劉雪，陳艷紅,2，姜澤東,2，倪輝,2，李清彪,2，朱艷冰,2

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門(mén) 361021）（2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén)市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門(mén) 361021）

瓊膠主要由紅藻細(xì)胞壁中提取出來(lái)的一種膠體物質(zhì)[1]。瓊膠的膠凝性和穩(wěn)定性好，常被用于凝固劑、增稠劑和乳化劑，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。瓊膠可視為主要由瓊脂糖和瓊脂果膠構(gòu)成的混合物。瓊脂糖是一種由D-半乳糖和3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖經(jīng)α(1→3)和β(1→4)糖苷鍵交替連接而成的鏈狀中性多糖，是形成凝膠的主要組分[2]。瓊脂果膠是由一系列復(fù)雜的多聚糖鏈組成，它包括β-D-半乳糖、3,6-脫水-α-L-半乳糖以及丙酮酸、硫酸基和甲基等[3]。瓊膠的降解產(chǎn)物分子量小，粘度低，水溶性好，易被人體吸收，并且具有多種生物學(xué)功能，包括抑菌、抗氧化、美白、保濕、抗病毒等[4]，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

酶法是制備瓊膠寡糖高效環(huán)保的技術(shù)手段。瓊膠酶可以通過(guò)酶解作用將瓊膠降解為瓊膠寡糖。根據(jù)催化糖苷鍵的類(lèi)型，可將瓊膠酶分為兩類(lèi)：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶[5]。α-瓊膠酶產(chǎn)物是以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖（Agaro-oligosaccharides，AOs）；β-瓊膠酶產(chǎn)物是以D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖（Neoagaro-oligosaccharides，NAOs）[5]。瓊膠酶應(yīng)用廣泛，例如制備瓊膠寡糖，從瓊脂糖凝膠中回收脫氧核糖核酸，制備海藻原生質(zhì)體，從海藻中提取生物活性物質(zhì)[5]。

瓊膠酶來(lái)源于海洋微生物、海洋軟體動(dòng)物，貝類(lèi)和土壤等中。產(chǎn)瓊膠酶的微生物來(lái)源包括交替單胞菌屬（Alteromonassp.）[6]、弧菌屬（Vibriosp.）[7]、泡囊假單胞菌（Pseudomonas vesicularis）[8]、微泡菌屬（Microbulbifersp.）[9]、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonassp.）[10]、嗜鹽球菌屬（Halococcussp.）[11]、嗜麥芽單胞菌屬（Stenotrophomonassp.）[12]、交替單胞菌屬（Saccharophagus degradans）[13]、火色桿菌屬（Flammevirgasp.）[14]等。

一般熱瓊脂溶液在40 ℃以下時(shí)會(huì)凝固形成凝膠，粘度也會(huì)增大，因此在利用瓊膠酶降解瓊膠過(guò)程中，為提高酶解效率，要求瓊膠酶具備一定的熱穩(wěn)定性。因此開(kāi)發(fā)具有良好熱穩(wěn)定性的瓊膠酶意義重大。本文中，我們將來(lái)自噬瓊膠菌AL1（Agarivoranssp.AL1）的熱穩(wěn)定瓊膠酶基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，研究瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，以及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，為該熱穩(wěn)定瓊膠酶的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

噬瓊膠菌AL1、大腸桿菌BL21（DE3），由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTPs、BamHI、SalI和卡那霉素為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒購(gòu)買(mǎi)自天根生化科技有限公司；瓊脂糖為海川生物科技有限公司產(chǎn)品；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與設(shè)備

雙層全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；高速離心機(jī)，德國(guó)Coeppendorf AG Co；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；冷凍干燥儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；UltiMate 3000高校液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 瓊膠酶重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)噬瓊膠菌瓊膠酶基因的正向引物序列：5"-CGCGGATCCCTG-CTACCTTAGTCACCTC-3"（劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)），反向引物序列：5"-ACGCGTCGACTTACACTTTACGACGTCTTAG-3"（劃線部分為SalI酶切位點(diǎn)）。以噬瓊膠菌AL1的基因組DNA為模板，進(jìn)行瓊膠酶基因的PCR，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，以上循環(huán)30次；最后在72 ℃延伸10 min。利用1.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物的大小進(jìn)行測(cè)定，并利用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收。利用BamHI和SalI對(duì)目的基因和表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，目的基因和表達(dá)載體用試劑盒分別回收，它們的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布至含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，進(jìn)行插入序列的測(cè)序分析，獲得含有瓊膠酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒PET-28a-aga。

1.4 重組瓊膠酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

挑取單克隆，接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。把活化好的菌液按1.00%的比例轉(zhuǎn)接于200 mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）中，37 ℃、180 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.60～0.80。加入異丙基-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol/L，在16 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)20 h后，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在4 ℃下離心（5000 r/min，20 min）收集菌體。參照Qiagen公司的Ni-NTA使用說(shuō)明書(shū)純化重組蛋白。收集純化樣品，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析目的蛋白的純度及其分子量大小。

1.5 瓊膠酶活力測(cè)定

使用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定瓊膠酶活力。取5 μL酶液（2.00 mg/mL），加入195 μL 0.20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖溶液（以50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.00配制），混合物在50 ℃反應(yīng)15 min后，加入200 μL DNS溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min。于520 nm處測(cè)量還原糖的吸光度。瓊膠酶活性定義為：在上述條件下，每min生成1 μmoL還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.6 重組瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 瓊膠酶的底物特異性分析

以0.20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖、κ-卡拉膠、海藻酸鈉、巖藻多糖、羧甲基纖維素鈉為底物溶液來(lái)檢測(cè)瓊膠酶的活力，研究酶的底物特異性。將5 μL酶液分別與195 μL上述不同底物溶液混合，50 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)完成后用DNS法進(jìn)行酶活的測(cè)定以及計(jì)算。此外，將500 μL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）與200 μL 4 mg/mL人工顯色底物（對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷或?qū)ο趸?β-D-吡喃半乳糖苷）溶液，置于45 ℃溫育5 min。加入500 μL重組酶，45 ℃反應(yīng)30 min后，加入500 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在420 nm下測(cè)定樣品的吸光度值，測(cè)定酶的活力，研究酶的底物特異性。

1.6.2 溫度對(duì)瓊膠酶活性和穩(wěn)定性的影響

以瓊脂糖為底物，按照1.5的酶活力測(cè)定方法，測(cè)定在不同溫度（30～70 ℃）下重組酶的活力，并以最高酶活力為100%，研究溫度對(duì)瓊膠酶活性的影響，將瓊膠酶置于不同的溫度（30～70 ℃）中孵育1 h后，測(cè)定酶的殘余活力，進(jìn)行酶的溫度穩(wěn)定性分析，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

1.6.3 pH對(duì)瓊膠酶活性和穩(wěn)定性的影響

配制不同pH的緩沖液：pH 3.00～5.00（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液）、pH 5.00～7.00（磷酸鈉緩沖液）、pH 7.00～9.00（Tris-HCl緩沖液）、pH 9.00～11.00（甘氨酸-NaOH緩沖液），在不同的pH條件下測(cè)定酶的活力，從而研究重組酶的最適反應(yīng)pH。將酶在不同pH緩沖液中于37 ℃孵育1 h后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，測(cè)定重組酶的pH穩(wěn)定性。

1.6.4 金屬離子對(duì)瓊膠酶活性的影響

將用蒸餾水透析過(guò)的酶液與不同金屬離子溶液混合，使其終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L，37 ℃放置1 h后，加入0.20%的瓊脂糖底物，于50 ℃反應(yīng)15 min，測(cè)定瓊膠酶的活力，以未添加金屬離子的酶活力為100%。

1.6.5 抑制劑、還原劑、去垢劑和變性劑對(duì)瓊膠酶活性的影響

將終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L抑制劑EDTA或還原劑（DTT和β-巰基乙醇）、0.10%或1%（體積分?jǐn)?shù)或質(zhì)量分?jǐn)?shù)）去垢劑（tween 20、tween 80、triton X-100和SDS）、1 mol/L或5 mol/L變性劑尿素添加到重組酶中，37 ℃溫育1 h后，測(cè)定酶的活力。其中，以未添加檢測(cè)試劑的酶活力為100%。

1.6.6 重組瓊膠酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.00）配制濃度為0.50～4.50 mg/mL的瓊脂糖溶液，將重組瓊膠酶分別與不同濃度的瓊脂糖溶液反應(yīng)，測(cè)定瓊膠酶的活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算瓊膠酶米氏方程的最大反應(yīng)速率（Vmax）與底物親和常數(shù)（Km）。

1.6.7 重組瓊膠酶的酶解產(chǎn)物分析

將50 U重組瓊脂酶和100 mL 0.50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖溶液混合后，在50 ℃溫育。分別在0～24 h內(nèi)的不同酶解時(shí)間點(diǎn)取樣，將樣品在硅膠板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為正丁醇-冰醋酸-水溶液（體積比2:1:1），顯色劑使用含10%（體積分?jǐn)?shù)）H2SO4的乙醇溶液，分析不同反應(yīng)時(shí)間的酶解產(chǎn)物。酶解24 h后，煮沸5 min，離心取上清液，上清液加入100 mL乙醇，靜置過(guò)夜，待不溶物析出后，將上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，然后將上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇并濃縮樣品，最后將樣品冷凍干燥至粉末狀，獲得酶解產(chǎn)物。取適量樣品粉末，溶于超純水中，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）進(jìn)行分析，液相分析條件為：采用AC-QUITY BEH C18柱，以流動(dòng)相A（純乙腈）和流動(dòng)相B（超純水）進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.30 mL/min。

1.6.8 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性研究

取適量冷凍至粉末狀的樣品溶于超純水中，按照Z(yǔ)hu等[15]的方法并稍作修改，進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定。

1.6.9 蛋白序列和結(jié)構(gòu)分析

采用DNAMAN軟件對(duì)瓊膠酶的基因序列進(jìn)行分析；利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具SignalP v4.10對(duì)瓊膠酶的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；在Carbohydrate-Active Enzyme（CAZy）數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找不同家族來(lái)源的特征瓊膠酶的蛋白質(zhì)序列，采用MEGA7.00構(gòu)建瓊膠酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；利用ExPAsy中的ProtParam Tool對(duì)瓊膠酶的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用SMART工具預(yù)測(cè)瓊膠酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；將瓊膠酶的蛋白序列提交到SWISS-MODEL網(wǎng)站，經(jīng)同源比對(duì)搜索模板，利用Modeller 9.16軟件構(gòu)建三維模型，并利用Verify-3D對(duì)模型進(jìn)行評(píng)分。

1.6.10 數(shù)據(jù)處理

為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)的可靠性，上述每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Micro Soft Office 2016進(jìn)行處理分析，p＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬瓊膠菌AL1瓊膠酶基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

圖1 Agarivorans sp.AL1瓊膠酶的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Unrooted neighbor-joining phylogenetic tree of Agarivorans sp.AL1 agarase

圖2 噬瓊膠菌AL1瓊膠酶的三維建模Fig.2 3D structure modeling of agarase from Agarivorans sp.AL1

利用DNAMAN進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶基因大小為2988 bp，預(yù)測(cè)編碼995個(gè)氨基酸。對(duì)瓊膠酶的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示基因編碼蛋白質(zhì)的前27個(gè)氨基酸被預(yù)測(cè)為信號(hào)肽，27-28號(hào)氨基酸之間為剪切位點(diǎn)。將目的蛋白序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，它與來(lái)源于Agarivoranssp.QM38菌株的β-瓊膠酶（ABK51379.1）有 99%的相似性，與來(lái)源于Agarivoranssp.Alg241-V36菌株的β-瓊膠酶（WP_163131938.1）有68%的相似性，與來(lái)源于Vibriosp.EJY3菌株的β-瓊膠酶（WP_014232191.1）有52%的相似性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶與來(lái)自Agarivoranssp.HZ105（ADY17918.1）的瓊膠酶在同一分支（圖1），后者是GH50家族的代表成員，這些結(jié)果表明，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶歸屬于GH50家族。結(jié)構(gòu)域分析顯示，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶包含一個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊，位于250～388位氨基酸殘基。將該瓊膠酶進(jìn)行三維模建，模板為來(lái)源于交替單胞菌（Saccharophagus degradans）的β-瓊膠酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB登入號(hào)：4BQ4），氨基酸殘基的范圍為207～920位氨基酸殘基，覆蓋率為69.00%，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶與模板的序列相似性為36.80%。模型利用Verify-3D評(píng)分為89.20%，通過(guò)評(píng)價(jià)。構(gòu)建的噬瓊膠菌AL1瓊膠酶的部分三維（207～920位氨基酸殘基）結(jié)構(gòu)顯示，該瓊膠酶采用了雜合折疊，該折疊在瓊膠酶的N端包含一個(gè)β-三明治結(jié)構(gòu)域，并與C端精致的（α/β）8桶融合（圖2a）。將噬瓊膠菌AL1β-瓊膠酶（藍(lán)色）與模板（綠色）進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊合（圖2b），模板的催化活性位點(diǎn)Glu534、Glu695（黃色棍狀）和噬瓊膠菌AL1β-瓊膠酶的Glu653、Glu822（紅色棍狀）高度重合，說(shuō)明Glu653和Glu822組成可能的噬瓊膠菌AL1β-瓊膠酶的催化活性位點(diǎn)。

2.2 噬瓊膠菌AL1瓊膠酶的體外表達(dá)和純化

圖3 噬瓊膠菌AL1瓊膠酶在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.3 Expression of agarase from Agarivorans sp.AL1 in E.coli

含有瓊膠酶基因的E.coliBL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和純化后，利用SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為105 ku（圖3）。

2.3 重組瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶的底物特異性

分別以瓊脂糖、κ-卡拉膠、海藻酸鈉、巖藻聚糖、羧甲基纖維素鈉作為底物，研究酶的底物特異性，結(jié)果顯示，重組瓊膠酶可以降解瓊脂糖，降解其他底物的活性很低（圖4），說(shuō)明該重組酶為瓊膠酶。另外，該重組瓊膠酶可以特異性地降解對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（OD420=0.427），而不降解對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷（OD420=0.008），表明它可以特異性識(shí)別β-糖苷鍵，不能識(shí)別α-糖苷鍵。上述結(jié)果表明，該重組酶屬于β-瓊膠酶，與來(lái)自噬瓊膠菌屬（Agarivoranssp.JA-1）β-瓊膠酶[16]的底物選擇性一致。

圖4 重組瓊膠酶的底物特異性Fig.4 Substrate specificity of the recombinant enzyme

2.3.2 溫度和pH對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的影響

研究溫度對(duì)酶活性的影響，結(jié)果顯示，酶的最適反應(yīng)溫度是 50 ℃，與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonassp.Aga3463）[10]和火色桿菌屬（Flammeovirgasp.OC4）[14]來(lái)源的瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度相同。重組酶酶在30 ℃和70 ℃時(shí)分別具有40.67%和50.12%的酶活力（圖5a）。酶的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果（圖5b）顯示，重組酶在40 ℃和50 ℃處理1 h后，酶分別具有81.12%和77.71%的殘余活力；在60 ℃處理1 h后，仍具有35.31%的酶活力，紅球菌屬（Rhodococcussp.Q5）瓊膠酶[17]在60 ℃溫育30 min，具有 20%的殘余活性；嗜麥芽單胞菌屬（Stenotrophomonassp.NTa）瓊膠酶[12]在50 ℃下溫育1 h，殘余酶活力為46%；噬瓊膠卵鏈菌屬（CatenovulumAgarivoransYM01T）瓊膠酶[18]分別在50 ℃和60 ℃下溫育1 h，殘余酶活力分別約為45%和25%。這些結(jié)果說(shuō)明，本文報(bào)道的噬瓊膠菌AL1來(lái)源β-瓊膠酶表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。

