都宏霞，繆領(lǐng)珍，2，胡梓恒，嚴(yán)忠杰

（1.南京科技職業(yè)學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇南京 210048）（2.東南大學(xué)成賢學(xué)院，江蘇南京 210088）

桂花（Osmantus fragrans），又名木犀、巖桂、金粟、九里香等，系木犀科常綠灌木或小喬木，屬珍貴的芳香型鑒賞植物。味辛，可入藥；芳香，可用于食品、化妝品；清雅高潔，香飄四溢，《本草綱目》中早有記載，在我國(guó)廣泛種植，深受人們喜愛(ài)。桂花中含有黃酮、多糖、多酚、精油等多種生物活性成分及抗氧化、降血脂、抗衰老、護(hù)肝、抑菌等多種活性功效[1-11]。研究表明，作為主要活性成分的桂花黃酮（Flavonoids ofOsmanthus fragrans，F(xiàn)OFs）具有抗氧化、抗炎、提高機(jī)體免疫力多種活性功能。目前，針對(duì)FOFs的提取方法主要是回流、酶提、微波、超聲波，但溶劑都采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境十分不友好[3-5]。因此，探索一種綠色、高效的新提取技術(shù)十分必要。

低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents，DESs)由Abbott等人于2003年首次合成的一類(lèi)綠色新型溶劑[12]，一般通過(guò)兩類(lèi)化合物，即氫鍵受體（hydrogen-bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（hydrogen-bond donor，HBD），通過(guò)氫鍵作用而合成，所制成的低共熔溶劑熔點(diǎn)低于其任一組分的熔點(diǎn)，且具有高熱穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)溶劑相比，具有綠色、低成本、低毒、低揮發(fā)、高密度、高極性、高表面張力等優(yōu)良特點(diǎn)，同時(shí)，易于制備、易于存儲(chǔ)、生物可降解、可回收，是傳統(tǒng)溶劑和離子液體的良好替代品，已受到極大關(guān)注，并在天然產(chǎn)物活性成分提取方面證實(shí)了明顯的優(yōu)勢(shì)和巨大潛力[13,14]。

本文設(shè)計(jì)并制備6種低共熔溶劑，首次用于FOFs的提取，并在比較了醇提、凍融、超聲波和微波提取四種技術(shù)，在單因素研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法探索FOFs的最佳提取工藝，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)桂花資源和拓展低共熔溶劑在天然產(chǎn)物綠色提取方面提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花，北京同仁堂藥店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，北京恒元啟天化工技術(shù)研究所；氯化膽堿，Aladdin公司；三氯化鋁、乙醇、醋酸鉀、三乙醇胺、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇、蔗糖、山梨醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E-02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FS-250N型超聲波提取儀，上海生析超聲儀器有限公司；TDL-50B型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；7600型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科學(xué)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[15,16]

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用濃度為50%的乙醇定容至25.0 mL。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只比色管中，分別用5.0 mL的50%乙醇，3.0 mL的0.1 M AlCl3溶液和5.0 mL的1 M醋酸鉀溶液，搖勻，同法制成空白對(duì)照：靜置反應(yīng)40 min，充分接觸混合，通過(guò)紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)415 nm處檢測(cè)其吸光度值，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定FOFs的含量。

1.3.2 提取技術(shù)比較研究

準(zhǔn)確稱取桂花花粉10 g，通過(guò)凍融（Freeze Thawing，F(xiàn)T）、醇提（Ethanol Extraction，ET）[17,18]、超聲波提?。║ltrasonic Extraction，UA）[19-21]、微波提取[22-24]（Microwave Extraction，MA）四種技術(shù)來(lái)提取FOFs，提取條件詳見(jiàn)表1，將提取液以轉(zhuǎn)速4000 r/min的速度離心10 min，取上層清液，過(guò)0.45 μm濾膜，使用預(yù)處理后的D101大孔樹(shù)脂上樣，吸附平衡后，用純水、質(zhì)量濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液依次洗脫，每個(gè)濃度均洗脫3柱體積(BV)，流速為1 BV/h，收集90%乙醇濃度的洗脫液，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮后，再用50%的乙醇溶液進(jìn)行稀釋[25]得到FOFs，根據(jù)1.3.1所述方法測(cè)其吸光度，計(jì)算得出FOFs含量。

表1 提取條件表Table 1 Factors of different technology

表2 不同類(lèi)型的低共熔溶劑Table 2 Different types of DESs

1.3.3 DESs的合成

參考Abbott的方法[26]，設(shè)計(jì)了6組DESs（見(jiàn)表2），選擇氯化膽堿作為氫鍵受體，分別與不同的氫鍵供體按一定摩爾比，在85 ℃水浴條件下加熱攪拌，直至溶液澄清，冷卻至室溫，分別得到DES1-6，備用。

1.3.4 FOFs的提取

精確稱取桂花花粉10 g，通過(guò)超聲波輔助DES1-6，在超聲波150 W、液料比20:1、時(shí)間10 min的條件下分別提取FOFs。

1.3.5 FOFs提取量的測(cè)定

式中：Y為FOFs提取量，mg/g；c為試樣的測(cè)定質(zhì)量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.6 超聲波輔助DES-4提取FOFs的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 液料比對(duì)FOFs提取量的影響

在含水量60 mol，超聲時(shí)間10 min，超聲功率150 W，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇=1:1:1的條件下，分別取液料比20:1、30:1、40:1、50:1、60:1，研究液料比對(duì)FOFs提取量的影響。

1.3.6.2 摩爾比對(duì)FOFs提取量的影響

在液料比50:1，含水量60 mol，超聲時(shí)間10 min，超聲功率150 W的條件下，取氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、2:1:4、3:1:4作為變量，研究摩爾比對(duì)FOFs提取量的影響。

1.3.6.3 含水量對(duì)FOFs提取量的影響

在液料比50:1，超聲時(shí)間10 min，超聲功率150 W，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4的條件下，分別取含水量40、50、60、70、80 mol作為變量，研究含水量對(duì)FOFs提取量的影響。

1.3.6.4 超聲功率對(duì)FOFs提取量的影響

在液料比50:1，超聲時(shí)間10 min，含水量60 mol，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4的條件下，分別取超聲功率30、60、90、120、150 W作為變量，比較超聲功率對(duì)FOFs提取量的影響。

1.3.6.5 超聲時(shí)間對(duì)FOFs提取量的影響

在液料比50:1，含水量60 mol，氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇的摩爾比為2:1:4，超聲功率150 W的條件下，分別取超聲時(shí)間5、10、15、20、25 min作為變量，比較超聲時(shí)間對(duì)FOFs提取量的影響。

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化FOFs最優(yōu)提取工藝條件

使用Design-Expert.V 8.0.6軟件中Box-Behnken組合設(shè)計(jì)來(lái)探索FOFs最優(yōu)工藝[27-30]，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇含水量、液料比和時(shí)間作為3因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)對(duì)FOFs提取量影響較大的水平，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，并以提取量作為響應(yīng)值，各因素的三個(gè)水平分別采取-1、0、1作為編碼，如表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8和Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果分析

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定及分析，得回歸方程Y=32.87X+0.14，其系數(shù)R2=0.9998，在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 FOFs提取技術(shù)比較分析

通過(guò)凍融（FT）、醇提（ET）、超聲波(UA)、微波(MA)四種技術(shù)提取FOFs，如圖2所示，數(shù)據(jù)表明：超聲波提取>微波提取>乙醇提取>凍融提取，最佳技術(shù)為超聲波提取，提取量為1.65 mg/g。因此，采用超聲波輔助進(jìn)行FOFs提取和進(jìn)一步優(yōu)化分析。

圖2 FOFs提取技術(shù)的比較Fig.2 Comparison of different technology for extraction of FOFs

2.3 DESs的篩選

圖3 DESs的篩選Fig.3 Comparison of different DESs

設(shè)計(jì)并制備了6種DESs提取FOFs，數(shù)據(jù)表明：低共熔溶劑的提取FOFs的效果整體優(yōu)于凍融、醇提、超聲波和微波提取技術(shù)，其中DES-4，即以氯化膽堿和山梨醇和1,2-丙二醇所構(gòu)成的三元體系提取效果最好，F(xiàn)OFs提取量為2.33 mg/g，結(jié)果見(jiàn)圖3。為了得到FOFs提取的最佳工藝條件，本研究以超聲波輔助-DES-4（UA-DES-4）進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 液料比對(duì)FOFs提取量的影響

圖4 液料比對(duì)FOFs提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on extraction yield of FOFs

如圖4所示：當(dāng)液料比在20:1到50:1區(qū)間，F(xiàn)OFs提取量呈上升趨勢(shì)，之后趨于平穩(wěn)。其中在50:1時(shí)，提取量最高，為4.72 mg/g。主要原因是增加提取溶劑的體積可以增加溶劑與溶質(zhì)之間的接觸面積，使溶解度升高，促進(jìn)黃酮成分的溢出，當(dāng)溶解度大到一定程度時(shí)，會(huì)發(fā)生飽和的現(xiàn)象，導(dǎo)致部分黃酮無(wú)法溶解，提取量降低。

2.4.2 摩爾比對(duì)FOFs提取量的影響

圖5 摩爾比對(duì)FOFs提取量的影響Fig.5 Effect of molar ration on extraction yield of FOFs

結(jié)果如圖5所示：FOFs提取量隨著DES-4體系中氯化膽堿和1,2-丙二醇摩爾比的增加而增加，當(dāng)摩爾比為2:1:4時(shí)，提取量最高，為6.19 mg/g。主要原因是1,2-丙二醇摩爾比的增加有效的調(diào)節(jié)了DES-4體系的粘度及表面張力，促進(jìn)了黃酮物質(zhì)的擴(kuò)散，提高了提取量，而氯化膽堿的比例低會(huì)弱化黃酮物質(zhì)與溶劑的相互作用。當(dāng)摩爾比為2:1:4時(shí)，剛好達(dá)到最佳效果[31]。

2.4.3 含水量對(duì)FOFs提取量的影響

圖6 含水量對(duì)FOFs提取量的影響Fig.6 Effect of water content on extraction yield of FOFs

DESs的含水量是影響提取效果的重要因素，本研究考察了含水量40~80 mol對(duì)FOFs提取量的影響，結(jié)果如圖6所示：含水量從40到60 mol時(shí)，F(xiàn)OFs的提取量逐漸上升，含水量為60 mol時(shí)，提取量最高，為6.29 mg/g，含水量從60~80 mol時(shí)，提取量降低。主要原因隨著水含量的增加，可以明顯降低DES的粘度，同時(shí)調(diào)節(jié)體系極性，有益于黃酮成分的溢出，增加提取量，但當(dāng)含水量超過(guò)60 mol后，隨著極性的增加，會(huì)引起分子間氫鍵的斷裂，影響提取效果[32]。

2.4.4 超聲功率對(duì)FOFs提取量的影響

圖7 超聲功率對(duì)FOFs提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on extraction yield of FOFs

結(jié)果如圖7所示：FOFs的提取量隨著超聲波功率的提高而逐漸上升，當(dāng)功率為150 W時(shí)，提取量最高，為6.29 mg/g[20]。因?yàn)槌暡〞?huì)促進(jìn)黃酮物質(zhì)在溶劑中的分散與滲透，增大接觸面積，促使黃酮物質(zhì)的釋放。因此最佳超聲功率為150 W。

2.4.5 超聲時(shí)間對(duì)FOFs提取量的影響

結(jié)果如圖8所示：在5~15 min時(shí)FOFs提取量呈上升趨勢(shì)，之后有所下降，最佳超聲時(shí)間是15 min，此時(shí)提取量為6.30 mg/g。這是因?yàn)闀r(shí)間越長(zhǎng)，超聲波產(chǎn)生的能量就越大，在溶液中所形成的空化效應(yīng)就越強(qiáng)，對(duì)桂花細(xì)胞壁的破壞程度就越強(qiáng)，提取量就越高。但是，隨著超聲波作用時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度也會(huì)增加，體系同時(shí)處于超聲輻射和熱效應(yīng)的作用之下，可能會(huì)產(chǎn)生雙重降解[33]，并且長(zhǎng)時(shí)間的提取黃酮物質(zhì)內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，DES與樣品的相互作用變得不穩(wěn)定，影響提取效果[34]。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)FOFs提取量的影響Fig.8 Effect of extraction time on extraction yield of FOFs

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.5.1 響應(yīng)模型的建立與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取含水量(A)、液料比(B)和超聲時(shí)間(C)三個(gè)主要因素為自變量，以FOFs提取量為響應(yīng)值(Y)，采用Design-expert軟件按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了15組實(shí)驗(yàn)，12組為析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，3組為重復(fù)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行交叉設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，方差與誤差統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表5。

