李昭鋒，曹瀟，朱杰，陳思謙，于泓鵬

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，東莞理工科技創(chuàng)新研究院，中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東東莞 523808）

椰果是一種以細菌纖維素和水組成的凝膠狀食品，因其爽滑、多汁、脆嫩、細膩而有彈性的獨特口感而備受消費者的青睞[1,2]。椰果獨特的口感源自其結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性，雖然凝膠中的纖維素含量很低，通常只占凝膠總重量的1%～10%，但纖維素的純度很高[3]。細菌纖維素具有無毒性、良好的液體吸附能力和力學(xué)性能[4]，因此椰果凝膠被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[5]。在東南亞，椰果一直被用作一種傳統(tǒng)甜點食品nata-de-coco的原料[6]。同時，目前我國市面上部分的奶茶、飲料、果凍類產(chǎn)品中也有添加椰果凝膠成分。此外，椰果凝膠也可以用于改善食品的質(zhì)地，例如用作乳化劑來防止巧克力飲料沉淀和用作冰淇淋中的穩(wěn)定劑[7,8]。

椰果是通過纖維素產(chǎn)生菌在含有碳源和氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵獲得[9]。工業(yè)上通常使用木糖駒形氏桿菌（原葡糖醋桿菌或木醋桿菌）（Komagataeibacter原Gluconacetobacter）作為生產(chǎn)菌株，同時使用葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源[10]。不同木糖駒形氏桿菌的菌株對不同碳源的代謝活性存在差異[11]，進而影響椰果凝膠的產(chǎn)量[12]、纖維素濃度、結(jié)構(gòu)和質(zhì)地[13]。以往研究表明，甘露醇作為碳源時，木糖駒形氏桿菌PTCC 1734[14]和ATCC 53524[15]的椰果凝膠產(chǎn)量和濃度均高于使用葡萄糖。對于同一株菌，使用果糖作為碳源產(chǎn)生的椰果凝膠較葡萄糖作為碳源的纖維結(jié)構(gòu)更緊密[16]。這些特性會影響椰果凝膠的力學(xué)性能[13]。因此，在不同碳源條件下培養(yǎng)木糖駒形氏桿菌，是一種獲得具有不同質(zhì)地的椰果凝膠的潛在方法。本文使用兩株木糖駒形氏桿菌（ATCC 23767和ATCC 53582），研究四種不同類型的碳源（葡萄糖、果糖、甘露醇、乙醇）對椰果凝膠產(chǎn)量的影響，著重討論不同碳源對高產(chǎn)菌株所合成的椰果凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、纖維網(wǎng)絡(luò)及多孔結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能（凝膠強度、黏彈性能及拉伸性能）的影響。研究結(jié)果將為建立椰果凝膠質(zhì)地的分析方法，利用不同碳源生產(chǎn)具有不同質(zhì)地和口感的椰果凝膠類食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

木糖駒形氏桿菌購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），保藏編號為ATCC 53582和ATCC 23767，文中均以保藏編號表示。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、無水磷酸氫二鈉2.7 g/L、一水合檸檬酸1.26 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨5 g/L。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將液體種子培養(yǎng)基中的葡萄糖設(shè)置梯度濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L），并分別替換成相同濃度的果糖、甘露醇、和乙醇，其它條件不變。

所有培養(yǎng)基均使用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至5.0，115 ℃高壓滅菌25 min[17]冷卻后使用。

1.1.3 實驗試劑

酵母提取物、蛋白胨購于賽默飛世爾（ThermoFisher）科技公司；瓊脂粉購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、無水磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、D-果糖、甘露醇、無水乙醇、山梨酸鉀均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E萬分之一分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；Smart-Q15去離子純水機，上海和泰儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MCR702流變儀，愛爾蘭安東帕（Anton Paar）公司；CP-25沖片機，揚州市道純試驗機械廠；TA.XT PlusC質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；ME104E液氮罐，查特低溫設(shè)備（成都）有限公司；Scientz-10ND冷凍干燥機，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；MiniFlex 600臺式X射線衍射儀，日本理學(xué)（Rigaku）公司；ETD-2000離子濺射儀，北京博遠微納科技有限公司；EM-30 PLUS臺式掃描電鏡，韓國庫賽姆（COXEM）公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 椰果凝膠的生產(chǎn)