在不同的pH緩沖溶液中測(cè)定酶的最適反應(yīng)pH，研究pH對(duì)酶活性的影響。結(jié)果如圖5c所示，重組瓊膠酶在pH為7.00時(shí)活力最高，與交替單胞菌屬（Alteromonassp.GNUM-1）[6]、噬瓊膠卵鏈菌屬（CatenovulumAgarivoransYM01T）[18]最適作用pH值一致，高于噬瓊膠菌屬（AgarivoransgilvusWH0801）[19]（最適 pH 為 6.00）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonassp.Q30F）[20]（最適pH為6.50）來(lái)源的瓊膠酶。重組瓊膠酶在pH 5.00～11.00范圍內(nèi)具有55%以上的酶活力。酶的pH穩(wěn)定性分析結(jié)果如圖5d所示，在pH 6.00～7.00保持了較高的pH穩(wěn)定性，在pH 5.00～11.00的范圍內(nèi)，重組酶具有高于50%的殘余活力，說(shuō)明重組瓊膠酶具有寬的pH穩(wěn)定性，這與嗜麥芽單胞菌屬（Stenotrophomonassp.NTa）[12]瓊膠酶具有相似性，高于微泡菌屬（Microbulbifersp.BH-1）[21]瓊膠酶的pH穩(wěn)定性（pH為10.00時(shí)溫育30 min，殘余酶活性為40%左右）。綜上所述，噬瓊膠菌AL1瓊膠酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，使其在食品、化妝品和醫(yī)療工業(yè)應(yīng)用中成為非常有吸引力的酶。

圖5 溫度對(duì)重組瓊膠酶活性（a）及穩(wěn)定性（b）的影響和pH對(duì)重組瓊膠酶活性（c）及穩(wěn)定性（d）的影響Fig.5 Effects of temperature on activity (a) and thermostability(b) and effects of pH on activity (c) and stability (d) of the recombinant agarase

2.3.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響

圖6 金屬離子對(duì)重組瓊膠酶活性的影響Fig.6 Effects of metal ions on the activity of the recombinant agarase

研究不同金屬離子對(duì)重組瓊膠酶活性的影響，如圖6所示，1 mmoL/L或10 mmoL/L的K+、Na+和Cu2+對(duì)重組酶活性具有促進(jìn)作用；1 mmoL/L或10 mmoL/L的Ca2+、Fe2+和Ba2+對(duì)重組酶的活性幾乎沒(méi)有影響；10 mmoL/L Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+和Al3+對(duì)重組酶活性有不同程度的抑制作用，其中Zn2+和Fe3+幾乎完全抑制了重組酶的活性。

2.3.4 抑制劑、還原劑、去垢劑和變性劑對(duì)酶活性的影響

表1 抑制劑、還原劑、去垢劑和變性劑對(duì)重組瓊膠酶活性的影響Table 1 Effects of inhibitors, reducing regents, detergents and denaturant on the activity of the recombinant agarase

抑制劑EDTA對(duì)瓊膠酶活性明顯不大（表1），這與Li等[10]的研究結(jié)果一致，而An等[18]研究結(jié)果表明，EDTA嚴(yán)重抑制噬瓊膠卵鏈菌屬（Catenovulum AgarivoransYM01T）瓊膠酶的活性。EDTA是一種螯合劑，可以清除二價(jià)陽(yáng)離子并使金屬離子依賴性酶失活，這些結(jié)果表明，本文中的瓊膠酶不是金屬離子依賴性酶。本研究中，硫醇還原劑（如DTT和β-巰基乙醇）對(duì)重組β-瓊膠酶沒(méi)有明顯影響，表明二硫鍵對(duì)其催化活性不是必不可少的，這與Hou等[22]的研究結(jié)果一致。重組瓊膠酶對(duì)去垢劑triton X-100、tween 80、tween 20和SDS具有良好的抗性，處理?xiàng)l件下，仍保持高于65%的殘余活力（表1）。此外，重組瓊膠酶對(duì)變性劑尿素也有較好的抗性，5 mol/L尿素處理后，仍具有74.60%的殘余活力（表1）。

2.3.5 重組瓊膠酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以瓊脂糖溶液為底物，研究重組瓊膠酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。當(dāng)瓊膠酶與不同濃度的瓊脂糖進(jìn)行反應(yīng)后，通過(guò)繪制雙倒數(shù)曲線，計(jì)算出瓊膠酶的Km和Vmax分別為13.93 mg/mL和4.37 U/mg。

2.4 瓊脂糖酶解產(chǎn)物的鑒定

圖7 瓊脂糖酶解產(chǎn)物的TLC（a）和MS分析（b）Fig.7 The enzymatic hydrolysis products of agarose determined by TLC (a) and MS analysis (b)

由重組瓊膠酶、產(chǎn)生的水解產(chǎn)物通過(guò)薄層色譜（TLC）進(jìn)行鑒定。如圖7a所示，在反應(yīng)初始階段產(chǎn)生了一系列不同聚合度的新瓊寡糖。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高聚合度的寡糖明顯減少，反應(yīng)2 h時(shí)TLC出現(xiàn)1個(gè)明顯的斑點(diǎn)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間未見(jiàn)寡糖組成明顯變化。將24 h的酶解產(chǎn)物進(jìn)行MS分析，如圖7b所示，在m/z347（M+Na）+有明顯的峰，經(jīng)分析為新瓊二糖產(chǎn)物。綜上所述，重組瓊膠酶為以新瓊二糖為最終酶解產(chǎn)物的β-瓊膠酶。

2.5 瓊脂糖酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖8 重組瓊膠酶酶解產(chǎn)物的·OH自由基的清除作用Fig.8 The scavenging effect of ·OH radicals from the hydrolysates of recombinant agarase

圖9 重組瓊膠酶酶解產(chǎn)物的ABTS自由基的清除作用Fig.9 The scavenging effect of ABTS free radicals from the digestion products of recombinant agarase

圖10 重組瓊膠酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基的清除作用Fig.10 The scavenging effect of DPPH free radicals from the digestion products of recombinant agarase

圖11 重組瓊膠酶酶解產(chǎn)物的還原能力Fig.11 Reducing power of the recombinant agarase digestion products

瓊脂糖酶解產(chǎn)物的抗氧化活性通過(guò)測(cè)定其清除自由基的能力進(jìn)行研究。如圖8a和9a所示，酶解產(chǎn)物對(duì)·OH自由基和ABTS自由基的清除能力隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH自由基和ABTS自由基的清除率分別為91.00%和89.00%，酶解產(chǎn)物對(duì)·OH自由基和ABTS自由基的半數(shù)抑制劑量IC50分別為 1.28 mg/mL和3.46 mg/mL。由圖10a可知，酶解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為2.50～12.50 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率的增長(zhǎng)速率快；當(dāng)酶解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為12.50 mg/mL時(shí)，產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率為55.60%，此后清除作用基本不變，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制劑量IC50為9.87 mg/mL。如圖11a所示，酶解產(chǎn)物對(duì)鐵離子的還原能力隨著濃度的增高而增強(qiáng)，酶解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為15.00 mg/mL時(shí)，還原力（OD700）增加到0.56。上述結(jié)果表明，利用噬瓊膠菌β-瓊膠酶水解瓊脂糖的酶解產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)來(lái)源于噬瓊膠菌AL1的瓊膠酶進(jìn)行體外表達(dá)和純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶解產(chǎn)物鑒定及抗氧化活性分析。結(jié)果表明，來(lái)自噬瓊膠菌AL1的重組瓊膠酶分子質(zhì)量為105 ku，瓊膠酶的最適溫度和pH是50 ℃、7.0，在60 ℃處理1 h后，仍具有35.31%的酶活力，在5.00～11.00的寬pH范圍內(nèi)處理1 h，仍具有55%以上的殘余酶活力，說(shuō)明該重組酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。該重組酶對(duì)去垢劑（triton X-100，tween 20、tween 80和SDS）和變性劑尿素表現(xiàn)出良好的耐受性，有利于該重組瓊膠酶的工業(yè)應(yīng)用。利用噬瓊膠菌AL1瓊膠酶水解瓊脂糖的終產(chǎn)物為新瓊二糖，產(chǎn)物經(jīng)分析具有良好的抗氧化活性。新瓊二糖具有良好的美白和保濕雙重功效，同時(shí)也具有一些抗氧化活性防止機(jī)體損傷[23]，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)療領(lǐng)域。