張玲玲，羅惠波，黃丹，張倩，鄭升海，童文華

（四川輕化工大學釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

曲為酒之骨，酒曲質(zhì)量的好壞直接影響著白酒的質(zhì)量、產(chǎn)量和風格。中高溫大曲是釀造濃香型白酒的糖化發(fā)酵劑，含有酵母、霉菌、細菌等多種微生物，這些微生物在濃香型白酒的釀造過程中共酵生成復(fù)雜的白酒成分，賦予了濃香型白酒獨特的風格特征[1,2]。中高溫大曲在制曲培菌過程中最高品溫可達62 ℃，由于芽孢桿菌存在利用芽孢應(yīng)對脅迫環(huán)境的特性，因此在大曲制備的高溫條件下芽孢桿菌成為其中的優(yōu)勢細菌之一。芽孢桿菌不但能夠代謝產(chǎn)生ACT、2,3-丁二醇以及吡嗪等風味物質(zhì)作為濃香型白酒的主要呈香物質(zhì)，還可以代謝產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等多種酶類，推動大曲及白酒釀造過程中的各種生化反應(yīng)進行[3,4]。ACT學名3-羥基-2-丁酮（3-Hydroxy-2-butanone），是一種具有特殊奶油香味的揮發(fā)性化合物，有類似蜂蜜的甜味，是酒類調(diào)香中一個極其重要的物質(zhì)，也是白酒風味物質(zhì)中的重要香味成分，在名優(yōu)酒中含量尤為突出[5]。ACT同時也是一種重要的高附加值化學品，廣泛用于食品，煙草，化妝品，洗滌劑，化學合成，植物生長促進劑和生物害蟲防治中[3,6,7]。

近些年ACT合成方式的研究越來越受關(guān)注，ACT生產(chǎn)方法主要有化學合成法[8]、酶轉(zhuǎn)化法[9]和微生物合成法[10-12]。由于化石資源日益枯竭、溫室效應(yīng)、污染排放等因素的制約，化學合成法逐步被微生物合成法取代。微生物合成法是根據(jù)微生物的生理特性和其自身的代謝特點，以廉價碳源為底物，在一定條件下通過發(fā)酵獲得ACT的一種良好方法，具有安全、經(jīng)濟、綠色、高效、可持續(xù)的特點，越來越受到各國研究者的關(guān)注。在微生物發(fā)酵法中，篩選更高效、穩(wěn)定的ACT生產(chǎn)菌株，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，對提高ACT產(chǎn)量有至關(guān)重要的作用[13,14]。

自然界中能夠自然合成ACT的微生物有很多。TIAN等[15]從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisSF4-3），使用優(yōu)化的培養(yǎng)基后ACT產(chǎn)量達到46.2 g/L；TEIXEIRA等[16]對有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）的搖瓶發(fā)酵條件（葡萄糖濃度、溫度、pH）進行優(yōu)化，使得最終ACT產(chǎn)量達到365 mg/L；ZHENG等[17]將哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensisM1）應(yīng)用于豆?jié){發(fā)酵，使其風味明顯改善，經(jīng)GC/MS分析2,3-丁二醇與ACT豐度顯著增加；SUN等[12]采用輔因子工程提高了粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensH32）的ACT產(chǎn)量，結(jié)合補料分批發(fā)酵使ACT產(chǎn)量達到75.2 g/L；LIU等[18]將NADH/NAD+再生系統(tǒng)引入多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxaCJX518），從而調(diào)節(jié)ACT和2,3-丁二醇之間的分布，使ACT最大產(chǎn)量為57.20 g/L。近年來對ACT的研究更多集中于天然高產(chǎn)ACT菌株的選育、代謝通路改造與工程菌的構(gòu)建。本研究以濃香型大曲為菌株來源，以四川某酒廠大曲為樣品，經(jīng)肌酸比色法獲得高產(chǎn)ACT的菌株，為天然高產(chǎn)ACT的微生物添加新菌株，并利用單因素法和響應(yīng)面法對其產(chǎn)ACT的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，確定了菌株發(fā)酵生產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

