何健澤，陳俊輝，姜雪亞，魏東

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

蝦青素（Astaxanthin），化學名稱3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β’β-胡蘿卜素，是一種脂溶性紫紅色的類胡蘿卜素，普遍存在于多種微生物和蝦蟹等海洋生物中[1]。蝦青素獨特的結構使其具有超強的抗氧化性，是β-胡蘿卜素的10倍，維生素E的500倍，可延緩皮膚衰老、提高機體免疫力，在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)具有廣闊市場前景和應用價值[2,3]。微生物發(fā)酵法是天然蝦青素生產的重要生產方式，常用的微生物有紅發(fā)夫酵母、雨生紅球藻等，但紅發(fā)夫酵母生產的蝦青素為全反構型，主要作為三文魚類等的餌料著色劑[4]。目前天然蝦青素工業(yè)生產的藻種主要是利用雨生紅球藻進行的，但是培養(yǎng)過程中細胞密度低、培養(yǎng)時間長、易污染，并且需要高光照等誘導脅迫條件，這制約了天然蝦青素的生產[5,6]。

佐夫色綠藻（Chromochloris zofingiensis）是一種淡水單細胞圓形綠藻，直徑范圍為2～15 μm，通過產生孢子細胞進行繁殖[5]。佐夫色綠藻能夠進行自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)的多營養(yǎng)方式生長，積累多種高價值代謝產物，并且可以在現(xiàn)有微生物發(fā)酵裝置中進行高密度培養(yǎng)。因此，目前色綠藻被認為是大規(guī)模生產蝦青素的潛在替代藻種，相對于雨生紅球藻，佐夫色綠藻具有生長速率快、細胞產率高、不易污染、細胞壁易破碎從而易于提取蝦青素等優(yōu)勢，有望進一步降低天然蝦青素的生產成本[7]。

佐夫色綠藻雖然具有諸多優(yōu)點，但現(xiàn)階段胞內蝦青素含量仍達不到雨生紅球藻的積累水平。如何顯著提高佐夫色綠藻胞內蝦青素的生產水平，就成為當前研究的難點和技術瓶頸。近年來研究表明佐夫色綠藻在特定誘導條件（包括高光誘導、過氧化氫和乙醇等氧化誘導[5,8]）的作用下可以顯著提高胞內蝦青素含量。這主要是由于在這些誘導方式下，藻細胞內氧化壓力增強，誘導產生的活性氧（ROS）和自由基與蛋白質、脂質和DNA等發(fā)生反應，對細胞造成氧化損傷，而藻細胞則會誘導合成蝦青素等抗氧化物質來消除ROS和自由基，以保護細胞免受損傷以抵抗逆境[9]。因此，通過不同誘導脅迫條件來提高細胞ROS水平，就可以間接提高佐夫色綠藻生產積累蝦青素的水平[10]。目前文獻中報道的佐夫色綠藻培養(yǎng)的最高生物量可以達到98.40 g/L，蝦青素產量最高為73.30 mg/L[11]，基本達到雨生紅球藻的生產效率，但是蝦青素含量還較低。因此，進行多誘導條件和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進一步提高蝦青素含量，將有助于推動利用佐夫色綠藻商業(yè)化生產制備蝦青素的進程，因而具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。

本研究以佐夫色綠藻為研究對象，采用葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源進行混合培養(yǎng)，研究了混養(yǎng)條件下混合碳源和過氧化氫誘導劑對佐夫色綠藻生長和蝦青素積累的影響，從中獲得最佳培養(yǎng)條件，并在5 L光發(fā)酵罐中進行了放大驗證和發(fā)酵工藝優(yōu)化，為佐夫色綠藻商業(yè)化生產天然蝦青素提供了實驗基礎。本研究強化了佐夫色綠藻積累蝦青素能力并且驗證了利用光發(fā)酵罐培養(yǎng)色綠藻生產蝦青素的可行性，為佐夫色綠藻生產制備天然蝦青素提供關鍵技術和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種與培養(yǎng)基

佐夫色綠藻（Chromochloris zofingiensisATCC 30412）購自美國American Type Culture Collection（ATCC）菌種保藏中心，采用Bristol’s medium（BM）培養(yǎng)基進行藻種的保藏和培養(yǎng)[12]。

1.2 實驗試劑及儀器

本研究所采用的主要試劑有過氧化氫、乙醇、硫酸亞鐵、甲醇、二氯甲烷、葡萄糖、硝酸鈉以及培養(yǎng)基所需微量元素等均為分析純，購自本地試劑公司。本研究主要儀器有高效液相分析儀（P680）購自美國DIONEX公司；液相色譜柱YMC carotenoid column C30購自美國Waters公司；流式細胞儀（Accuri C6）購自美國BD公司；pH計（SevenEasy）購自Mettler Toledo；生物傳感分析儀（SBA-40D）購自山東省科學院；高速冷凍離心機（Alledra 25R）購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藻種活化與種子液制備

