王瑞瑞，張小軍，曾軍杰，盧義博，方雙琪，陳思

（1.浙江省海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021）（3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021）

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一種非蛋白的神經毒素，毒性很強的生物堿[1]。TTX得分子結構為氨基全氫喹唑啉型化合物，分子式為C11H17O8N3，相對分子質量為319.30。TTX不溶于水和有機試劑，溶于弱酸性水溶液和醇溶液，在強酸和強堿溶液中容易被破壞，有機酸條件下可穩(wěn)定存在。河豚毒素最早是在河豚魚中發(fā)現的，毒素主要分布在卵巢、肝臟、皮膚等組織中[2]。不同生長期的河鲀魚體內毒素分布并不相同，幼年時期的河鲀魚的卵巢發(fā)育不成熟，TTX主要蓄積在皮膚中；而成年河鲀魚的主要蓄積器官是卵巢，肝臟次之[3]。除河鲀魚外，在其他動物體內也檢測到了TTX及其衍生物的存在，如藍環(huán)章魚[4]、蠑螈[5]、紐蟲[6]、織紋螺[7]等。在日本、中國、東南亞等地常有誤食河鲀魚中毒事件發(fā)生[8]，近些年來我國沿海地區(qū)也有食用織紋螺、河豚魚導致中毒的案例，其中毒表現通常為口腔麻木感覺異常，運動性麻痹，身體不協(xié)調，言語不清，嚴重者出現缺氧，心率過緩，意識不清，最終因呼吸衰竭和心臟衰竭而死亡[9]。雖然攝入過量的河豚毒素會導致肌體中毒，但它也具有重要的藥用價值。河豚毒素具有高效選擇性和高效親和性，可迅速阻斷神經纖維上的鈉離子通道，從而抑制神經和肌肉間的興奮傳導，使神經和肌肉麻痹[10]。河豚毒素可作用于特定的鈉離子通道(VGSCs)亞型，VGSCs在疼痛中起著關鍵作用，河豚毒素具有高度選擇性可阻斷VGSCs超蛋白家族，使其在緩解疼痛方面有潛在作用[11]。因此經過提純的TTX也常用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和麻醉等神經性病患的治療[12]。

河豚毒素的生產最早起源于日本，1909年田原良純以紅鰭東方鲀的卵巢首次提取出河豚毒素粗品，并命名為河豚毒素（Tetrodotoxin）。1950年，一些日本學者橫尾晃、津田恭介、河村正郎等也相繼分離出河豚毒素[13]。1958年我國上海水產研究院開始相關TTX的提取工作。70年代末，由解放軍藥物化學研究所與河北省水產研究所合作共同研制出生產TTX的新工藝[14]。隨著TTX的進一步研究，Noguchi[15]等從石灰藻及毒蟹中分離出能產生TTX的細菌。Thuesen[16]和Wu[17]等人也從攜帶河豚毒素的生物體內分離到越來越多的產毒菌株。Yasumoto[18]等人利用微生物發(fā)酵法生產得到TTX，岳田芳等人[19]利用海藻希瓦氏菌（Shewanellaalga）發(fā)酵得到TTX。發(fā)酵法通過產毒菌株代謝來獲得TTX，在一定程度上是節(jié)省資源，減少了對環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的破壞，但是細菌生產的TTX產量低，不能工業(yè)化發(fā)酵生產。2019年日本的Keigo Murakami等人通過一系列化學合成了一種TTX[20]，但TTX同系物種類多，結構復雜，目前人工合成TTX的方法操作難度大，合成經驗不足，尚不能推廣應用。TTX純品生產工藝復雜，產量低，價格昂貴，限制了河豚毒素在醫(yī)療等領域的推廣應用。本文以假睛方鲀肝臟為原料，對肝臟中的河豚毒素進行粗提，在中性氧化鋁、活性炭、離子交換樹脂和Bio-Gel P2凝膠柱中選取合適的純化柱對河豚毒素粗提液進行在分離純化，確定分離純化過程中柱子的最適pH、洗脫液濃度，回收率等條件，研究出一種操作簡單，成本低廉，更容易大量得到河豚毒素的工藝流程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假睛東方鲀（Takifugupseudommus），2018年采購于浙江舟山、溫州等地。經浙江省海洋水產研究所專家對假睛方鲀進行確認后，將魚體解剖取出肝臟，用干凈無污染的絞肉機將肝臟混合攪拌均勻后，保存在-20 ℃冷庫中備用。

河豚毒素標準品，TTX免疫親和柱（3 mL），江蘇美正生物科技有限公司；乙腈、甲醇，Merck德國；乙酸銨、甲酸，Sigma美國；乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水和磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、中性氧化鋁，AR上海國藥集團；CM-High Performance離子交換樹脂（簡稱CM HF），武漢晶誠生物科技有限公司；HILIC親水樹脂，天津艾杰爾科技有限公司；Bio-Gel P2凝膠，美國Bio-Rad公司；D152離子交換樹脂，上海一基實驗有限公司；活性炭粉末（目數：200）。

1.2 儀器和設備

ACQUITY超高效液相色譜-質譜儀Quattro Premier XE，美國Waters公司；氮吹儀、MS2渦旋混合器，德國IKA公司；20通道固相萃取裝置，美國Supelco公司；Centrifuge5810高速離心機，德國Eppendorf公司；冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；層析柱，武漢晶誠生物科技有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；Waters 600 Controller，美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配置

稱取5.00 mg TTX標準品，用0.10%甲酸乙腈-水溶液1:1（V/V）溶解并定容至50 mL，得到濃度為100 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃避光保存。用0.10%甲酸乙腈-水溶液1:1（V/V）對儲備液逐級稀釋，得到100、50、20、10、5、2 ng/mL的標準曲線工作溶液。

1.3.2 TTX提取方法

取勻漿好的肝臟20 g，按液料比1:3（V/W）加入1%乙酸甲醇60 mL，渦旋振蕩5 min，在60 ℃恒溫水浴鍋內提取20 min，水浴過程中每5 min取出震蕩一次，待樣品冷卻至室溫，7000 r/min高速離心6 min，取上清液，55 ℃下旋蒸至體積不再變化，得到假睛方鲀肝臟的粗提液。

1.3.3 樣品的純化

取100 μg/mL的TTX標準溶液，用1 M氫氧化鈉分別將pH調為3、4、5、6、7、8，將中性氧化鋁柱（2 g）、活性炭柱（2 g）、CM HF和D152弱酸性陽離子交換樹脂樹脂（2 g）的4種柱子分別用兩個柱體積的純凈水活化，隨后取1 mL上述TTX標準溶液（100 μg/mL）進行上樣吸附，收集每個組分的淋洗液，用高效液相色譜法-串聯質譜法測定其中TTX含量，計算四種柱子在不同pH值下的吸附率。

將裝好的中性氧化鋁柱（20 g）、活性炭柱（20 g）、CM HF（20 g）和D152（20 g）凈化柱用純水平衡12 h。取TTX標準溶液（100 μg/mL）10 mL用氫氧化鈉（1 mol/L）調pH后上樣，流速為1 min/L。上樣結束后，先用純凈水淋洗兩個柱體積，然后用1%～4%的乙酸水溶液進行梯度洗脫，分別洗脫兩個柱體積，流速為1 mL/min，收集洗脫液，每2 mL收集一次。最后用高效液相色譜-串聯質譜法測定不同濃度洗脫液中TTX含量，并計算TTX在中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF離子交換柱和D152離子交換樹脂柱中的回收率。