大曲樣品取自四川某酒廠。

葡萄糖、酵母粉、瓊脂、蛋白胨、七水硫酸鎂，上海生工生物工程股份有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、二水氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸銨，成都市科隆化學品有限公司；肌酸，上海麥克林生化科技有限公司；1-萘酚，天津市光復(fù)精細化學試劑研究所。

液體富集培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%、酒醅浸提液，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

分離、純化培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%、瓊脂1.50%，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母粉0.50%、氯化鈉0.05%，pH 6.0，121 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8%、蛋白胨1%、酵母粉1%、氯化鈉0.05%、七水硫酸鎂0.03%、二水氯化鈣0.10%、磷酸二氫鉀0.03%、硫酸銨0.03%，pH 6.0，在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-l201生化培養(yǎng)箱，美國Fisher Scientific公司；ST2100 pH計，奧豪斯儀器（常州）有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計，上海美譜達有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；ZWYR-D240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；LYNX 6000高速冷凍離心機，美國Thermo公司；XSP-C生物顯微鏡，北京瑞宏誠科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)ACT芽孢桿菌的篩選

1.3.1.1 芽孢桿菌菌株的分離篩選

樣品處理：稱取大曲1 g，放入盛有99 mL無菌水且含有無菌玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩使大曲分散均勻，制備樣品懸浮液。懸浮液在85 ℃水浴加熱10 min，淘汰非芽孢細菌，再吸取1 mL懸浮液于富集培養(yǎng)基中，過夜富集培養(yǎng)。

分離純化：在超凈工作臺中將富集液梯度稀釋成10-3～10-8的菌液，吸取0.2 mL菌液滴于分離培養(yǎng)基平板中央，用涂布棒將菌懸液在培養(yǎng)基上涂抹均勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h。根據(jù)芽孢桿菌菌落形態(tài)特征，選取菌落形態(tài)不一致的菌落，用無菌接種環(huán)分別于分離培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長出單個菌落，再挑選單菌落進行不斷純化培養(yǎng)。

1.3.1.2 高產(chǎn)ACT菌株的篩選

初篩：采用肌酸顯色法來篩選能合成ACT的菌株。方法為將1 g 1-萘酚，0.1 g肌酸與4 g NaOH配成100 mL肌酸混合液，將從大曲中篩選得到的芽孢桿菌菌株，輕刮一環(huán)菌于盛有1 mL混合液的試管中，能產(chǎn)ACT的菌株能使混合液快速變?yōu)榧t色。

復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，再以5%的接種量接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后12000 r/min離心2 min，取上清液，以比色法測定發(fā)酵液的OD522nm值，從而獲得ACT產(chǎn)量較高的菌株。將50%甘油與菌液按1:1混合均勻，-70 ℃保藏。

1.3.2 菌株生長曲線的繪制

挑取一環(huán)新鮮的斜面菌種，接入50 mL種子培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12 h，以5%接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)22 h，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h時取出對應(yīng)三角瓶，測定OD600nm值，每組試驗3個平行。

1.3.3 目的菌株的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學觀察及理化鑒定

細菌的生理生化鑒定實驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，對該菌株進行革蘭氏染色、芽孢有無運動性、酪蛋白水解、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、甲基紅試驗等生理生化鑒定，細菌大小利用電子顯微鏡觀察。

1.3.3.2 菌株的耐受性研究

菌株對酸度的耐受性：將種子液以5%接種量轉(zhuǎn)接到pH分別為3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測定OD600nm，每組試驗3個平行。

菌株對乙醇的耐受性：將種子液以5%接種量轉(zhuǎn)接到乙醇含量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測定OD600nm，每組試驗3個平行。

1.3.3.3 16S rRNA序列分析測定

細菌染色體提取方法用改良CTAB法[19]。以提取的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F：AGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTG TTACGACTTPCR，擴增16S rRNA基因。反應(yīng)體系：10×Taq buffer 5 μL，dNTP（Mix）2 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各2 μL，雙蒸水補至總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序后，將測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫的BLAST比對獲得鑒定結(jié)果，并利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 高產(chǎn)ACT菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速和溫度等因素[13,16]影響著菌體的生長和代謝，因此選取pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、溫度（31、34、37、40、43 ℃）、接種量（3%、5%、7%、9%、11%）、轉(zhuǎn)速（120、150、180、210、240 r/min）、裝液量（30、40、50、60、70 mL/250 mL）等5個因素做單因素試驗，每組試驗3個平行。