菌株活化：將甘油管中的木糖駒形氏桿菌以劃線接種的方法轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3 d。

種子液制備：挑取多個單菌落置于培養(yǎng)基中，然后于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)2～4 d。

接種和培養(yǎng)：將種子液以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃下靜置培養(yǎng)9 d。

1.3.2 椰果凝膠的處理

在培養(yǎng)結(jié)束后，將收獲的椰果凝膠用去離子水沖洗3～5次以去除殘留在膜表面的培養(yǎng)基。隨后，將椰果凝膠在0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中攪拌加熱至95 ℃并維持20 min以達到純化效果。冷卻至室溫后，在攪拌下用去離子水洗滌多次，直至使用pH試紙檢測凝膠pH值接近7。椰果凝膠低溫保藏，或者在液氮罐中預(yù)凍3～5 min后低溫冷凍干燥48 h。椰果凝膠產(chǎn)量以每升培養(yǎng)基生產(chǎn)的凍干椰果重量計算，總碳源轉(zhuǎn)化率按下列公式計算，纖維素濃度以干重除以濕重計算。

1.3.3 X射線衍射

采用X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）分析椰果凝膠樣品的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度。測試條件如下：工作電壓40 kV，工作電流為15 mA，CuKα輻射波長為0.15406 nm，步長為0.01 °，掃描速度為2.5 °/min，在2θ為10 °～30 °之間記錄衍射圖樣。使用Origin軟件對衍射圖譜進行基線校準(zhǔn)和峰形擬合。結(jié)晶度指數(shù)（CI）表示為所有晶體峰擬合面積占總衍射峰擬合面積的百分比。使用Scherrer公式[18]計算晶體的尺寸：

式中：D為平均晶體寬度；K為形狀因子（0.9）；λ為輻射波長；β為衍射峰的半峰寬；θ是衍射峰的中心角度。

1.3.4 掃描電子顯微鏡

使用鋒利的刀片沿垂直方向?qū)⒗鋬龈稍锏囊z切成尺寸約為3×3 mm的小塊。然后通過離子濺射在樣品表面噴金，最后使用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）進行成像觀察。機器參數(shù)設(shè)置如下：加速電壓為5 kV，工作距離為6～10 mm（根據(jù)樣品的厚度進行調(diào)整）。取景至少從三個不同樣品的三個不同的位置隨機進行，放大倍數(shù)為10000倍。

1.3.5 壓縮/松弛測試和小振幅振蕩剪切測試

使用應(yīng)變控制型流變儀在25 ℃下測量椰果凝膠的凝膠強度和黏彈性。該方法遵循Lopez-Sanchez[19]等的先前報道。使用平行板（PP 40）進行測試。將椰果凝膠放置于兩塊平行板之間的中心區(qū)域并適當(dāng)將凝膠表面抹平，以減小凝膠與平行板之間空氣的影響。將板間距調(diào)節(jié)至與凝膠高度相同，法向力由壓力傳感器（50 N）測試[19]。每個測試循環(huán)包括以恒定速度（1 μm/s）將凝膠法向壓縮100 μm的壓縮過程和維持法向應(yīng)變，以10 rad/s的剪切頻率和0.01%的恒定剪切應(yīng)變（處于線性粘彈性區(qū)域）進行120秒振蕩測試的松弛/剪切過程，兩個過程交替進行。記錄壓縮/松弛過程中的法向應(yīng)力及振蕩測試的彈性模量（G’）和損耗模量（G’’）。進行3次重復(fù)試驗。

1.3.6 多孔彈性理論模型

采用Origin軟件對法向壓縮階段椰果凝膠的力學(xué)行為進行建模。該方法遵循Lopez-Sanchez[19]和Bonilla[20]等人的報道。在壓縮階段的塑性變形區(qū)域（線性區(qū)域）使用線性方程進行擬合（圖1）。其中，t為測試時間，m為擬合直線的斜率。表觀滲透率k（受凝膠孔隙結(jié)構(gòu)影響）由以下公式[19]得出：

式中：v為壓縮速率；r為凝膠的半徑；b為擬合直線的截距；h0為凝膠初始厚度。

圖1 多孔彈性理論擬合模型[19]Fig.1 Poroelasticity theory fitting model[19]

1.3.7 軸向拉伸測試

使用質(zhì)構(gòu)儀對椰果凝膠進行拉伸測試。該方法遵循Mckenna[21]等人的描述，并稍加修改。按照ISO 37-4的標(biāo)準(zhǔn)，使用沖片機將椰果凝膠切割成啞鈴形條帶（寬面尺寸：6×35 mm；窄面尺寸：2×10 mm）。條帶的兩端以測試夾具夾住，并以10 mm/min的恒定速度進行拉伸。使用5 N的拉力傳感器記錄拉伸力，并計算條帶斷裂點的拉伸應(yīng)力和應(yīng)變。楊氏模量定義為拉伸階段的應(yīng)變-應(yīng)力曲線線性變化區(qū)域的斜率。至少進行12次重復(fù)試驗以確保實驗精度。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

椰果凝膠的產(chǎn)量、總碳源轉(zhuǎn)化率、結(jié)晶度和晶體尺寸均通過3組獨立樣品測定取算術(shù)平均值。纖維素網(wǎng)絡(luò)的孔徑為通過ImageJ軟件在SEM圖像上進行50次隨機測量的平均值。數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)、組間比較均采用t檢驗進行分析，當(dāng)p＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵碳源種類及其濃度對椰果產(chǎn)量的影響

圖2 ATCC 53582(a、b)和ATCC 23767(c、d)的椰果產(chǎn)量(a、c)和總碳源轉(zhuǎn)化率(b、d)Fig.2 Yields of coconut (a, c) and total carbon source conversion rates (b, d) of ATCC 53582 (a, b) and ATCC 23767 (b, d)

由圖2可見，在所有測試的碳源中，ATCC 53582的椰果凝膠產(chǎn)量和總碳源轉(zhuǎn)化率均顯著高于菌株ATCC 23767。根據(jù)Florea[22]等人的報道，ATCC 53582具有兩個額外的纖維素合成酶（Acetobactercellulose synthase，Acs）操縱子（Acs2和Acs3）及其包含的與纖維素合成相關(guān)的基因（AcsAB2、AcsC2、AcsAB3和AcsC3），這可能是菌株ATCC 53582高產(chǎn)的原因。當(dāng)乙醇為碳源時，ATCC 53582的椰果產(chǎn)量較其它碳源低，而當(dāng)葡萄糖為碳源且濃度為30或40 g/L時，ATCC 23767的椰果產(chǎn)量較低，這可能與不同菌株在代謝過程中的生理活性差異有關(guān)[23]。當(dāng)葡萄糖為碳源且濃度為20 g/L時，ATCC 53582的椰果產(chǎn)量最高（6.07 g/L），這個結(jié)果與史志強[24]等人的結(jié)果一致。以果糖為碳源時，ATCC 53582的椰果產(chǎn)量隨著果糖濃度的升高而增加，這與Chao[25]等人的研究結(jié)果相似。根據(jù)Ross[26]等人的研究，果糖在木糖駒形氏桿菌代謝過程中產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物較少，發(fā)酵前后培養(yǎng)基pH值沒有明顯下降[23]，但葡萄糖為碳源會產(chǎn)生大量葡萄糖酸，酸性物質(zhì)的積累導(dǎo)致椰果產(chǎn)量降低，蘇建宇[27]等人也證明了相同的結(jié)論。甘露醇為碳源時培養(yǎng)基pH值的變化與果糖類似[28]，而乙醇為碳源則會產(chǎn)生大量乙酸[29]。

2.2 發(fā)酵碳源對椰果纖維素晶體結(jié)構(gòu)的影響

圖3 在四種不同碳源條件下產(chǎn)生的椰果樣品的XRD衍射圖Fig.3 XRD patterns of coconut samples produced under four different carbon source conditions

表1 在不同碳源下生產(chǎn)的椰果纖維素的晶體結(jié)構(gòu)Table 1 The crystal structure of coconut cellulose produced under different carbon sources

