CRISPR-Cas13 based array

2.4 特異性

為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性，本實(shí)驗(yàn)選取了食品中危害較大的三種食源性致病菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，單增李斯特菌的crRNA序列對(duì)單增李斯特菌具有很強(qiáng)的識(shí)別能力，加入靶標(biāo)RNA可特異性結(jié)合crRNA，激活Cas13的酶切活性造成熒光猝滅，熒光值降低。相反，加入沙門氏菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌時(shí)，熒光值幾乎無差異，未達(dá)到熒光淬滅的效果。表明該檢測(cè)方法對(duì)單增李斯特菌具有較好的特異性。

圖5 特異性分析Fig.5 Specificity test of L.monocytogenes detection

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法在食品檢測(cè)中的可行性，本實(shí)驗(yàn)選取牛奶樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表2，樣品加標(biāo)回收率為95.15%～97.99%，表明該方法能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分的食品基質(zhì)中單增李斯特菌的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)。

表2 牛奶樣品中單增李斯特菌的檢測(cè)Table 2 Determination of L.monocytogenes spiked in the milk (n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合CRISPR-Cas13作為信號(hào)識(shí)別元件，Broccoli適配體為信號(hào)探針，可對(duì)單增李斯特菌特異性識(shí)別，無需任何富集或平板培養(yǎng)過程，可在30 s完成對(duì)于單增李斯特活菌的識(shí)別與檢測(cè)，檢出限為148 CFU/mL。該方法無逆轉(zhuǎn)錄、無核酸擴(kuò)增和核酸標(biāo)記，識(shí)別和擴(kuò)增皆可在恒溫條件進(jìn)行，降低了對(duì)于人員和精準(zhǔn)控溫設(shè)備的要求，適用于單增李斯特菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且直接檢測(cè)致病菌RNA可有效避免死菌對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。由于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的可編程性，該檢測(cè)可針對(duì)不同細(xì)菌設(shè)計(jì)crRNA的向?qū)蛄?，具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的細(xì)菌的快速檢測(cè)，為建立食品中快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)致病菌提供一種通用檢測(cè)方案。