1.3.4.2 正交試驗

設(shè)計L18(73)正交試驗，考察不同因素對ACT產(chǎn)量影響的大小。對pH、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量和接種量5個因素進行考察，每個考察因3個水平進行試驗，每組試驗3個平行。

1.3.4.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

用軟件Design Expert 8.0.6進行Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計響應(yīng)面試驗，以pH，溫度，裝液量作為變量，以ACT產(chǎn)量為響應(yīng)值，進行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，每組試驗3個平行。

1.3.5 檢測方法

1.3.5.1 ACT的標準曲線制作

分別配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L ACT標準溶液。分別吸取0.1 mL不同濃度的標準溶液于試管中，加入4.5 mL肌酸混合液，振蕩混勻，在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，測定OD522nm值。每個濃度3個平行實驗，并準備一個作為空白對照。

1.3.5.2 發(fā)酵液中ACT含量的測定

吸取1 mL發(fā)酵液于離心管中，4 ℃、12000 r/min離心2 min，上清液適當稀釋后，取0.1 mL于試管中再加入4.5 mL肌酸混合液，振蕩混勻，30 ℃下反應(yīng)30 min，測定OD522nm值，每組試驗3個平行。最后根據(jù)ACT標準曲線的公式計算出ACT產(chǎn)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，采用Origin進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選結(jié)果

2.1.1 樣品初篩

將分離純化得到的30株芽孢桿菌分別輕刮一環(huán)菌于含有1 mL肌酸混合液的試管中，能產(chǎn)ACT的菌株使混合液2 min內(nèi)迅速變?yōu)榧t色，實驗結(jié)果顯示有20株芽孢桿菌可使肌酸混合液變紅，其中有5株芽孢桿菌（A2、A9、A18、A19、A21）代謝物與肌酸混合液快速反應(yīng)且呈現(xiàn)深紅色（圖1）。但此法不能準確判斷菌株產(chǎn)ACT的能力強弱，需進一步試驗。

圖1 菌株初篩結(jié)果Fig.1 Strain screening results

2.1.2 ACT標準曲線

以ACT濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制ACT標準曲線。回歸方程為 y=5.3989x-0.0444，相關(guān)系數(shù) R2=0.9991，表明兩者之間線性關(guān)系良好。

圖2 ACT標準曲線Fig.2 Standard curve of acetoin

2.1.3 樣品復(fù)篩

對初篩獲得的5株芽孢桿菌進行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實驗，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清液，將其與肌酸混合液反應(yīng)后測吸光值，結(jié)果見表1，篩選得到一株高產(chǎn)ACT的菌株A21。

表1 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Strain rescreening results

2.2 菌株A21的生長曲線

在搖瓶培養(yǎng)的過程中，每隔2 h取樣測OD600nm值，由圖2可知，菌株A21在0～4 h為生長延滯期，菌數(shù)增長緩慢；6～12 h為對數(shù)生長期，活菌數(shù)以幾何級數(shù)快速升高；12～18 h處于穩(wěn)定生長期，菌群總數(shù)保持穩(wěn)定；18 h后開始進入衰亡期。

圖3 菌株A21生長曲線Fig.3 Growth curve of strain A21

2.3 菌株A21的耐受性特征

由圖4a可知，當pH為3.5時，OD600nm值為0.1，表明該菌株具有較強的耐酸性能，最低酸耐受pH為3.5，隨著pH的增大，OD600nm值先增大后降低，表明菌株A21生物量呈先上升后下降的趨勢，在pH 5～8時生長良好，其最適生長pH為5.0。由圖4b可知，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，OD600nm值逐漸降低，表明隨著酒精度的不斷增加，菌株A21生長逐漸受到影響，菌株A21適合在酒精度較低的條件下生長繁殖，當酒精度達到6%時，OD600nm值趨于零，表明菌株A21的生長完全受到抑制，乙醇最大耐受5%。