由圖3可見，所有椰果樣品（碳源濃度30 g/L，生產(chǎn)菌株ATCC 53582）在2θ為14.4 °，16.8 °和22.6 °附近均有較強的衍射峰，分別由纖維素Iα型（100）、（010）和（110）晶面的反射引起[30]。此外，所有椰果樣品的結(jié)晶度均高于85%，并且（100），（010）和（110）晶面的D值均在一定的范圍（4～8 nm）。Ruka[31]等人發(fā)現(xiàn)ATCC 53524在不同類型的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的椰果纖維素具有相似的結(jié)晶度（范圍68%～79%）。Sheykhnazari[32]等人發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)時間下生產(chǎn)的椰果纖維素也具有較高的結(jié)晶度（75%～80%）。這些結(jié)果表明在不同的培養(yǎng)條件下生產(chǎn)的椰果纖維素均具有較高的結(jié)晶度。

2.3 發(fā)酵碳源對椰果纖維網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的影響

圖4 由四種不同碳源產(chǎn)生的椰果樣品的SEM圖Fig.4 SEM images of coconut samples produced from four different carbon sources

由圖4可知，果糖培養(yǎng)基生產(chǎn)的椰果樣品（碳源濃度30 g/L，生產(chǎn)菌株ATCC 53582）具有最小的平均孔徑（0.48 μm），而從乙醇培養(yǎng)基中獲得的椰果樣品具有最大的孔徑（1.06 μm）。另外，從葡萄糖和甘露醇培養(yǎng)基中獲得的椰果樣品具有相似的孔徑，分別為0.61 μm和0.57 μm。Kaewnopparat[33]等人使用另一株木糖駒形氏桿菌在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的椰果樣品的纖維孔徑（0.02 μm）小于以甘油為碳源產(chǎn)生的椰果樣品（0.03 μm）。也有研究表明，使用產(chǎn)生葡萄糖酸較少的碳源生產(chǎn)的椰果樣品具有更緊密的纖維結(jié)構(gòu)，孔隙率更低[16]。結(jié)果表明，產(chǎn)生較少酸性副產(chǎn)物的碳源能減小椰果樣品纖維網(wǎng)絡(luò)的平均孔徑。

2.4 發(fā)酵碳源對椰果凝膠的強度和恢復(fù)能力的影響

圖5 四種不同碳源產(chǎn)生的椰果凝膠在壓縮/松弛測試中的法向應(yīng)力變化Fig.5 Changes in normal stress of coconut gels produced from four different carbon sources in the compression/relaxation test

表2 將壓縮/松弛測試數(shù)據(jù)與多孔彈性模型擬合得到的椰果凝膠的力學(xué)參數(shù)Table 2 The mechanical parameters of coconut gels obtained by fitting the data of compression/relaxation test to the poroelastic model

圖6 儲能模量(G’)與椰果凝膠高度(a)的關(guān)系圖，G’與纖維素濃度(b)的關(guān)系圖Fig.6 The relationship between storage modulus (G′) and height of coconut gels (a), the relationship between G′ and cellulose concentration (b)

在壓縮階段，所有椰果凝膠（碳源濃度30 g/L，生產(chǎn)菌株ATCC 53582）均表現(xiàn)出明顯的黏彈性區(qū)域（樣品高度減少量為0～0.025 mm）和塑性變形區(qū)域（0.05～0.1 mm）。該結(jié)果與Chen[13]等人的結(jié)果類似。壓縮過程中，從果糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的椰果凝膠具有更小的纖維孔徑（圖4b），因此在壓縮階段法向應(yīng)力增加相對較快[13]。在中和高壓縮應(yīng)變下，所有椰果凝膠的法向應(yīng)力的增加量分別約為低壓縮應(yīng)變下的2和6倍（圖5）。Bonilla[20]等人發(fā)現(xiàn)在較高的壓縮應(yīng)變下椰果凝膠中出現(xiàn)大量的纖維糾纏和形變，導(dǎo)致法向應(yīng)力的劇烈增加。在松弛階段，所有椰果凝膠的法向應(yīng)力先迅速下降，再緩慢降低，這是由于水分不能及時完全地返回纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，該過程受纖維孔隙的影響。因此從葡萄糖、果糖和甘露醇培養(yǎng)基中產(chǎn)生的椰果凝膠的恢復(fù)能力（回復(fù)率80%、79%和68%）低于從乙醇培養(yǎng)基獲得的椰果凝膠的恢復(fù)能力（回復(fù)率82%）。從表2可知，碳源為葡萄糖、果糖和甘露醇的椰果凝膠均具有較大的纖維濃度（1.36～3.64%）和較小的k值（0.44～3.98），而碳源為乙醇的椰果凝膠的纖維濃度最?。?.60～0.97%），k值最大（6.55～42.70），這與SEM的結(jié)果相對應(yīng)（圖4d）。