從斜面培養(yǎng)基上挑取藻種，接種到裝有100 mL BM培養(yǎng)基（外加10 g/L葡萄糖）的250 mL三角瓶中，初始pH為6.50，在光照強度為10 μmol/m2·s，溫度為26 ℃，轉速為150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)4～5 d進行活化。將培養(yǎng)好的藻液以10%的接種量接種到含有上述相同營養(yǎng)成分培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)4 d，作為一級種子液。然后，再按10%的接種量轉接到裝有改良BM培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中（裝液量100 mL），其中改良培養(yǎng)基中初始葡萄糖30 g/L，硝酸鈉作為氮源，控制碳氮比為34，初始pH為6.50。在相同培養(yǎng)條件下將藻細胞培養(yǎng)到對數(shù)期末期或穩(wěn)定期初期，作為二級種子液用于后續(xù)實驗。

1.3.2 混合碳源優(yōu)化

采用不同混合碳源的無氮BM培養(yǎng)基進行佐夫色綠藻的搖瓶培養(yǎng)，研究不同混合碳源組合對細胞生長和蝦青素積累的影響?；诒緦嶒炇仪捌谘芯拷Y果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度為20～30 g/L對于佐夫色綠藻生長性能和蝦青素積累具有較好的促進效果，并且培養(yǎng)結束后，20 g/L葡萄糖能夠消耗完，不會造成浪費[13]。而且1.50～3.00 g/L醋酸鈉有助于提高蝦青素產量，其中醋酸鈉濃度為2.50 g/L時蝦青素產量最高[14]。本實驗為了探究以葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源取代單一碳源的可行性及其效果，故選擇五種不同的混合碳源條件進行佐夫色綠藻的培養(yǎng)，具體條件分別為：只加20 g/L的葡萄糖（Glu）；只加2.50 g/L的醋酸鈉（NaAC）；同時加20 g/L的Glu和1.50 g/L的NaAC；同時加20 g/L的Glu和2.50 g/L的NaAC；同時加20 g/L的Glu和3.00 g/L的NaAC。醋酸鈉通過配置母液過濾除菌后加入。本實驗在恒溫搖瓶中培養(yǎng)，溫度為26 ℃，轉速為150 r/min，光照為130 μmol/m2·s，培養(yǎng)10 d，以蝦青素產量和產率為最優(yōu)評價指標。

1.3.3 過氧化氫濃度優(yōu)化

以無氮的BM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，初始葡萄糖濃度為20 g/L，醋酸鈉為2.50 g/L，設置不同的過氧化氫濃度梯度0、77.50、107.50、137.50 mg/L，并加入18 μmol/L硫酸亞鐵，研究過氧化氫誘導脅迫對佐夫色綠藻細胞生長和蝦青素積累的影響，以蝦青素產量和產率為最優(yōu)評價指標。培養(yǎng)過程中監(jiān)測葡萄糖濃度變化，降至0～5 g/L時進行補料，補至20 g/L。其它培養(yǎng)條件同1.3.2。

1.3.4 光發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化

在5 L光發(fā)酵罐中，設置三種不同發(fā)酵工藝：恒定高光強、低光強-高光強、低光強-高光強-補加過氧化氫，研究不同發(fā)酵工藝對佐夫色綠藻細胞生長和蝦青素積累的影響，以蝦青素產量和產率為最優(yōu)評價指標。具體工藝參數(shù)如下：(1)采用外置光源，通過調節(jié)電流控制光照強度，調節(jié)電流至最大從而將光照強度提高為653 μmol/m2·s，并維持恒定高光強；(2)光照強度采用逐漸提高光強的方式進行調節(jié)，培養(yǎng)過程中從169 μmol/m2·s不斷增加到653 μmol/m2·s；(3)光照強度采用先低光后高光的方式進行調節(jié)，從312 μmol/m2·s不斷增加到653 μmol/m2·s，培養(yǎng)至72 h進行過氧化氫補料，補料濃度為107.50 mg/L過氧化氫和18 μmol/L的硫酸亞鐵。培養(yǎng)基采用無氮的BM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加20 g/L葡萄糖和2.50 g/L醋酸鈉。培養(yǎng)過程pH設置范圍6.50～8.50，溫度設置范圍為26 ℃～28 ℃，通氣量為3.33 L/min，轉速為150 r/min。培養(yǎng)期間采用0.10 mol/L鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)pH，溫度通過冷卻循環(huán)泵控制。

1.4 分析測試

1.4.1 生物量

生物量濃度采取干重法進行測定。吸取一定體積藻液置于事先烘干稱重的2 mL離心管中，并將其置于8000 r/min的條件下離心3 min，棄上清，獲得藻泥，并用蒸餾水進行洗滌。重復三次后將離心得到的藻泥置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，最后通過計算前后重量的差值獲得生物量。