1.3.4 色譜及質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；初始流動相（A:B=1:9）A：0.10%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；樣品室溫度：10 ℃；進樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫（0～0.50 min，10% A，90% B；1.50～4 min，60% A，40% B；4.50～5 min，10% A，90% B），流速：0.30 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描（ESI+）；多反應檢測模式；毛細管電壓：3.50 kV；脫溶劑氣溫度：385 ℃；離子源溫度；119 ℃；錐氣孔：高純氮氣，流速55 L/h；脫溶劑氣：高純氮氣，流速800 L/h；TTXm/z320→m/z302.10；錐孔電壓：30 V；碰撞能量：25 V。

1.3.5 數據處理

TTX含量以高效液相色譜法檢測，吸附率和回收率曲線由Origin 9進行繪制。吸附率和回收率按下列公式計算[21]：

式中：M：TTX的吸附率；m0：TTX上樣液濃度；m1：TTX上樣接收液濃度；N：洗脫液回收率；n1：TTX上樣液濃度；n2：柱子洗脫液濃度。

2 結果與分析

2.1 上樣液pH對不同柱子吸附率的影響

如圖1所示，中性氧化鋁柱在酸性條件下吸附率僅為35%左右，酸性條件下TTX不能吸附在中性氧化鋁上，隨著pH值的增大，中性氧化鋁的吸附能力變大，pH值為中性時，吸附率最大為86.42%；當pH=3時，活性炭的吸附率最低，幾乎不吸附，隨著pH的增大，河豚毒素在極性變小，活性炭對TTX得吸附量逐漸增加，在pH=7時吸附率最大為92.73%。CM HF離子交換柱對TTX的吸附率也隨pH值的增大而增大，在pH=7時最大為90.15%。D152柱在pH=3時對TTX的吸附率較低，pH=5時，達到最大吸附率為91.97%，當pH繼續(xù)增大，吸附力變小。綜上所述，中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF和D152離子交換柱的最高吸附率分別為86.42%、92.73%、90.15%、91.97%，而此時四種柱子吸附率最高時與之相應的上樣液pH分別為7、7、7、5。因此，為保證上述四種柱子能夠最大吸附TTX，上樣時中性氧化鋁柱、活性炭柱和CM HF離子交換柱應將pH調為7，D152離子交換柱上樣液pH應調為5。

圖1 四種柱子在不同pH中的吸附率Fig.1 Adsorption rates of the four columns at different pH

2.2 不同凈化柱對TTX回收率條件的影響

假睛東方鲀肝臟粗提液中基質復雜，含有大量的蛋白質、色素、油脂等大分子雜質，需要通過層析柱的處理，對河豚毒素粗提液進行分離純化，去除色素、蛋白質等其他雜質，得到目標物質。本實驗比較了TTX溶液分別在中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF和D152離子交換柱凈化時的效果，確定不同柱子在洗脫時洗脫液的乙酸濃度，并根據洗脫液回收率選擇適合純化河豚毒素的柱子。如圖2所示，中性氧化鋁柱在乙酸濃度為2%～3%區(qū)間被洗脫出來，在洗脫液為2%乙酸溶液時存在一個較大的洗脫峰，當洗脫液乙酸濃度為3%時仍有少量TTX被洗出，計算得到中性氧化鋁柱純化時TTX的總回收率為78.75%；圖3為活性炭柱純化時TTX的回收率曲線圖，由圖可知，當洗脫液的為2%乙酸溶液時存在一個洗脫峰，計算活性炭柱的回收率為88.57%，且在洗脫過程中發(fā)現有部分活性炭會進入洗脫液中，增加后續(xù)實驗難度；圖4為CM HF柱純化時洗脫曲線，由圖可知TTX在洗脫液濃度為在1%乙酸溶液時較多洗脫出來，洗脫液乙酸濃度為2%乙酸溶液時仍有部被洗脫出來，當濃度繼續(xù)增加不再有TTX洗脫下來，計算CM HF柱純化時的總回收率為83.13%；根據圖5中D152離子交換柱洗脫曲線圖可知，TTX在乙酸濃度為3%～4%存在洗脫峰，且測得洗脫液中TTX的總回收率總93.98%。綜上所述，D152離子交換柱在在四種柱子中的回收率最高，洗脫液濃度為3%～4%乙酸溶液，活性炭柱的回收率次之為88.57%，為減少純化過程中有效物質的損失，D152離子交換柱和活性炭柱更符合純化柱的選擇。中氧化鋁柱和CM HF柱的回收率較低，吸附率也較低，純化過程中容易造成有效物質的流失，降低純化效率，增加純化成本，因此不考慮后兩者進行純化。

