王磊，高宗露，宗麗娜，呂田，魯茂林，王文瓊，陳大衛(wèi)，徐粉林，顧瑞霞

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州 225127）（2.維維食品飲料股份有限公司，江蘇徐州 221000）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細菌，被認為是安全（Generally Regarded as Safe，GRAS）的益生菌，在益生菌中占有重要地位[1]。歐美等一些發(fā)達國家較早對乳酸菌進行了研究，這些國家不但成立了自己的乳酸菌菌種資源庫，而且研發(fā)出了擁有自主知識產(chǎn)權的優(yōu)勢乳酸菌及其發(fā)酵制劑[2]。由于我國對乳酸菌的研究工作起步較晚，只有很少的具有自主知識產(chǎn)權的乳酸菌及其發(fā)酵劑[3]。目前，國內(nèi)學者已擴大了對乳酸菌資源的研究，并且篩選出了一些優(yōu)良的乳酸菌，這大大加快了我國乳制品行業(yè)的發(fā)展。

德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）簡稱保加利亞乳桿菌，是乳桿菌屬的模式種[4]，在發(fā)酵過程中可經(jīng)同型乳酸發(fā)酵將乳糖轉化為乳酸[5]，并且將蛋白質(zhì)降解為肽類和氨基酸[6]，為乳制品提供了獨特的質(zhì)地、風味[7]，同時賦予乳制品特殊的食療功效[8]，也提高了乳制品功能特性以及營養(yǎng)價值[9,10]。

德氏乳桿菌保加利亞亞種是工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵乳制品最主要的酸乳發(fā)酵劑菌種之一[11]，篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株具有潛在的經(jīng)濟價值，對乳酸菌資源的開發(fā)利用具有重要的戰(zhàn)略意義。本研究旨在通過對傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的德氏乳桿菌保加利亞亞種的發(fā)酵和益生特性進行研究，以期篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌菌株，為國內(nèi)酸乳發(fā)酵劑生產(chǎn)提供指導和菌種資源，

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

試驗菌株：10株德氏乳桿菌保加利亞亞種（分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，由揚州大學乳品生物技術與工程江蘇省重點實驗室提供）。

病原指示菌：大腸桿菌（Escherichia coliCICC10012）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCICC10201）、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisCICC10012)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereusCICC102311)、腸傷寒沙門氏菌(Salmonella enterotyphiWX29)、布氏假單胞菌(Pseudomonas brenneriCICC1027)，購自中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

全脂乳粉、脫脂乳粉，新西蘭乳業(yè)有限公司；白砂糖，超市購買；β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性檢測試劑盒、α-半乳糖苷酶（α-Gal）活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；藥敏試紙，杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 試驗設備

蒸汽滅菌鍋SX-500，日本TOMYG公司；超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司；高壓均質(zhì)機GYB60-08，上海東華高壓均質(zhì)機廠；電子天平PL2002，梅特勒公司；恒溫水浴鍋HH6，國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化及全脂乳的制備

1.2.1.1 菌株活化及菌懸液的制備

將菌種保藏管中的德氏乳桿菌保加利亞亞種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，轉接活化2次后，按3%的接種量接種于12%的脫脂乳培養(yǎng)基中。待凝乳后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.1.2 全脂乳的制備

將蒸餾水預熱至50 ℃，加入12%全脂乳粉混勻，待溫度上升至60 ℃時，加入質(zhì)量分數(shù)為6.5%的蔗糖溶解攪拌，使其充分混合，經(jīng)過均質(zhì)（20 MPa，循環(huán)2次）處理，接著將均質(zhì)好的全脂乳分裝于500 mL藍蓋瓶中，95 ℃殺菌15 min，最后將全脂乳急冷于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 樣品的制備