2.4 菌株A21的鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察

菌株A21革蘭氏染色后呈紫色（圖5a）；芽孢染色實驗表明該菌株含有芽孢（圖5b），染色后芽孢呈綠色，菌體呈紅色；由電鏡照片可知，此菌株大小，寬0.40 μm～0.80 μm，長2 μm～3.80 μm（圖5c）。由此判斷該菌株為革蘭氏陽性短桿狀芽孢桿菌。

圖4 菌株A21對酸度和乙醇的耐受性Fig.4 Acidity and ethanol tolerance of strain A21

圖5 菌株A21的形態(tài)學特征Fig.5 Morphological characteristics of strain A21

2.4.2 生理生化試驗

菌株的生理生化試驗結(jié)果見表2。菌株A21兼性厭氧，能產(chǎn)酸，有運動性，產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、明膠酶，還可使硝酸鹽還原，糖利用實驗表明菌株A21可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉，不能產(chǎn)氣，甲基紅試驗為陰性，對照細菌手冊可知菌株A21類似于解淀粉芽孢桿菌。

表2 菌株A21生理生化實驗結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of strain A21

2.4.3 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果

將測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，再利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，菌株A21與Bacillus velezensisFZB42在同一分支上（如圖6），且相對置信度為90，結(jié)合細菌形態(tài)與理化鑒定結(jié)果，確定菌株A21為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），將其命名為Bacillus velezensisDQA21。在《國際細菌命名法規(guī)》中曾一度認為解淀粉芽孢桿菌植物亞種與貝萊斯芽孢桿菌是同物異名，但近年來有研究人員[20]陸續(xù)利用全基因組比較對貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌植物亞種的分類地位進行研究，結(jié)果認定貝萊斯芽孢桿菌不是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，使其獲得在細菌命名法中的地位。

圖6 菌株A21系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果Fig.6 Results of phylogenetic tree construction of strain A21

2.5 Bacillus velezensis DQA21產(chǎn)ACT發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗發(fā)酵條件優(yōu)化

由圖7a可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5.5時ACT的產(chǎn)量達到最大值25.06 g/L，隨著pH的增加產(chǎn)量快速下降。外界pH的變化會改變菌體細胞內(nèi)的pH值，從而影響細菌的代謝反應(yīng)，進而影響細胞的生物量[20]。B.velezensisDQA21在pH 5～7范圍內(nèi)生長良好，且在酸性條件下，ACT合成途徑中關(guān)鍵酶α-乙酰乳酸合成酶活力較強[22]，能積累大量丙酮酸，乳酸脫氫酶活力較低[23]，催化較少的丙酮酸形成乳酸，從而相對多的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為ACT。ZHANG[24]釆取了分段控制pH的策略，發(fā)酵前48 h，pH控制在6.5，此時乙偶姻還原酶、2,3-丁二醇脫氫酶催化反應(yīng)向生成ACT和2,3-丁二醇的方向進行；郝飛[21]在發(fā)酵前期(0～16 h)控制pH 5.5，發(fā)酵中后期(16～72 h)控制pH 4.5，證明酸性條件下更有利于細胞合成ACT。

圖7 B.velezensis DQA21發(fā)酵產(chǎn)ACT的單因素實驗結(jié)果Fig.7 Single-factor experimental results of ACT production by B.velezensis DQA21

由圖7b可知，當發(fā)酵溫度從31 ℃升至37 ℃時ACT產(chǎn)量隨之增加，37 ℃時ACT的產(chǎn)量達到最大值，可能是由于B.velezensisDQA21在37 ℃時最適合其生長繁殖且其關(guān)鍵酶活性亦隨之提高。隨后ACT產(chǎn)量又隨溫度升高而降低，推測高溫下B.velezensisDQA21代謝酶受到抑制，同時ACT在高溫下會與氨反應(yīng)生成四甲基吡嗪,造成ACT濃度下降[25]。由圖7c可知，ACT產(chǎn)量隨菌株接種量的增大而增加，在5%時達到最大，隨后有所下降，這是由于接種量過大引起發(fā)酵初期比較高的細胞濃度，進而底物大量消耗，造成產(chǎn)物合成階段營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足。由圖7d可知，ACT產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而增大，當轉(zhuǎn)速為210 r/min時ACT產(chǎn)量達到最大值，隨后開始下降。ACT的積累需要大量氧氣，低轉(zhuǎn)速條件下溶氧較低不利于菌體生長繁殖，但轉(zhuǎn)速過高產(chǎn)生的剪切力會加速菌體衰亡，同時可能會導致副產(chǎn)物2,3-丁二醇、四甲基吡嗪會加速生成[26]。由圖7e可知，ACT產(chǎn)量隨裝液量增加而增大，當裝液量為50 mL/250 mL時ACT產(chǎn)量達到最大值，隨后開始下降，這是由于裝液量也與溶氧有關(guān)，裝液量過少時，溶氧雖然增加，但發(fā)酵后期營養(yǎng)不足，不利于ACT積累。

