李萍，羅強(qiáng)，金鑫，李強(qiáng)，蔣云，黎青，李健偉，熊川

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都 610061）（2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肝炎研究所，重慶 400010）（3.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.），又稱南美藜、藜谷、奎奴亞藜等，為一年生藜科草本作物。藜麥原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈高海拔（2800～4200 m）地區(qū)，在當(dāng)?shù)赜谐^5000年的種植歷史，因其豐富的營養(yǎng)和多樣的保健功能而被稱為 “ 谷物之母 ”[1]?，F(xiàn)代研究確認(rèn)，藜麥中蛋白質(zhì)含量高，富含淀粉、礦質(zhì)元素及維生素，且氨基酸組成均衡，能夠滿足人體所必需的營養(yǎng)元素[2]，長期食用藜麥，不僅對高血糖、高血脂、心臟病等疾病具有良好的輔助治療作用，而且可以增強(qiáng)體力、提高免疫力、完善營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[3]。

藜麥的功能成分包括多酚，皂苷，黃酮及多糖等[4]，藜麥總多酚中含有酚酸、香草酸、阿魏酸及其衍生物、槲皮素、山奈酚及其苷類等，藜麥總多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]。藜麥中含有種類豐富的皂甙，近年來研究確認(rèn)，皂苷對人體健康有益，許多傳統(tǒng)中藥材的有效成分都是皂苷，皂苷具有降低膽固醇、抑菌、抗腫瘤等多種活性[6]。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活品質(zhì)的提升，亞洲女性對美白的需求日益增加。目前研發(fā)的具有美白效果的護(hù)膚品多通過添加具有美白功效的化學(xué)合成物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。如氫醌，熊果苷，曲酸和BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）等[7]，但是在使用過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨快速的美白效果而來的是一系列的副作用，如細(xì)胞毒性等[8]。因此，化妝品的安全性日益受到重視，來源于植物中的天然美白物質(zhì)因其較低的副作用而愈受關(guān)注。黑色素形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中酪氨酸酶作為黑色素合成中的關(guān)鍵酶異常重要[9]。已有研究確認(rèn)，藜麥麩皮皂苷能夠抑制酪氨酸酶活性，是一種有待開發(fā)的天然美白物質(zhì)[10]，但對其作用機(jī)制缺乏研究。

基于以上分析，本研究收集藜麥，通過超聲輔助提取結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)探索藜麥皂苷的最佳提取方法，在此基礎(chǔ)上，培養(yǎng)B16細(xì)胞，驗(yàn)證藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素合成的影響，進(jìn)一步測定細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，并探究藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素合成的影響機(jī)制。獲得的數(shù)據(jù)能夠?yàn)檗见溤碥兆鳛橐环N美白成分在化妝品上的應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藜麥采集自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院阿壩州理縣栽培試驗(yàn)基地，品種為 “ 隴藜1號 ” 。中藥材粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，置于通風(fēng)陰涼處保存?zhèn)溆茫籅16小鼠黑色素瘤細(xì)胞，購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

磷酸鹽緩沖液（PBS）購買自上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（包括DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清），購自美國Gibco公司；聚乙二醇辛基苯基醚溶液（Triton X-100）、左旋多巴溶液（Levodopa，L-DOPA）、α-黑色素細(xì)胞刺激素（α-MSH）購自Sigma公司；小眼畸型相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）一抗、酪氨酸酶一抗、內(nèi)參GAPDH一抗及對應(yīng)的二抗，購于Abcam公司。

石油醚、甲醇、高氯酸等試劑購于成都市科龍化工試劑廠；其余試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-15AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；Spectra max plus 384酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；LSC plus真空冷凍干燥機(jī)美國，德國Christ公司；IX73倒置顯微鏡，日本Olympus公司；N1200-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司；VOSHIN-1000W超聲波清洗器，無錫沃信儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥皂苷的提取

標(biāo)準(zhǔn)品選用齊墩果酸，稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶解于無水甲醇中，定容至25 mL容量瓶中，最終獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶度為0.2 mg/mL。依次準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于具塞試管中，水浴揮干液體并靜置冷卻。加入顯色劑5%的香草醛-冰乙酸0.2 mL和0.8 mL的高氯酸，并通過漩渦震蕩混勻。70 ℃水浴15 min，靜置冷卻后加入5 mL冰醋酸，反應(yīng)20 min，測定波長545 nm處的吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傇碥蘸坑?jì)算公式如下：