將供試菌株照1.2.1.1的方法的得到脫脂乳培養(yǎng)基，按照2%的接種量接種于全脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃水浴10 min后，立即置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，觀察其凝乳情況，并對菌株發(fā)酵過程及貯藏期間各時間點（貯藏0 d、1 d、7 d、14 d）取樣，用于后續(xù)各項發(fā)酵特性指標的測定。

1.2.3 凝乳時間的測定

表1 抗生素耐藥性的判斷標準Table 1 Criteria for judging antibiotic resistance

將活化好的菌株以2%的接菌量接種到全脂乳培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下恒溫發(fā)酵,記錄菌株發(fā)酵全脂乳至凝乳的時間。

1.2.4 滴定酸度的測定

稱取5.00 g左右酸乳樣品，記錄質(zhì)量m，用40.00 mL蒸餾水稀釋，并加酚酞指示劑，用0.1 mol/L的NaOH滴定至微紅色，并在30 s內(nèi)不變色，記錄體積V，計算樣品酸度。

1.2.5 pH的測定

用pH計測定發(fā)酵乳的pH值。

1.2.6 黏度的測定

終止發(fā)酵，調(diào)整溫度至4 ℃，采用PV-2黏度儀測定發(fā)酵乳樣品的黏度（4號轉子，30 r/min），穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.2.7 持水力的測定

在發(fā)酵及貯藏期間各時間點，準確稱取10 g發(fā)酵乳樣品，于4 ℃離心10 min，轉速為4500 r/min，傾去上清液后將離心管倒置。

1.2.8 乳酸菌產(chǎn)香能力的測定

1.2.8.1 雙乙酰含量測定

參考蔡晶晶等人方法測定[12]。按照參考的測定方法繪制雙乙酰標準曲線。然后取待測乳樣品，用16%三氯乙酸溶液等體積與其混合，混勻后靜置10 min，5500 r/min離心10 min后取上清液。取上清液10 mL，等體積加入2個試管中，向1號試管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.25 mL，2號試管不加，充分混勻后于黑暗處使其反應30 min，然后向2個試管中加入4.0 mol/L的鹽酸進行終止反應（1號試管加1.0 mL，2號試管加1.25 mL），混勻后以2號試管作為對照液，在335 nm波長測定吸光值。

1.2.8.2 乙醛含量測定

參考任然等人方法測定[4]。取1% NaHSO3溶液2 mL置于三角錐形瓶中，加入處理后試樣上清液10 mL，混勻后在室溫下放置1 h，然后加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近淡藍紫色，再用0.01 mol/L碘液滴定至淡藍紫色，并且在30 s內(nèi)淡藍紫色不褪去，以上的滴定均不計數(shù)。然后加入20 mL 1 mol/L的NaHCO3，充分振蕩混勻，使溶液藍紫色消失，最后用0.01 mol/L碘液滴定至藍紫色終點，記錄消耗標準碘液的體積，每個樣品有兩個平行，并同時做空白試驗。

其中：M：乙醛含量，mg/L；V1：滴定樣品消耗碘標準溶液體積，mL；V2：滴定空白消耗碘標準溶液體積，mL；C：碘標準溶液的濃度，mol/L；10：樣品稱樣量，mL；0.022：乙醛反應化學基本單位，g。

1.2.9 抗生素耐藥性的測定

表1為抗生素耐藥性的判斷標準。利用藥敏紙片瓊脂擴散法（K-B法）對分離的乳酸菌進行青霉素、頭孢唑啉、頭孢唑啉(先鋒)、氯霉素、萬古霉素、四環(huán)素、復方新諾明、氨芐西林、克拉霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和利福平12種抗生素的耐藥性敏感試驗。將待測菌株活化二代，將菌液10000 r/min 4 ℃，離心5 min，并以無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5，取菌液200 μL涂布，待培養(yǎng)基上的菌液略干后，以無菌操作取出藥敏紙片，貼于接好同種乳酸菌誘導的LB固體平板內(nèi)，同時設空白藥敏紙片為對照。然后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。根據(jù)美國臨床和試驗室標準化研究所制定的《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》（2017年版）評價試驗乳酸菌對抗生素的耐藥性。