利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

R=8.67+0.059A+1.74B+0.16C+0.80AB+0.020AC+0.22BC-1.97A2-0.98B2-1.38C2

其中R為提取量，A、B和C分別為對(duì)應(yīng)含水量、液料比和超聲時(shí)間的編碼。

由表5的數(shù)據(jù)可知：模型的p值為0.0037，模型極顯著（p<0.01）；失擬項(xiàng)p值為0.0712，結(jié)果不顯著（p>0.05），表明擬合狀況良好。方程決定系數(shù)R2=0.9659，CV為9.27%<10%，能真實(shí)的反映本模型，可用此模型分析響應(yīng)面的變化。信噪比（Adeq Precision）為11.286大于4，表示模型合理。

由方差F值可知，各因素對(duì)提取量影響為：B（料液比）>C（超聲時(shí)間）>A（含水量）。由表5還得知，因素中B、A2、C2的影響極顯著（p<0.01），因素AB、B2的影響顯著（p<0.05），而A、C、AC、BC的影響不顯著，表明該方程可適用。

表4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of the response surface methodology (RSM) and Box-Behnken

表5 提取量響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA results of extraction rate response surface fitting regression equation

2.5.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

各因素間交互作用得到響應(yīng)面曲線圖。圖9~圖11分別顯示含水量、料液比、超聲時(shí)間的交互作用對(duì)FOFs提取量的影響結(jié)果。曲線走勢(shì)越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，則表明該因素影響較小[32-34]。圖9中，隨著含水量的增加，F(xiàn)OFs提取量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，影響顯著，含水量在62 mol時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。圖10中，提取量隨著液料比的增加，影響十分顯著，在液料比為60:1（mL/g）左右時(shí)出現(xiàn)最大值，之后逐漸降低；圖11中，隨著超聲時(shí)間的增加，F(xiàn)OFs提取量逐漸上升，在16 min左右時(shí)達(dá)到最大，之后緩慢降低。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert軟件得出在含水量、超聲時(shí)間和料液比交互作用影響下，最優(yōu)提取工藝為：液料比為59.90:1，含水量為62.17 mol，超聲時(shí)間為15.69 min，在此條件下模型預(yù)測(cè)的提取率為9.55 mg/g。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體情況，修正實(shí)際提取條件為液料比60:1 (mL/g)，超聲波功率150 W，含水量62 mol，摩爾比2:1:4，超聲時(shí)間16 min，所得FOFs提取量為10.06 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差0.51 mg/g，說(shuō)明模型與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好，證實(shí)根據(jù)此模型優(yōu)化的工藝條件可靠。

圖9 含水量與超聲時(shí)間交互作用對(duì)提取量的影響Fig.9 Response Surface of Y=f(A,C)

圖10 含水量與液料比交互作用對(duì)提取量的影響Fig.10 Response Surface of Y=f(A,B)

圖11 超聲時(shí)間與液料比交互作用對(duì)提取量的影響Fig.11 Response Surface of Y=f(B,C)

3 結(jié)論

本文結(jié)合超聲波輔助低共熔溶劑提取，建立了一種高效、環(huán)保的FOFs提取工藝。通過(guò)設(shè)計(jì)并制備6種低共熔溶劑用于提取FOFs，并使用傳統(tǒng)的醇提、凍融、超聲波及微波技術(shù)進(jìn)行提取，證實(shí)低共熔溶劑的提取效果整體優(yōu)于其他技術(shù)。其中，三元DES體系氯化膽堿/山梨醇/1,2-丙二醇的效果最好。因此，選用此體系，在單因素的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件，得到FOFs提取最佳工藝是：氯化膽堿:山梨醇:1,2-丙二醇=2:1:4，含水量62 mol，液料比60:1 (mL/g)，超聲波功率150 W，超聲時(shí)間16 min，在此條件下，F(xiàn)OFs的提取量達(dá)到10.06 mg/g；FOFs提取量比傳統(tǒng)的醇提提高了8.93 mg/g，相當(dāng)于其890%，同時(shí)，提取效果也優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道[4]中采用微波-超聲聯(lián)合輔助提取最優(yōu)工藝得到的7.86 mg/g，說(shuō)明超聲波輔助低共熔溶劑提取FOFs的高效性。本工藝綠色、高效、環(huán)保，為天然植物活性成分綠色提取和桂花的深度開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。