2.5.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗考察各因素對B.velezensisDQA21的ACT產(chǎn)量影響的大小。正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3，由極差分析可知，各因素對ACT產(chǎn)量的影響大小依次為pH＞溫度＞裝液量＞接種量＞轉(zhuǎn)速。選取對ACT產(chǎn)量影響前3的因素進行響應(yīng)面試驗，其余各因素選取最優(yōu)值進行實驗，轉(zhuǎn)速210 r/min，接種量5%。正交試驗方差分析結(jié)果見表4，pH和溫度p＜0.01，裝液量p＜0.05，接種量和轉(zhuǎn)速p＞0.05，說明pH和溫度對ACT產(chǎn)量具有極顯著影響，裝液量對ACT產(chǎn)量具有顯著性影響，接種量和轉(zhuǎn)速對ACT產(chǎn)量無顯著性影響。

表3 正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 正交試驗方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal test

2.5.3 Box-Behnken實驗結(jié)果與分析

2.5.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)正交試驗結(jié)果，對pH、溫度、裝液量做3因素3水平共17個試驗（5個中心點）的響應(yīng)面分析試驗，設(shè)計方案及結(jié)果見表5。經(jīng)多元二次回歸擬合后，建立了ACT發(fā)酵條件優(yōu)化模型，回歸方程為：Y=25.42-0.72A+0.40B-0.38C-0.33AB+0.23AC+0.17BC-5.57A2-2.07B2-2.02C2。

由回歸模型方差分析（表6）可知，模型p＜0.01，達到極顯著水平，說明模型的預(yù)測值與實際值非常吻合。失擬項p為0.32＞0.05，失擬項差異不顯著，證明模型與實驗擬合程度較好，具有統(tǒng)計學意義。模型中一次項A、B、C對ACT產(chǎn)量的影響極顯著，一次項影響因子的主次順序為pH＞溫度＞裝液量，這與正交試驗的結(jié)果吻合。二次項A2、B2、C2對ACT產(chǎn)量的影響極顯著。交互項AB對ACT產(chǎn)量的影響極顯著，AC對ACT產(chǎn)量影響顯著，BC對ACT產(chǎn)量影響不顯著。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test

表6 回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance (ANOVA) for response surface model

2.5.3.2 各因子交互作用對ACT產(chǎn)量影響的分析

響應(yīng)面圖可以直觀的反映出試驗因素對ACT產(chǎn)量的影響，響應(yīng)面坡度越陡峭，說明響應(yīng)面值對操作條件的改變越敏感。溫度和pH（圖8a）、裝液量和pH（8b）交互作用的響應(yīng)曲面坡度均較為陡峭且等高線密集，呈橢圓形，表明交互作用顯著；裝液量和溫度（圖8c）交互作用的響應(yīng)曲面坡度均較為平緩，等高線稀疏，接近圓形，表明交互作用不顯著，該結(jié)果與表6方差分析結(jié)果一致。

2.5.3.3 最優(yōu)實驗條件ACT產(chǎn)量及驗證

通過對回歸方程模型的分析，B.velezensisDQA21產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件為：pH 5.46，溫度37.3 ℃，裝液量49.2 mL，此時ACT產(chǎn)量預(yù)測值為25.45 g/L。在此條件下，重復(fù)5次搖瓶發(fā)酵實驗，得到ACT平均產(chǎn)量為25.60±0.33 g/L，該結(jié)果與預(yù)測值十分接近，證明試驗得到的模型可以較好的預(yù)測B.velezensisDQA21發(fā)酵后ACT產(chǎn)量。