式中：C：總皂苷濃度（mg/mL），基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出；V：提取液的總體積（mL）；m：樣品質(zhì)量（g）。

稱取粉碎后過60目篩的藜麥1 g，加入40倍體積的石油醚過夜脫脂。抽濾并烘干收集藜麥。選取對藜麥種子皂苷提取量影響較為顯著的料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間3個(gè)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。測定藜麥皂苷的得率。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2 B16細(xì)胞活性測定

取對數(shù)期生長的B16細(xì)胞，按照3×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)液。37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。棄去上清液，每孔添加含有不同濃度藜麥皂苷（12.5、25、50、100、200、400和800 μg/mL）的完全平培養(yǎng)液100 μL，對照組設(shè)定為不含藜麥皂苷樣品的同體積培養(yǎng)液，空白孔不接種細(xì)胞只加100 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)定3個(gè)重復(fù)。采用CCK8法測定細(xì)胞活性。上述細(xì)胞于37 ℃，5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后，測定450 nm處的吸光值，用空白孔調(diào)零，測定并計(jì)算細(xì)胞活力[11]。細(xì)胞活力的計(jì)算公式如下：

1.3.3 藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素含量的影響

采用NaOH溶解法測定B16細(xì)胞的黑色素含量[12]。取對數(shù)期生長的B16細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于6孔板（3×104個(gè)/孔）。37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的藜麥皂苷，處理同1.3.2，每孔加入1 mL。上述細(xì)胞于37 ℃，5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，后用PBS緩沖液沖洗3次。之后加入2 mL濃度為0.2 mol/L的NaOH溶液，80 ℃水浴1 h，徹底溶解細(xì)胞團(tuán)塊。測定492 nm處的吸光值，黑色素相對含量計(jì)算公式如下：

1.3.4 藜麥皂苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同1.3.2。藜麥皂苷處理后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，吸棄培養(yǎng)液，后用PBS緩沖液沖洗3次。加入50 μL細(xì)胞裂解液1% Triton X-100，低溫冷凍1 h，取出后室溫融化。37 ℃孵育并加入10 μL濃度為1%的L-DOPA溶液，反應(yīng)1 h[13]。測定492 nm處的吸光值，酪氨酸酶相對活力計(jì)算公式如下：

1.3.5 黑色素形成作用通路探索

采用免疫印跡法（Western blot）測定B16細(xì)胞黑色素形成過程中關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況[14]。B16細(xì)胞接種于6孔板，用含有濃度為10 nmol/L的α-MSH和藜麥皂苷共處理48 h。空白組只添加培養(yǎng)液，模型組為包含10 nmol/Lα-MSH的培養(yǎng)液。處理48 h后，操作依次包括RIPA裂解B16細(xì)胞，采用Lowry法定量蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），之后轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行免疫反應(yīng)，一抗的稀釋濃度參考說明書，選擇GADPH做二抗，最后通過ECL顯色并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件分析，采用mean±SD表示，差異的顯著性用t-test檢驗(yàn)，以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥皂苷最適提取條件

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of oleanolic acid

以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=19.449x-0.0042，R2=0.9944。

通過不同料液比，結(jié)合不同乙醇濃度和超聲提取時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，獲得藜麥皂苷的得率如表2。實(shí)驗(yàn)條件下藜麥皂苷的得率在0.73%～1.72%之間，影響得率的主要因素為提取時(shí)的乙醇濃度(B)，最佳提取條件為A3B2C2，即料液比設(shè)定為1:40，70%濃度的乙醇下超聲60 min，在此條件下，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終獲得的得率為1.78%，即17.85 mg/g。

皂苷的提取方法有多種，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取法，其操作簡單，易于控制；相較于傳統(tǒng)的溶劑提取法，超聲處理能夠加快皂苷成分的浸出，提高工作效率[15]。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34) orthogonal experiment

2.2 藜麥皂苷對B16細(xì)胞活性的影響

藜麥皂苷作用B16細(xì)胞后，細(xì)胞活性如表3所示。作用濃度和處理時(shí)間會(huì)影響藜麥皂苷對B16細(xì)胞增殖的抑制作用。低濃度的藜麥皂苷對B16細(xì)胞的活性無顯著抑制作用，藜麥皂苷濃度介于12.5～200 μg/mL時(shí)，最長72 h的處理時(shí)間內(nèi)，B16細(xì)胞活力未見明顯下降。隨著濃度的增加，藜麥皂苷對B16細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制作用。400 μg/mL的藜麥皂苷會(huì)顯著抑制B16細(xì)胞的活性，該濃度下處理24 h，B16細(xì)胞的活力降低至92.32%，而800 μg/mL的藜麥皂苷會(huì)呈現(xiàn)極顯著的差異，72 h后細(xì)胞活力僅為87.51%。濃度為100 μg/mL的熊果苷（陽性對照）同樣極顯著的抑制B16細(xì)胞的活性，處理24 h后，細(xì)胞活力降至84.49%。上述結(jié)果表明，低濃度的藜麥皂苷（≤200 μg/mL）對B16細(xì)胞的細(xì)胞活性無顯著影響。

表3 藜麥皂苷對B16細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Table 3 Effects of Quinoa saponins on cell viability of B16 cells

2.3 藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素含量的影響

藜麥皂苷作用B16細(xì)胞后對其黑色素含量的影響如表4所示?；谵见溤碥諏16細(xì)胞活力的測定，選定藜麥皂苷濃度為12.5、25、50、100和200 μg/mL進(jìn)行黑色素含量的測定，在此設(shè)定濃度下，B16細(xì)胞的活性不會(huì)受到明顯抑制。實(shí)驗(yàn)設(shè)定的最低濃度的藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素合成沒有明顯的抑制作用。25 μg/mL的藜麥皂苷只在培養(yǎng)72 h時(shí)表現(xiàn)出抑制作用。隨著藜麥皂苷濃度的增加，抑制作用逐漸加強(qiáng)，200 μg/mL的藜麥皂苷處理B16細(xì)胞72 h，使得細(xì)胞內(nèi)黑色素含量為73.85%，即藜麥皂苷對黑色素生成量的抑制率達(dá)26.15%。因此，藜麥皂苷是一種潛在的黑色素合成抑制劑。

表4 藜麥皂苷對B16細(xì)胞黑色素合成的影響Table 4 Effect of Quinoa saponins on melanin synthesis in B16 melanoma cells

表5 藜麥皂苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活力的影響Table 5 Effect of Quinoa saponins on cellular tyrosinase activity in B16 melanoma cells

2.4 藜麥皂苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

如表5所示，與對照組相比，藜麥皂苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性具有顯著的抑制作用。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，12.5 μg/mL的藜麥皂苷處理24 h，酪氨酸酶活力降低至93.31%，與對照組呈現(xiàn)顯著差異（p＜0.05）。隨著藜麥皂苷濃度的增大及處理時(shí)間的增長，B16細(xì)胞酪氨酸酶活性逐步降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，藜麥皂苷對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制率為6.69%～46.69%。

人體皮膚中的黑色素是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，可以通過細(xì)胞的樹突結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細(xì)胞中，并且能夠重新排列分布，因此，伴隨角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，黑色素可以向上遷移，最終遷移至皮膚角質(zhì)層，在皮膚表面形成了色素沉積[16]。目前，已有學(xué)者探索了黑色素的合成過程，首先，黑色素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酶（TYR）的催化作用下與多巴反應(yīng)，氧化生成多巴醌，多巴醌異構(gòu)化形成多巴色素，多巴色素進(jìn)一步通過2條通路反應(yīng)。其一，多巴色素脫羧并在TYR的作用下生成5,6-吲哚醌；其二，多巴色素在TRP-2的作用下，形成5,6-二羥基吲哚羧酸，進(jìn)一步在TRP-1的催化下生成5,6-吲哚醌羧酸，5,6-吲哚醌和5,6-吲哚醌羧酸最終形成真色素。因此，酪氨酸酶在整個(gè)反應(yīng)中作用重大，抑制酪氨酸酶的活性就能夠有效抑制黑色素的形成[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，12.5 μg/mL的藜麥皂苷對酪氨酸酶活性的抑制率為6.69%，200 μg/mL的藜麥皂苷處理72 h后，抑制率達(dá)到46.69%，具有較好的抑制作用。

2.5 藜麥皂苷對小眼畸型相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）及酪氨酸酶（TYR）蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，α-黑色素細(xì)胞刺激素（α-MSH）作用后，細(xì)胞內(nèi)（模型組）MITF和TYR的蛋白表達(dá)明顯增加，分別為空白組的123%和112%。25 μg/mL藜麥皂苷處理后，MITF的相對表達(dá)量為模型組的59%，TYR則為74%。隨著藜麥皂苷濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)MITF和TYR的表達(dá)量明顯降低，當(dāng)藜麥皂苷濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，MITF和TYR的蛋白表達(dá)降至44%和49%，與模型組呈現(xiàn)極顯著差異。

圖2 藜麥皂苷對B16細(xì)胞TYR及MITF蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of quinoa saponins on the expression of TYR and MITF proteins in B16 cells

表6 藜麥皂苷對B16細(xì)胞TYR及MITF蛋白表達(dá)的影響（mean±SD）Table 6 Effects of quinoa saponins on the expression of TYR and MITF proteins in B16 cells (mean±SD)

相關(guān)研究表明，植物源的天然產(chǎn)物，如酚類、多糖類、黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜皂苷類等都具有酪氨酸酶（TYR）抑制活性，是天然美白劑的理想原材料[18]。Lee等的研究結(jié)果表明，人參皂苷能夠顯著抑制B16細(xì)胞的黑色素生成，起作用通路涉及抑制MITF和TYR的表達(dá)，作用通路與本研究一致[19]。Kim等學(xué)者獲得了裂葉月見草甲醇提取物，測定發(fā)現(xiàn)提取物濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞黑色素含量下降了近35.50%，酪氨酸酶活力下降22.60%[20]，其劑量的作用效果與本實(shí)驗(yàn)藜麥皂苷相當(dāng)。文冠果殼皂苷[21]，蒺藜皂苷[13]，海參水煮液皂苷[22]等都發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶抑制活性，從天然動(dòng)植物中提取皂苷用作美白成分，既符合當(dāng)前以天然藥物為美容成分的發(fā)展趨勢，同時(shí)又能有效提高農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）是一種含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，作為一種色素沉積的主要調(diào)節(jié)因子而存在[23]。MITF可以調(diào)控TYR、TYRP-1和TYRP-2等與細(xì)胞黑色素的形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)中用到的α-黑色素細(xì)胞刺激素（α-MSH）是一種由13個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其生理功能主要是促黑色素細(xì)胞分裂。通常情況，黑色素細(xì)胞在α-MSH作用下與受體黑素皮質(zhì)激素受體1（melanocortin 1 receptor，MC1R）結(jié)合，啟動(dòng)下游腺苷酸環(huán)化酶途徑和蛋白脂酶C途徑，介導(dǎo)黑色素合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。因此，黑色素生成過程中，除了TYR的活性，一般也會(huì)監(jiān)控MITF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，高濃度的藜麥皂苷（200 μg/mL）能顯著抑制MITF的表達(dá)，阻斷黑色素的合成。

近年來，亞洲女性對于美白的需求持續(xù)增長，此外，對于功效專注于美白的化妝品及藥品的安全性要求也不斷增高。相較于曲酸、氫醌等具有細(xì)胞毒性需嚴(yán)格控制用量的快速美白的物質(zhì)，多糖類、三萜皂苷類等溫和、綠色的天然美白劑也廣受歡迎。目前，許多國內(nèi)外研究都表明化妝品中的大部分美白成分都具有酪氨酸酶抑制活性或/和黑色素合成抑制活性，通過抑制酪氨酸酶活性，阻斷或減緩真黑色的形成，從而實(shí)現(xiàn)美白功能。因此，尋找安全的酪氨酸酶抑制劑，將成為今后美白化妝品研發(fā)過程中的一種新潮流。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離提取藜麥皂苷并驗(yàn)證其酪氨酸酶抑制活性。采用超聲波輔助提取法，獲得最佳提取條件為料液比1:40（g/mL），70%濃度的乙醇下超聲60 min，在此條件下，獲得得率為17.85 mg/g。低濃度的藜麥皂苷對于B16細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用，但卻能顯著抑制酪氨酸酶活性，最強(qiáng)抑制率為46.69%，并減少細(xì)胞黑色素的形成，最強(qiáng)抑制率為26.15%，藜麥皂苷抑制黑色素形成的作用通路涉及TYR-MITF，能顯著抑制TYR和MITF的表達(dá)。因此，藜麥皂苷能夠作為一種美白成分應(yīng)用于化妝品中。