圖2 中性氧化鋁柱TTX洗脫曲線圖Fig.2 TTX elution diagram of neutral alumina column

圖3 活性炭柱TTX洗脫曲線圖Fig.3 TTX elution diagram of activated carbon column

圖4 CMHF離子交換柱TTX洗脫圖Fig.4 TTX elution diagram of activated carbon column

圖5 D152離子交換柱TTX洗脫曲線圖Fig.5 TTX elution diagram of D152 ion exchange column

2.3 實際樣品的驗證

表1 不同型號柱子測定結果對比Table 1 The measurement results of different types of columns were compared

根據表1可知，活性炭柱的吸附率最高，D152柱的吸附率次之，但對比兩者解吸率D152柱的洗脫能力更強一些，且活性炭柱在洗脫過程中會引入新的雜質，增加了純化的難度。在實際應用中，凈化柱的吸附率和洗脫率越高，其有效成分損失越少，分離效率越高，降低了生產成本。綜合以上因素，選用D152離子交換柱作為河豚毒素粗提液的純化。

河豚毒素具有鎮(zhèn)痛、麻醉等作用，在醫(yī)學領域有重要作用，但目前河豚毒素純品稀少，且價格昂貴，使河豚毒素應用受到限制。目前河豚毒素的生成方法主要有海洋細菌生物合成法[22]、人工合成法[23]和以河鲀魚為原料的提取分離法。但微生物生產的TTX含量低且存在副產物較多，目前應用于實際生產較為困難；人工合成技術難度較大，且該技術尚未成熟，應用推廣難度大，尚不適合工業(yè)推廣。目前市場河豚毒素的主要來源還是從有毒河鲀中提取和純化得來的。本實驗選取勻漿好的假睛東方鲀肝臟10 g，按照1.2.3步驟進行提取，將粗提液調pH，然后用D152離子交換柱純化得到洗脫液，最后對洗脫液濃縮，用8%～10%的氨水調節(jié)pH至中性，有白色固體析出，將白色固體洗滌3遍，進行冷凍干燥，得到TTX粗品（粗品中含TTX及同系物），純度達80%。將純化后的河豚毒素樣品通過超高效液相色譜柱檢測，由圖6可知純化后的河豚毒素粗品與河豚毒素標準品保留時間相同，是目標產物。

圖6 河豚毒素液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography of tetrodotoxin

3 結論

本實驗利用層析技術對河豚毒素進行分離純化，比較了中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF柱和D152弱酸性陽離子交換柱分別對河豚毒素的純化效果，最終確定D152離子交換柱作為河豚毒素粗提液的純化柱，其中D152柱的上樣液最適pH為3，洗脫液為3%～4%乙酸水溶液兩個柱體積。并且經過實際樣品驗證得到純度為80%的河豚毒素粗品。通過一系列的提取，分離純化等步驟，將肝臟粗提液中的脂類，蛋白質，色素等大分子雜質得以除去，得到白色的河豚毒素粗品。粗品可經過進一步的分離純化得到TTX純品及TTX同系物純品，此項技術有待繼續(xù)研究。本實驗以河鲀魚肝臟為原料提高資源利用率，減少有毒河鲀魚造成的環(huán)境污染，且實驗操作流程簡單，成本低廉，富集純化效果好，為進一步制取河豚毒素純品提供便捷。