圖7 響應(yīng)面分析因素間交互作用對ACT產(chǎn)量的影響Fig.7 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on ACT yield

3 討論

3.1 本研究從濃香型大曲中分離出30株芽孢桿菌，通過肌酸比色法快速判斷出其中20株菌株可產(chǎn)ACT，有5株產(chǎn)ACT能力較強，將這5株菌搖瓶發(fā)酵后測吸光值，利用ACT標準曲線計算出ACT產(chǎn)量，得到一株高產(chǎn)ACT的菌株A21。經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定，A21為一株貝萊斯芽孢桿菌，其pH耐受范圍為3.5～9、乙醇最大耐受值為5%。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了正交試驗，由極差分析可知，各因素對ACT產(chǎn)量的影響大小依次為pH＞溫度＞裝液量＞接種量＞轉(zhuǎn)速。對前3因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，由方差分析可知：pH、溫度、裝液量對ACT產(chǎn)量的影響極顯著。B.velezensisDQA21產(chǎn)ACT的最佳發(fā)酵條件為：pH 5.46，溫度37.3 ℃，裝液量49.2 mL，轉(zhuǎn)速210 r/min，接種量5%，此時ACT產(chǎn)量為25.60 g/L，比優(yōu)化前菌株產(chǎn)率18.37 g/L提高了39.13%。

3.2 趙洪源[13]利用氣相色譜法從涼州熏醋中篩選出一株高產(chǎn)ACT的醋酸桿菌，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度31.31 ℃、接種量8.27%、pH 6.55、搖床轉(zhuǎn)速209 r/min，最適條件下ACT達到19.04 g/L，比原始發(fā)酵產(chǎn)量高35.80%；郝飛[23]通過兩階段控制pH：發(fā)酵前期（0～16 h），控制pH 5.5，發(fā)酵中后期（16～72 h），控制pH 4.5，使菌株合成ACT的能力得到進一步提高，ACT的產(chǎn)量為32.70 g/L。本研究所得貝萊斯芽孢桿菌的發(fā)酵條件與他們有明顯差異，證明不同來源的菌株發(fā)酵水平不同。劉延波[27]、王志山[28]從大曲中分離篩選出的貝萊斯芽孢桿菌具有高產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的特征；楊斌[29]從大曲中獲得一株具有高發(fā)酵力的貝萊斯芽孢桿菌，但都未對貝萊斯芽孢桿菌的其余特性進一步探究?，F(xiàn)有產(chǎn)ACT芽孢桿菌的研究多為枯草芽孢桿菌[30]、解淀粉芽孢桿菌[31]，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)ACT的報道較少，且多應(yīng)用于生物防治[32]，未見對大曲中高產(chǎn)ACT貝萊斯芽孢桿菌菌株的報道。

3.3 由于B.velezensisDQA21來源于大曲，對溫度有較大的耐受性，且在耐酸、耐乙醇等方面表現(xiàn)出較好的特性，非常利于后期通過代謝工程的手段，使其ACT產(chǎn)量大幅提升，為ACT微生物合成的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。B.velezensisDQA21可作為強化曲[33]投入發(fā)酵，也可制成窖泥養(yǎng)護液，使其定植于窖泥中，改善窖泥風味，對提高濃香型大曲酒的風味具有潛在價值，同時ACT作為健康功能因子四甲基吡嗪的前體物質(zhì)，也表明該功能菌株在健康營養(yǎng)白酒生產(chǎn)中有非常重要的應(yīng)用前景[34]。本研究主要采用搖瓶發(fā)酵的方法，很多因素（如pH、溶氧、補糖等）難以在發(fā)酵過程中進行有效控制，不能充分發(fā)掘該菌發(fā)酵生產(chǎn)ACT的潛力，對于該菌廉價原料的尋找、ACT發(fā)酵規(guī)模的放大及相關(guān)酶學性質(zhì)，也待進一步研究。