1.2.10 抑菌能力的測定

將致病菌活化2代，以生理鹽水調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5，冷藏備用，無菌操作下，將滅菌LB培養(yǎng)基傾倒至平板，冷卻至培養(yǎng)基完全凝固，后將活化好的二代致病菌稀釋100倍，分別取稀釋完成的蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌、沙門氏菌及大腸桿菌100 μL注于完全凝固平板上，用涂布棒涂抹均勻，用打孔器在每個平板上均勻打孔，吸取供試菌株發(fā)酵液200 μL加入小孔中，將加樣平板正置于18 ℃培養(yǎng)箱擴散12 h，移至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.11 酶活能力的測定

1.2.1 1.1 粗酶液的制備

取10.00 mL發(fā)酵液于4 ℃條件下，采用8000 r/min離心2 min，收集菌體。用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2次，最后加入10.00 mL緩沖液，反復吹打使其重懸。冰浴中用超聲破碎儀破壁制備粗酶液，超聲脈沖功率為25 W，脈沖持續(xù)時間5 s，間隙5 s，破壁10 min。離心除去細胞碎片，所得上清液為粗酶液。

1.2.1 1.2β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性測定

β-半乳糖苷酶活性測定按試劑盒說明書方法測定。

1.2.1 1.3 乳酸脫氫酶（LDH）活性測定

乳酸脫氫酶（LDH）活性測定按試劑盒說明書方法測定。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析

其次，優(yōu)化數(shù)學史滲透方法。數(shù)學教師在數(shù)學課堂中滲透數(shù)學史時，要注意方法的選擇，從而提升滲透效果。比如，教師可以引導學生閱讀一些有關數(shù)學史的讀物，這有利于學生全面的掌握數(shù)學史的有關內(nèi)容并讓其感受到數(shù)學史的博大精深；此外，教師還可以根據(jù)學生的興趣愛好，運用學生喜歡的教學方式。比如在對數(shù)學家華羅庚進行說明時，可以選它的畫像、故事、傳記以及他的名言“聰明在于學習，天才在于積累”等內(nèi)容來有機滲透教學，豐富學生學習數(shù)學的情感，激發(fā)學生熱愛數(shù)學史的思想情操。

所有試驗重復測定三次，各項指標的數(shù)據(jù)均用Origin 2018軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。測量數(shù)據(jù)均以Mean±S.D表示，p＜0.05認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 單菌株發(fā)酵特性的研究

2.1.1 單菌株產(chǎn)酸曲線的測定

圖1為單菌株發(fā)酵酸乳的產(chǎn)酸曲線。產(chǎn)酸曲線表明菌株的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量。產(chǎn)酸快慢決定著發(fā)酵周期的長短，產(chǎn)酸能力反應菌株的發(fā)酵活力[13]。供試菌株發(fā)酵過程中，0～2 h內(nèi)pH值和酸度變化緩慢，2～16 h內(nèi)快速下降，16 h后趨于穩(wěn)定。由圖1b可知不同供試菌株發(fā)酵酸乳產(chǎn)酸速率有所不同，其中菌株KSDB-1、HDS-12、DDB-14、HDS-18發(fā)酵48 h后酸度可達到200 °T以上，具有較好的產(chǎn)酸能力。

圖1 單菌株發(fā)酵酸乳的產(chǎn)酸曲線Fig.1 Acid production curve of yoghurt fermented by single strain

2.1.2 單菌株發(fā)酵性能測試

表2 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵性能初篩Table 2 Number and fermentation time of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains

不同德氏乳桿菌保加利亞亞種的發(fā)酵時間由表2所示，發(fā)酵時間是衡量乳酸菌發(fā)酵性能的重要指標，發(fā)酵時間過長會增加其他微生物的感染率。在實際生產(chