李瑜，王周利，蔡瑞，楊逍迪，岳田利，袁亞宏，崔璐

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

黑果腺肋花楸又名不老莓、野櫻莓，是薔薇科，腺肋花楸屬多年生落葉灌木，原產(chǎn)地在美國東北部，在20世紀90年代初，為改善土壤、環(huán)境條件，引入我國遼寧省西北部[1,2]。其果實為紫黑色圓形漿果，可加工成果汁、果酒、果醬、罐頭、果脯等食品和飲料，是一種具有極高營養(yǎng)價值與經(jīng)濟價值的新型小漿果[3]。研究結(jié)果表明，黑果腺肋花楸果實中富含花青素、原花青素和酚酸等多酚類物質(zhì)[4]，且多酚含量是已知植物中最高[5]。這些多酚類物質(zhì)具有極強的抗氧化活性[6]、抗衰老[7]、抗癌[8]、預防心腦血管疾病[9]、免疫調(diào)節(jié)和抗炎[10]等功能，可以保持人體正常生理機能。目前，黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)的提取大多采用溶劑提取法，如Wangensteen等[11]使用80%乙醇作為溶劑提取提取黑果腺肋花楸漿果酚類物質(zhì)；鄭悅等[12]分別用水、50%～100%乙醇溶液和50%～100%甲醇溶液作為提取溶劑提取黑果腺肋花楸中花色苷。但有機溶劑具有一定的危害性，因此嘗試使用無污染的有機食品添加劑β-環(huán)糊精提取多酚具有一定的研究價值。

近年來，利用β-環(huán)糊精作為提取劑，提取植物重要活性成分的研究逐漸增多[13]。β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀低聚糖，具有外親水、內(nèi)疏水的獨特結(jié)構(gòu)[14]。在水溶液中，由于其特殊的環(huán)狀中空圓筒型結(jié)構(gòu)，可以選擇性的包合大小和形狀合適的分子形成β-環(huán)糊精包合物，如揮發(fā)油和多酚類化合物等[15]。朱德艷[16]采用β-環(huán)糊精為輔助材料對紫茄皮中的花青素進行提取。馮歡歡等[17]以β-環(huán)糊精為提取介質(zhì)，蒸餾水為提取溶劑，從茶末中提取多酚類物質(zhì)。與有機溶劑提取相比，采用β-環(huán)糊精提取多酚物質(zhì)，更安全、經(jīng)濟和環(huán)保[18]。

本試驗首先通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到β-環(huán)糊精提取黑果腺肋花楸中多酚的最佳條件，然后在最佳提取條件下對β-環(huán)糊精提取的黑果腺肋花楸多酚類物質(zhì)進行HPLC分析。本研究旨在探討β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)的可行性，以期為黑果腺肋花楸的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸凍果（產(chǎn)自遼寧?。?，除去葉片、枝干等雜質(zhì)后常溫解凍，榨汁機充分打碎果實至漿（成汁狀），置于棕色瓶于4 ℃冰箱中密封儲存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇：分析純，四川西隴化工有限公司；β-環(huán)糊精：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；福林酚：分析純，北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鈉：分析純，四川西隴化工有限公司；乙腈，色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；乙酸、甲醇，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2096飛利浦攪拌機：飛利浦電子香港有限公司；SBL-30DTY超聲波恒溫清洗機：寧波新芝生物科技有限公司；JA2003電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計、LC-20ADpump高效液相色譜儀：島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚物質(zhì)的提取

準確稱取3.0 g黑果腺肋花楸勻漿置于50 mL具塞三角瓶中，分別加入水、50%甲醇溶液和33 g/Lβ-環(huán)糊精溶液各20 mL，在功率400 W、33 kHz、溫度40 ℃條件下，超聲提取60 min后，于5000×g、4 ℃條件下離心10 min。分別取上清液1.0 mL旋轉(zhuǎn)蒸干，用20 mL甲醇溶解多酚并沉淀β-環(huán)糊精，過濾，將上清液置于50 mL錐形瓶中封口避光待用。

1.3.2 總酚含量的測定

采用福林-酚法測定總酚含量[19]。配制沒食子酸的質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、100 μg/mL，量取0.5 mL沒食子酸溶劑于10 mL離心管中，依次加入2.0 mL、7.5% Na2CO3溶液和2.0 mL蒸餾水和0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑，搖勻，于40 ℃水浴中避光反應(yīng)90 min后，在波長765 nm處測定吸光度，平行設(shè)計3組試驗。以沒食子酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

其中按照標準曲線制作方法，測定樣品吸光度，多酚含量的計算公式如下：

式中：Y1為樣品中多酚的濃度(mg/g)；X1為樣品中多酚的濃度(mg/mL)；V1為樣液體積(mL)；N1為稀釋倍數(shù)；M1為樣品的質(zhì)量(g)。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取3.0 g黑果腺肋花楸勻漿置于50 mL具塞三角瓶中，分別考察β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度（5、10、15、20、25、30、35 g/L）、溫度（30、40、50、60、70 ℃）及提取時間（20、40、60、80、100 min）對多酚提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

表1 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 1 Response surface test factor level and coding

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken試驗方法[20]，以β-環(huán)糊精濃度、提取溫度和提取時間為自變量，以多酚的提取量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平試驗方案，試驗因素水平及編碼見表1。

1.3.5 HPLC分析

色譜條件：島津HPLC系統(tǒng)（LC20AD高壓泵、SPD-M20A型二極管、CTO-10AS柱溫箱）；色譜柱：Agilent5 TC-C18 250×4.6 mm；柱溫30 ℃；流動相A為乙腈(含0.5%乙酸):超純水=1:1，流動相B為2%乙酸超純水溶液；280 nm、320 nm雙通道檢測；洗脫程序：洗脫程序：0 min～3 min，A為10%，3 min～15 min，A為15%，15 min～25 min，A為45%，25 min～35 min，A為55%，35 min～45 min，A為80%，45 min～50 min，A為80%，50 min～51 min，回到初始狀態(tài)。

精確稱取9種多酚標準品（香草酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、根皮苷、肉桂酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素）各1.0 mg，配置成5 mL 0.02 mg/mL單標和混標，經(jīng)液相分析得到單標和混標圖，通過保留時間對混合標準色譜圖中的各個峰進行定性，并通過峰面積進行定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理。Box-Behnken設(shè)計采用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 8.0.6對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合方差分析、顯著性檢測和響應(yīng)面分析，獲取回歸模型及最佳提取工藝參數(shù)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的制備

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

由線性模擬試驗結(jié)果得標準曲線如圖1所示，沒食子酸標準的線性回歸方程為y=0.0067x+0.023，由回歸系數(shù)（R2=0.9998）可知，當沒食子酸濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)時，沒食子酸濃度和吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1β-環(huán)糊精濃度對黑果腺肋花楸提取多酚的影響

如圖2所示，在超聲400 W、33 kHz、40 ℃、60 min的提取條件下，當β-環(huán)糊精濃度從5 g/L升高至25 g/L時，多酚的提取量顯著增加，從6.46 mg/g提高到8.19 mg/g，這是因為β-環(huán)糊精的濃度提高，提取過程中形成的β-環(huán)糊精-多酚包合物越多，最終得到的多酚提取量也越多；再繼續(xù)增大β-環(huán)糊精的濃度至35 g/L，提取的多酚量沒有顯著性增加，為8.37 mg/g（30 g/L）、8.34 mg/g（35 g/L）。因此，選擇β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度25 g/L、30 g/L、35 g/L進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖2 β-環(huán)糊精濃度對黑果腺肋花楸提取多酚的影響Fig.2 The effect of β-cyclodextrin concentration on the extraction of polyphenols from Aronia melanocarpa

2.2.2 提取溫度對β-環(huán)糊精提取黑果腺肋花楸中多酚的影響

圖3 提取溫度對β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on β-cyclodextrin-assisted extraction of polyphenols from Aronia melanocarpa

如圖3所示，在β-環(huán)糊精濃度為15 g/L，超聲400 W、33 Hz、提取時間60 min的提取條件下，提取溫度從30 ℃升高到50 ℃時，多酚的提取量顯著增加，從6.14 mg/g提高到7.96 mg/g，分析原因可能是因為溫度升高有利于多酚的溶出；繼續(xù)升高提取的溫度至70 ℃，多酚的提取量沒有顯著性增加，為8.21 mg/g（60 ℃）、8.46 mg/g（70 ℃）。判斷可能是因為溫度升高一方面導致β-環(huán)糊精-多酚包合物脫包合，另一方面部分多酚被氧化，多酚濃度不再上升[22]。因此，選擇提取溫度50 ℃、60 ℃、70 ℃進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2.3 提取時間對β-環(huán)糊精提取黑果腺肋花楸中多酚的影響

如圖4所示，在β-環(huán)糊精濃度為15 g/L，超聲400 W、33 Hz、40 ℃的提取條件下，提取時間從20 min延長至80 min時，多酚的提取量顯著增加，從6.48 mg/g提高到7.81 mg/g，繼續(xù)延長提取的時間至100 min，提取的多酚量沒有顯著性增加，為7.90 mg/g。判斷可能是因為提取時間延長，多酚的溶出已經(jīng)達到飽和，故提取量趨于平衡。因此，選擇處理時間60 min、80 min、100 min進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 提取時間對β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚的影響Fig.4 The effect of extraction time on β-cyclodextrin-assisted extraction of polyphenols from Aronia melanocarpa

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到方差分析結(jié)果見表3。對各因素進行回歸擬合，得到多酚提取量（Y）和提取溫度（A）、提取時間（B）、β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度（C）之間的二次多項回歸方程為：

Y=109.02+2.58A+0.23B+1.53C+1.46E-0.030AB-0.015AC-2.22E-0.040BC-0.017A2-1.70E-0.030B2-7.92E-0.030C2（R2=0.9859）

對該模型回歸方差分析，結(jié)果如表3所示。由表可知：此二次回歸模型方程是顯著的（p＜0.0001＜0.05）；失擬項不顯著（p=0.7888＞0.05），說明該回歸模型方程顯著。相關(guān)系數(shù)R2為0.9859，表明該模型的二次多項回歸方程擬合良好，即這種試驗方法是準確可靠的，可以使用該方程模擬真實的3因素3水平分析，用該模型對多酚得率進行分析和預測是可行的。模型的一次項A、B、C、AC和二次項A2、B2對多酚提取量的影響極顯著（p＜0.01）；其他項對多酚提取量的影響不顯著。其中各變量的一次項F值能很好地反應(yīng)各因素（β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度、提取溫度及提取時間）對多酚得率影響的大小，且F值越大說明對多酚提取率的影響越大[23]，因此可知回歸方程一次項系數(shù)表明影響因素的主次順序為提取溫度＞β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度＞提取時間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

圖5 提取溫度和提取時間的響應(yīng)面圖Fig.5 The contour map of extraction temperature and extraction time

圖6 提取溫度和β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度的響應(yīng)面圖Fig.6 The contour map of extraction temperature and β-cyclodextrin mass concentration

圖7 提取時間和β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度的響應(yīng)面圖Fig.7 The contour map of extraction time and β- cyclodextrin mass concentration

2.3.2 兩因素交互作用的分析

通過DesignExpert 8.0.6軟件對回歸結(jié)果做響應(yīng)面，結(jié)果見圖5～7。各圖顯示了β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度、提取溫度和提取時間中任意1個變量處于零水平時，其余2個變量對多酚得率的影響。其中響應(yīng)曲面的坡度反映出因素之間兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響，坡度越陡峭響應(yīng)值越敏感[24]。

通過比較圖5～圖7可知，圖形均成向上的凸狀，其中提取溫度和提取時間的交互作用對多酚提取量的影響最顯著，表現(xiàn)為凸起形狀最明顯；β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度和提取時間的交互作用對多酚提取量最不顯著，表現(xiàn)為圖形最平緩；提取溫度和β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度影響程度位于兩者之間。

2.3.3 最佳提取條件的確定和模型的驗證試驗

由Design-Expert 8.0.6分析回歸模型，得到黑果腺肋花楸多酚的提取最佳條件為提取溫度66.44 ℃、提取時間93.55 min、β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度33.42 g/L?？紤]到實際操作和儀器的便利性，將總多酚的最佳提取條件修正提取溫度66 ℃、提取時間93 min、β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度33 g/L。在上述條件下，進行三次驗證性試驗，實際測定值與理論預測值的相對誤差為0.96%，說明試驗結(jié)果與模型擬合良好，利用響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚的工藝條件結(jié)果準確。

2.3.4 不同提取方法對多酚提取率的影響

圖8 不同提取劑的多酚提取量比較Fig.8 Comparison of the extraction amount of polyphenols with different extractants

在最佳工藝條件下：提取溫度66 ℃、提取時間93 min、β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度33 g/L，比較3種不同提取劑對多酚提取率的影響，試驗結(jié)果見圖8。由圖8可知，β-環(huán)糊精對黑果花楸中多酚的提取量最大，為12.93 mg/g，50%甲醇溶液提取所得的多酚量次之，為12.37 mg/g，而水作為提取劑所得多酚提取量最小，為6.61 mg/g。β-環(huán)糊精可使多酚提取量提高，主要是由于在提取過程中，β-環(huán)糊精與多酚形成的包合物，增加了多酚的溶解度以及溶出的速度[25]。表明與傳統(tǒng)提取法比較，β-環(huán)糊精輔助法提取的黑果腺肋花楸中多酚提取量有所提高。

2.4 HPLC分析

圖9 樣品280 nm色譜圖Fig.9 Sample 280 nm chromatogram

圖10 樣品320 nm色譜圖Fig.10 Sample 320 nm chromatogram

表4 黑果腺肋花楸中各類多酚組分分析Table 4 Analysis of various polyphenols in Aronia melanocarpa

在β-環(huán)糊精輔助提取多酚的最佳工藝條件下，提取黑果腺肋花楸中多酚，得到多酚甲醇溶液，過0.45 μm濾膜后，進行液相分析得到樣品圖，如圖9和圖10所示，通過與標準品色譜圖進行對比，可以得出樣品中的多酚有：香草酸、表兒茶素、阿魏酸、綠原酸及咖啡酸，從表4中可知它們的含量分別為：239.80 μg/g、613.00 μg/g、17.48 μg/g、30.93 μg/g和16.11 μg/g。

3 結(jié)論

本試驗通過單因素（β-環(huán)糊精濃度、提取溫度和提取時間）和響應(yīng)面優(yōu)化試驗獲得了β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚最佳工藝參數(shù)，再對β-環(huán)糊精輔助提取所得黑果腺肋花楸多酚提取液進行HPLC分析。試驗結(jié)果表明：3個因素影響多酚提取的主次順序為提取溫度＞β-環(huán)糊精質(zhì)量濃度＞提取時間；β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚的最佳工藝參數(shù)是提取溫度66 ℃、提取時間93 min、β-環(huán)糊精濃度33 g/L，在該條件下，多酚提取量為12.93 mg/g；對β-環(huán)糊精輔助提取所得黑果腺肋花楸多酚提取液進行HPLC分析，結(jié)果顯示提取液中含有的多酚種類有香草酸、表兒茶素、阿魏酸、綠原酸及咖啡酸，它們的含量分別為239.80 μg/g、613.00 μg/g、17.48 μg/g、30.93 μg/g和16.11 μg/g。本研究為β-環(huán)糊精輔助提取黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)和黑果腺肋花楸的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，但本文中所作研究均來自同一產(chǎn)地同一品種同一批次的黑果腺肋花楸，今后可在本研究的基礎(chǔ)上，對不同品種不同產(chǎn)地黑果腺肋花楸多酚的種類、提取量和提取條件進行比較性研究。