1.4.2 比生長速率

通過生物量計算佐夫色綠藻的比生長速率μ（d-1），比生長速率的計算公式為：

其中X2、X1分別為t2、t1時間測定的生物量（g/L）。

1.4.3 細胞密度

細胞密度采用美國貝克曼CytoFLEX型流式細胞儀進行測定。首先將藻液離心獲得藻泥，然后用超純水洗滌多次，稀釋到約1×106CFU/mL的細胞密度后進行流式細胞儀測定，控制流式細胞儀的流速為35 μL/min，記錄時間為30 s，記錄10000個以上的細胞數(shù)據，并使用CytExpert 1.2軟件分析細胞密度。

1.4.4 葡萄糖濃度

利用SBA-40D生物傳感分析儀測定培養(yǎng)基內葡萄糖濃度。首先將待測樣品上清液過濾并稀釋至葡萄糖濃度在0.50～1.00 g/L的可測范圍內進行傳感儀測定，測定前先用1.00 g/L的葡萄糖標準品定標，待定標通過后，吸取25 μL稀釋后樣品進行測定，將測定獲得的讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即得培養(yǎng)基的葡萄糖濃度。

1.4.5 細胞內色素含量

佐夫色綠藻細胞內色素提取和成分測定參照相關文獻[15]。將離心收集的藻泥采用冷凍干燥機凍干成藻粉，準確稱量10 mg藻粉，置于裝有陶瓷珠的振蕩管中，采用甲醇/二氯甲烷混合液（體積比3:1，含有0.10%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）作為提取試劑，采用高頻振蕩儀進行破碎提取，反復操作直至藻細胞變成無色，合并收集的所有上清液并利用氮氣吹干。然后用甲醇/MTBE混合溶劑（1:1，V/V）定容，過濾并轉移至棕色瓶用于高效液相色譜分析。以上操作全程需注意避光。佐夫色綠藻細胞內色素提取和成分測定參照相關文獻[16]，依據上述HPLC的測定條件進行樣品測定。

HPLC測定具體步驟如下：采用YMC C30類胡蘿卜素色譜柱和PDA檢測器，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min，流動相分別為甲醇（A）及MTBE（B），進行梯度洗脫，檢測波長為480 nm、645 nm和665 nm，并在300～800 nm下進行全波長掃描以測定光譜。稱取色素標準品蝦青素、葉黃素、角黃素、葉綠素b、葉綠素a并分別制成一系列不同濃度梯度的標準溶液，按照上述同樣方法進行測定，建立相應的色素標準曲線，最后依據色素標準品的保留時間和標準曲線進行樣品中色素的定性和定量分析。

1.4.6 得率測定

生物量得率（Yg/gsubstrate）或蝦青素得率（Ymg/gsubstrate）是指每消耗單位濃度（g/L)葡萄糖（或醋酸鈉）對應生物量的增長量(g/L)或蝦青素產量的增長量（mg/L），計算公式為：

其中y1、y2為培養(yǎng)起始和結束時測得的生物量（g/L)或蝦青素產量（mg/L），c1、c2為培養(yǎng)起始和結束時測得的葡萄糖（或醋酸鈉）的濃度（g/L）。

1.4.7 數(shù)據分析

采用Microcal Origin 9.0和SPSS統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 混合碳源對佐夫色綠藻積累蝦青素的影響

本實驗研究不同混合碳源對佐夫色綠藻細胞生長和蝦青素積累的影響。由圖1可知，在葡萄糖和混合碳源的實驗組中，培養(yǎng)前兩天，葡萄糖消耗速率較快，生物量增長也最快，但是培養(yǎng)到第四天時，葡萄糖消耗和細胞生物量增加值均下降。之后，雖然葡萄糖濃度不斷降低，但是藻細胞生物量增加緩慢。培養(yǎng)結束后，采用混合碳源培養(yǎng)的藻細胞生物量高于單一碳源。其中，采用20 g/L葡萄糖與2.50 g/L的醋酸鈉作為碳源，獲得的生物量濃度最高為6.50 g/L，是單一葡萄糖生物量濃度的1.47倍，是單一醋酸鈉碳源生物量濃度的2.00倍。這說明添加醋酸鈉有助于佐夫色綠藻同化葡萄糖，進而促進藻細胞生長和繁殖。Helder等人[17]研究在BBM培養(yǎng)基中同時加入醋酸鈉和葡萄糖各 7.50 g/L作為混合碳源進行Neochloris oleoabundans培養(yǎng)，獲得了最高1.75 g/L的生物量，結果優(yōu)于單一碳源，與本研究結果類似。這表明適宜濃度的混合碳源有利于微藻生物量的積累。

圖1 不同碳源培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻生物量(Biomass)和葡萄糖(Glucose)濃度的變化曲線Fig.1 Time courses of C.zofingiensis biomass and glucose concentration in the cultures with different carbon sources