2.5 發(fā)酵碳源對椰果凝膠黏彈性的影響

由圖6可知，在相同的椰果凝膠高度（0.50 mm）下，從葡萄糖、果糖和甘露醇培養(yǎng)基中產(chǎn)生的椰果凝膠（碳源濃度30 g/L，生產(chǎn)菌株ATCC 53582，下同）的儲能模量G’（分別為210 kPa、230 kPa和170 kPa）高于乙醇培養(yǎng)基產(chǎn)生的椰果凝膠的儲能模量（17 kPa）（圖6a），說明乙醇發(fā)酵得到的凝膠強度較弱。Whitney[34]等人發(fā)現(xiàn)椰果凝膠的模量大小通常由纖維纏結(jié)的數(shù)量決定，高纖維濃度的椰果凝膠在剪切應(yīng)變時纖維纏節(jié)數(shù)量增加更多。Chen[13]等人的研究發(fā)現(xiàn)，高纖維濃度（2.4%）的椰果凝膠的儲能模量（1.2 kPa）高于低纖維濃度（1.6%和1.3%）的椰果凝膠的儲能模量（0.8 kPa和0.6 kPa）。我們的結(jié)果與之相似（圖6）。在相同的纖維素濃度下，從果糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的椰果凝膠的儲能模量高于其它三種椰果凝膠（圖6b），這與果糖培養(yǎng)基得到樣品的較小孔隙結(jié)果一致（圖4a）。

2.6 發(fā)酵碳源對椰果凝膠拉伸性能的影響

在拉伸實驗中，從果糖培養(yǎng)基中獲得的椰果凝膠具有最大的楊氏模量（6.49 MPa）（表3），而從乙醇培養(yǎng)基中獲得的椰果凝膠具有最弱的拉伸強度（1.62 MPa），這與振蕩剪切得到的儲能模量的結(jié)果一致（圖7）。Lanasa[35]等人的研究表明孔徑較小的椰果凝膠具有更大的極限拉伸應(yīng)力，因此從果糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的孔徑較小的椰果凝膠（圖4b）表現(xiàn)出最大的斷裂應(yīng)力（0.80 MPa）。Zhong[16]等人的研究發(fā)現(xiàn)，比起使用葡萄糖為碳源，菌株CGMCC 2955在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的小孔隙率椰果凝膠具有更大的拉伸強度（83.50 MPa），這與我們的結(jié)果類似。另外，孔徑較小的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加了纖維素層間的各向異性結(jié)構(gòu)[21,36]，延緩拉伸過程中纖維條帶的矯直和斷裂，從而提高最大拉伸應(yīng)變值（19.79%）（表3）。

圖7 四種不同碳源產(chǎn)生的椰果凝膠在拉伸測試過程中的代表性應(yīng)力/應(yīng)變曲線Fig.7 Representative stress/strain curves of coconut gels produced from four different carbon sources during tensile testing

表3 四種不同碳源產(chǎn)生的椰果凝膠的拉伸測試數(shù)據(jù)Table 3 Tensile test data of coconut gels produced from four different carbon sources

3 結(jié)論

椰果生產(chǎn)中，木糖駒形氏桿菌菌株的選擇和合適的碳源對于提高其產(chǎn)量和質(zhì)地都十分重要。當(dāng)葡萄糖碳源濃度為20 g/L時，菌株ATCC 53582具有最高的椰果產(chǎn)量（6.07 g/L）。另外，由果糖培養(yǎng)基產(chǎn)生的具有小孔徑的椰果凝膠具有更高的凝膠強度、黏彈性和拉伸性質(zhì)，這可運用于生產(chǎn)質(zhì)地較硬、咀嚼性更強的椰果凝膠；而由乙醇培養(yǎng)基產(chǎn)生的具有大孔徑的椰果凝膠具有更低的強度、黏彈性和拉伸性質(zhì)，這可運用于生產(chǎn)質(zhì)地較軟、方便吸食的椰果果凍。