圖2 不同碳源培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻的色素含量(a)及各色素所占總色素百分比(b)的變化情況Fig.2 Pigment contents (a) and abundances (b) as percentages of the total pigments in C.zofingiensis in the cultures with different carbon sources

但是，當混合碳源中醋酸鈉濃度增加到3.00 g/L時，生物量濃度呈現(xiàn)下降趨勢，在培養(yǎng)結束即第十天時，生物量為5.27 g/L、葡萄糖消耗速率為0.72 g/(L·d)，均顯著低于醋酸鈉為1.50 g/L和2.50 g/L的實驗組。起始醋酸鈉濃度為3.00 g/L的實驗組，在培養(yǎng)起始第0～2 d時，葡萄糖消耗速率就較低，這表明過高濃度的醋酸鈉會一定程度上抑制細胞對葡萄糖的消耗能力，進而抑制藻細胞的生長。莊惠如等人[18]研究發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻隨著醋酸鈉濃度的增加，細胞生物量先增加后減少，在0.50～1.00 g/L的低濃度的醋酸鈉條件下有利于雨生紅球藻的生長，使得雨生紅球藻迅速進入指數(shù)生長期，并延長生長期，在1.00 g/L的醋酸鈉條件下最高生物量干重約為0.70 g/L。1.50～2.00 g/L的高濃度醋酸鈉則會抑制其細胞生長，且初始醋酸鈉濃度過高導致延滯期增長，并對細胞產生毒害作用。由此得出，在混合碳源條件下，添加醋酸鈉有利于藻細胞的生長，但醋酸鈉濃度不宜高于2.50 g/L，否則會抑制藻細胞生長。

混合碳源對佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖2所示。由圖2a可知，采用葡萄糖或醋酸鈉作為單一碳源時，獲得的蝦青素含量最高，達到3.51 mg/g以上，兩者無顯著性差異，但均顯著高于混合碳源實驗組（p＜0.05）。在混合碳源實驗組，隨著醋酸鈉的濃度的增加，蝦青素的含量也隨之增加，最高為2.78 mg/g，蝦青素占總類胡蘿卜素的含量達到70%以上?；旌咸荚磁囵B(yǎng)中蝦青素含量較低，推測其原因可能是由于培養(yǎng)過程中，藻細胞內同時存在多種碳源代謝途徑，從而合成不同的目標代謝產物，進而影響到蝦青素的積累。在佐夫色綠藻培養(yǎng)中，藻細胞生長和蝦青素積累并不是同步的[19]，僅提高藻細胞內蝦青素含量或藻的生物量，并不會顯著提高蝦青素生產水平。

在本研究中，采用混合碳源有助于藻細胞同化葡萄糖，如表1所示，葡萄糖平均消耗速率均在0.72 g/(L·d)以上，顯著高于單獨采用葡萄糖作為碳源的對照組（p＜0.05）。雖然混合碳源在一定程度上降低了蝦青素的含量，但是當醋酸鈉濃度為2.50 g/L時，藻細胞密度較高，生物量相對于碳源的得率也最高達到0.51 g/g葡萄糖，最終獲得的蝦青素產量和產率也最高，分別達到16.98 mg/L和1.06 mg/(L·d)，顯著高于其他實驗組。但是，蝦青素得率為2.23 mg/g，稍低于單獨葡萄糖培養(yǎng)的對照組。由此可知，采用混合碳源有助于提高佐夫色綠藻蝦青素產量和產率。Wang等人[20]研究也發(fā)現(xiàn)葡萄糖和乙酸鈉組合碳源，相對于單獨的葡萄糖或單獨的乙酸鈉而言，具有潛在的培養(yǎng)優(yōu)勢，能夠顯著提高Coccomyxa subellipsoidea生物量和脂質合成等生物學指標。

綜上，在無氮條件下，以葡萄糖和醋酸鈉為混合碳源有助于提高佐夫色綠藻生產積累蝦青素的能力，尤其是當葡萄糖濃度為20 g/L和醋酸鈉濃度為2.50 g/L時為最優(yōu)組合條件，可以顯著提高藻細胞生物量和蝦青素產量。

表1 不同碳源條件下佐夫色綠藻對葡萄糖消耗和蝦青素積累情況的對比Table 1 Comparisons of average glucose consumption and astaxanthin accumulation in C.zofingiensis cultures with different carbon sources

2.2 不同過氧化氫濃度對佐夫色綠藻積累蝦青素的影響

本實驗研究不同過氧化氫濃度對佐夫色綠藻細胞生長和蝦青素積累的影響。由圖3可知，添加過氧化氫不會抑制藻細胞生長及其葡萄糖的消耗利用，反而有助于藻細胞的生長。隨著過氧化氫添加量的增加，藻細胞生物量不斷增加，當過氧化氫濃度為137.50 mg/L時，生物量達到最大值22.88 g/L，相對于對照組增加了37.50%，增加較顯著（p＜0.05）。培養(yǎng)到第6 d時，培養(yǎng)基中葡萄糖基本消耗完畢，而且添加過氧化氫的實驗組中藻細胞對葡萄糖的消耗速率還會加快。Yu等人[21]對雨生紅球藻進行了過氧化氫的處理后，發(fā)現(xiàn)過氧化氫對細胞密度有聚集效應，與本研究中過氧化氫促進藻細胞生長的結果類似?？赡苁沁^氧化氫會誘導藻細胞產生氧化脅迫，但適量過氧化氫不會影響藻細胞的質膜功能及胞內代謝酶的活性，反而因為提高培養(yǎng)基中飽和氧的水平而促進藻細胞生長。

圖3 不同過氧化氫濃度下佐夫色綠藻生物量(Biomass)及葡萄糖(Glucose)消耗情況的變化曲線Fig.3 Time courses of biomass and glucose concentration in C.zofingiensis cultures with different concentrations of hydrogen peroxide

不同過氧化氫濃度對佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖4所示。由圖4a中可知，當過氧化氫濃度在0～107.50 mg/L之間時，隨著過氧化氫濃度的升高，蝦青素含量逐漸升高，且在過氧化氫濃度為107.50 mg/L，蝦青素含量最高為3.23 mg/g，顯著高于對照組（p＜0.05）。推測其原因可能是Fe2+與過氧化氫發(fā)生Haber-Weiss和Fenton反應，進而產生活性氧，對佐夫色綠藻形成一定的氧化脅迫，誘導藻細胞內的蝦青素合成以抵抗氧化損傷[22]。同時，F(xiàn)e2+也是類胡蘿卜素合成中的羥化酶和酮化酶的輔因子，從而提高酶活，促進了蝦青素的積累[23]。隨后繼續(xù)提高過氧化氫濃度至137.50 mg/L，蝦青素的含量為3.21 mg/g，與過氧化氫濃度為107.50 mg/L下的蝦青素含量（3.23 mg/g)相比并沒有顯著性增加，反而有所下降，這可能是因為過量的過氧化氫會影響蝦青素的合成，導致蝦青素積累量降低。當繼續(xù)增加過氧化氫到137.50 mg/L或更高濃度時，可能會超過藻細胞的承受程度，從而會對蝦青素合成起抑制作用，反而導致蝦青素含量下降。Ip等人[24]發(fā)現(xiàn)在不添加過氧化氫條件下，佐夫色綠藻生物量最高約為9.00 g/L，而添加0.10 mM過氧化氫時，生物量降低到約7.50 g/L，但蝦青素含量從約1.10 mg/g增加到約1.70 mg/g，之后繼續(xù)增加其濃度，生物量和蝦青素積累量均呈降低趨勢。同樣，Yu等人[21]研究雨生紅球藻在（0～1.00 mM）過氧化氫濃度下，隨著過氧化氫濃度的增加先增加后減少，在0.70 mM時達到最大，與對照組相比提高了10%，并且在1.00 mM時，蝦青素降低到對照組水平，說明適宜濃度活性氧濃度能夠促進蝦青素積累，達到飽和之后，再繼續(xù)增加過氧化氫會導致氧化損傷。由本研究可知，添加適宜濃度的過氧化氫有利于促進藻細胞生長和蝦青素積累[25]。

圖4 不同過氧化氫濃度下佐夫色綠藻色素含量（a）和各色素所占總色素百分比（b）Fig.4 Pigment contents (a) and abundances (b) as percentages of the total pigments in C.zofingiensis in the cultures with different hydrogen peroxide concentrations

不同過氧化氫濃度對佐夫色綠藻生長和蝦青素積累影響的綜合對比分析如表2所示。添加過氧化氫不會抑制藻細胞對葡萄糖的消耗，反而可以提高葡萄糖消耗速率，最高為2.80 g/(L·d)，顯著高于對照組（p＜0.05）。當過氧化氫濃度從77.50 mg/L增加到137.50 mg/L時，蝦青素產量和產率也達到最大值，分別為73.45 mg/L和4.59 mg/L/d，相較于空白組，分別提高了82.93%和82.87%，增長非常顯著（p＜0.05）。過氧化氫濃度為137.50 mg/L的條件下，生物量得率和蝦青素得率也為最大值，分別為0.45 g/g葡萄糖和2.66 mg/g葡萄糖。Ip等人[8]研究了異養(yǎng)條件下過氧化氫對佐夫色綠藻的影響，其研究結果表明過氧化氫的添加有利于蝦青素的積累，這與實驗結果相一致，但其蝦青素的產量最高為12.58 mg/L，遠低于本實驗結果。由此得出：過氧化氫的最適濃度范圍為107.50～137.50 mg/L，從蝦青素含量和生產成本方面的角度考慮，認為107.50 mg/L過氧化氫最優(yōu)。

表2 不同乙醇濃度下佐夫色綠藻對葡萄糖消耗和蝦青素積累情況的對比Table 2 Comparisons of average glucose consumption and astaxanthin accumulation in C.zofingiensis cultures with different hydrogen peroxide concentration

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化以強化佐夫色綠藻生產蝦青素性能

在前期多誘導條件優(yōu)化基礎上，本研究在5 L光發(fā)酵罐中進行佐夫色綠藻放大培養(yǎng)，進一步分析比較了恒定高光強、低光強-高光強、低光強-高光強-補加過氧化氫三種發(fā)酵工藝對佐夫色綠藻生產蝦青素的影響，從而獲得最佳發(fā)酵工藝以強化佐夫色綠藻生產蝦青素的性能。由圖5a～c可知，三種不同發(fā)酵培養(yǎng)中，溫度和pH值均處于藻細胞適宜生長的條件，但是不同光強及其變化對佐夫色綠藻細胞生長和葡萄糖消耗有直接影響。如圖5a、5d所示，在恒定高光強組，藻細胞生物量增加較慢，葡萄糖消耗速率也較低，培養(yǎng)144 h結束后，共消耗葡萄糖濃度6.30 g/L，藻細胞密度為1.15×108CFU/mL，生物量較低，僅為8.05 g/L。這說明653 μmol/(m2·s)的高光直接抑制了藻細胞生長并減緩其對葡萄糖吸收利用，這是因為高光會損傷光系統(tǒng)PSII，從而影響了細胞的生長及營養(yǎng)物質的吸收，從而抑制了細胞分裂[26]。此外，需要注意的是高光培養(yǎng)效果還與培養(yǎng)體系有直接關系，如Del Campo等人[19]在460 μmol/(m2·s)恒定光強的圓柱狀反應器中進行佐夫色綠藻培養(yǎng)10 d后，生物量從約0.30 g/L增加到7.00 g/L，生物量增加比較顯著，此時高光強并沒有抑制藻細胞生長，推測5 L發(fā)酵罐和圓柱反應器等不同培養(yǎng)體系因結構差異而對于外界光線具有不同光衰減效果，從而影響了光照培養(yǎng)效果。

而在先低光后高光實驗組（圖5b、e），藻細胞消耗葡萄糖的速率較快，在培養(yǎng)到36 h后，葡萄糖濃度就降低到6 g/L以下，之后補加到20 g/L后繼續(xù)培養(yǎng)，之后葡萄糖消耗速率略有降低，培養(yǎng)結束后共消耗葡萄糖24.70 g/L。藻細胞生長速率也較快，在0～24 h及48～60 h的時間段內細胞數(shù)有顯著增加，培養(yǎng)到72 h時生物量達到最大值16.15 g/L，之后略有降低并趨于平穩(wěn)，培養(yǎng)結束后藻細胞生物量為14.75 g/L，同恒定高光強組相比增加83.23%，有顯著的增長（p＜0.05）。Chen等人[4]在搖瓶體系中采用兩階段培養(yǎng)策略，即先在35 μmol/(m2·s)弱光培養(yǎng)4 d，然后在80 μmol/(m2·s)強光下培養(yǎng)8 d，將藻細胞生物量從3.65 g/L提高到6.75 g/L以上，增加非常顯著（p＜0.01），這與本研究結果相似，但本研究獲得的生物量更高。其中圖5b中溫度波動范圍大的原因可能是由于外置光源強度的階段式增大和發(fā)酵罐制冷系統(tǒng)響應不及時，導致培養(yǎng)24～72 h時培養(yǎng)體系的溫度出現(xiàn)波動，但是基本都維持在藻細胞適宜生長的溫度范圍25～30 ℃之內[5]，此時藻細胞生物量依然不斷增加，這說明低光是影響藻細胞生長的主要因素。當培養(yǎng)到72 h時，光強從312.06 μmol/(m2·s)顯著增加到539.46 μmol/(m2·s)，此時高光和營養(yǎng)物質缺乏等脅迫條件協(xié)同作用從而誘導藻細胞內蝦青素的積累，但會抑制藻細胞生長，因此藻細胞生長呈現(xiàn)出達到最大值后略有降低并趨于平穩(wěn)的趨勢。

在低光強-高光強-補加過氧化氫的發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗中，在培養(yǎng)前12 h采用低光培養(yǎng)促進細胞生長并縮短延滯期，在培養(yǎng)到72 h后添加誘導劑過氧化氫從而強化藻細胞內蝦青素的積累，實驗結果如圖5c、f所示。培養(yǎng)前12 h細胞生長速率較快，之后提高光強后，細胞生物量和細胞數(shù)短暫下降，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，生物量才開始逐漸增加，培養(yǎng)結束后達到11.08 g/L，但是還是顯著高于恒定高光強組。這說明前12 h低光培養(yǎng)還是有助于細胞生長，但可能時間還是太短，之后突然提高光強，產生了過多的光自由基，導致部分藻細胞損傷。培養(yǎng)前24 h的葡萄糖消耗速率較快，但之后也受到高光的抑制，培養(yǎng)結束后葡萄糖消耗量為16.10 g/L，顯著低于低光強-高光強實驗組。綜上，低光強-高光強以及低光強-高光強-補加過氧化氫的生物量濃度分別為16.15 g/L和11.08 g/L顯著高于恒定高光強（8.15 g/L）（p＜0.05），從積累生物量角度而言，低光強-高光強的培養(yǎng)方式更有利于佐夫色綠藻生長。

圖5 不同光發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中溫度、pH值、光照強度以及佐夫色綠藻生長和葡萄糖消耗情況隨培養(yǎng)時間的變化曲線Fig.5 Time courses of the changes of temperature, pH and light intensity, glucose consumption, and cell growth of C.zofingiensis grown in 5 L photo-fermenter with different culture conditions

三種不同發(fā)酵工藝對佐夫色綠藻積累蝦青素的影響如圖6所示。由圖6a可知，在恒定高光強組，蝦青素含量和產量隨著培養(yǎng)時間的增加而呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，且培養(yǎng)到108 h時達到最大值，分別為2.80 mg/g和21.50 mg/L，分別是初始蝦青素含量和產量的3.50倍和4.60倍，增加非常顯著。Del Campo等人[19]采用圓筒裝置對佐夫色綠藻在460 μmol/m2·s或者920 μmol/m2·s恒定光強下進行培養(yǎng)，其蝦青素產量最高為19.00 mg/L，低于本實驗結果。在低光強-高光強組（圖6b），前期蝦青素積累速率較慢，但培養(yǎng)至36 h之后，隨著光強的提高，蝦青素的含量和產量快速增長，推測其原因可能是葡萄糖的加入和光強增加會使得藻所在的環(huán)境處于適合藻生長和蝦青素積累的高光及高C/N的條件[5,12]。在培養(yǎng)至96 h之后蝦青素含量的增長速度降低，并在培養(yǎng)到132 h時蝦青素含量達到最大值為2.66 mg/g，之后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，可能原因是培養(yǎng)至后期，細胞密度以及體積逐漸增大、細胞之間相互遮擋等因素，從而使得有效的光照強度降低，但低光強有助于細胞生長，故蝦青素產量在培養(yǎng)至132 h時達到最大，為38.38 mg/L，相較于高光強條件下，盡管蝦青素的含量略有降低，然而蝦青素的產量提高了78.84%。Chen等人[4]同樣采用低光強-高光強的培養(yǎng)策略進行培養(yǎng)288 h后，蝦青素含量從1.80 mg/g增加到2.19 mg/g，而產量從6.58 mg/L增加到14.80 mg/L。這說明采用低光強-高光強能夠提高佐夫色綠藻積累蝦青素的能力，且在這種培養(yǎng)方式下不會顯著降低細胞內蝦青素含量。

在低光強-高光強-補加過氧化氫實驗條件下，在培養(yǎng)前期蝦青素含量雖然呈現(xiàn)不斷增加趨勢，但是增長較緩慢，與恒定高光強組的現(xiàn)象基本一致，結果如圖6c所示。而在補加過氧化氫后的72～120 h內，蝦青素含量的增加非常顯著，從2.30 mg/g增加到3.82 mg/g。這相對于高光強和低光強-高光強實驗組，分別提高了36.92%和43.60%，增加非常顯著（p＜0.05）。這說明補加過氧化氫對蝦青素的積累具有顯著的效果。此時，蝦青素產量也達到最大值41.41 mg/L，產率為11.50 mg/L/d。之后繼續(xù)培養(yǎng)，蝦青素含量和產量均呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于細胞后期耐受高光強的能力下降，從而受到光氧化損傷，從而導致細胞數(shù)和生物量干重及蝦青素含量和產量均呈下降的趨勢。此外，由低光強-高光強-補加過氧化氫實驗組的蝦青素含量和產量變化可知（圖6c），最佳的培養(yǎng)時間為120 h，此時采收可以確保獲得最大蝦青素生產效率并降低培養(yǎng)成本，相較于前兩種培養(yǎng)方式能夠獲得更高的蝦青素含量和產量。這種培養(yǎng)策略結合了低光強-高光強的模式的增加生物量濃度的優(yōu)點，又提高了佐夫色綠藻的蝦青素含量，最適宜用于佐夫色綠藻培養(yǎng)生產蝦青素。

圖6 不同光發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下佐夫色綠藻胞內蝦青素含量和產量隨培養(yǎng)時間的變化曲線Fig.6 Time courses of the content and yield of astaxanthin in C.zofingiensis grown in 5 L photo-fermenter with different culture conditions

為了綜合分析不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對佐夫色綠藻生產積累蝦青素的影響，本實驗將不同培養(yǎng)條件下的藻細胞生產指標進行對比，結果如表3所示。

表3 三種不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對佐夫色綠藻生產蝦青素性能的影響對比分析Table 3 Comparisons of the effects of three different culture conditions on astaxanthin production by C.zofingiensis

由表3可知，在低光強-高光強實驗組獲得的藻細胞平均比生長速率最高為0.13 d-1，生物量產率達到最大值，為1.39 g/(L·d)，顯著高于恒定高光實驗組。在蝦青素積累方面，采用先低光后高光培養(yǎng)條件，在蝦青素含量方面與恒定高光組無顯著差異，但是由于生物量增長顯著的原因，蝦青素產量和產率也有顯著提高。Liu等人[27]在350 μmol/(m2·s)高強光下進行C.zofingiensis的半連續(xù)培養(yǎng)，可以獲得的生物量產率為0.79 g/(L·d)，蝦青素含量和產率分別為3.40 mg/g和2.70 mg/(L·d)。相對而言，本研究采用先低光后高光的發(fā)酵工藝，在不影響蝦青素積累的前提上，可以顯著提高佐夫色綠藻生產蝦青素的能力。更進一步，采用培養(yǎng)中期補加過氧化氫的發(fā)酵培養(yǎng)，有助于提高藻細胞吸收利用葡萄糖的能力，最大消耗速率為2.68 g/(L·d)，同時可以在此基礎上顯著提高蝦青素的含量和產率。但培養(yǎng)結束后得到的藻細胞生物量得率和蝦青素得率較低，僅為0.27 g/g和1.60 mg/g，這說明過多的葡萄糖消耗并沒有被有效轉化為生物量和蝦青素，其中原因還有待深入研究?？傊?，采用低光強-高光強-補加過氧化氫的培養(yǎng)工藝最有利于佐夫色綠藻生產積累蝦青素。

目前關于佐夫色綠藻的研究報道很多，然而利用發(fā)酵罐裝置進行佐夫色綠藻培養(yǎng)積累蝦青素的大多采用異養(yǎng)發(fā)酵。Sun等人[28]采用3.70 L的發(fā)酵裝置在異養(yǎng)條件下對佐夫色綠藻培養(yǎng)了16 d，其最終獲得蝦青素產量為32.40 mg/L，低于本實驗中采用低光強-高光強-補加過氧化氫發(fā)酵模式的結果。而Liu等人[29]利用3.70 L的發(fā)酵裝置異養(yǎng)培養(yǎng)積累蝦青素，盡管其最終獲得蝦青素產量為56.10 mg/L，然而其蝦青素含量僅為1.23 mg/g，蝦青素含量低于本研究中的結果。Chen等人[4]實驗表明低光強-高光強兩步法最有利于提高佐夫色綠藻生物量和蝦青素產量，與本實驗結果一致，并且本研究在此基礎上產生加入了氧化誘導劑過氧化氫，進一步提高了蝦青素產量。Zhang等人[11]采用兩步法對佐夫色綠藻培養(yǎng)了16 d，其最高生物量濃度可達98.40 g/L，蝦青素產量為73.30 mg/L，而其蝦青素產率為5.24 mg/(L·d)，低于本研究結果。以上研究結果進一步證明了本實驗所采用于發(fā)酵罐中進行低光強-高光強-補加過氧化氫的發(fā)酵方式的科學性和優(yōu)越性。

綜上所述，采用光發(fā)酵罐的發(fā)酵模式進行佐夫色綠藻發(fā)酵培養(yǎng)具有其獨特的優(yōu)勢，同時在培養(yǎng)前期（0～72 h）采用先低光后高光的階梯式提高光強的培養(yǎng)策略有助于佐夫色綠藻細胞生長，而在培養(yǎng)中后期（72～120 h）通過添加過氧化氫進行誘導培養(yǎng)則有助于藻細胞內蝦青素的高效積累。通過這兩種培養(yǎng)策略可以使得佐夫色綠藻的蝦青素生產性能得到顯著提升，這可以為佐夫色綠藻的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化以及規(guī)模化培養(yǎng)生產蝦青素提供理論指導和參考依據，有利于推動佐夫色綠藻在天然蝦青素商業(yè)化生產中的應用。

3 結論

本研究在搖瓶和光發(fā)酵罐中初步探索不同誘導條件和發(fā)酵工藝對佐夫色綠藻胞內蝦青素積累的影響，從中可知采用葡萄糖和醋酸鈉作為混合碳源優(yōu)于單一碳源，同時添加過氧化氫進行誘導可優(yōu)化佐夫色綠藻積累蝦青素的效果。進一步在5 L光發(fā)酵罐實驗中對上述優(yōu)化條件進行驗證，從而得出低光強-高光強-補加過氧化氫的發(fā)酵工藝最利于佐夫色綠藻積累蝦青素，同時兼顧生物量和蝦青素積累量，從而獲得了最優(yōu)的蝦青素產量。本研究結果為高產蝦青素的微藻規(guī)?；P鍵培養(yǎng)技術提供了重要研究基礎。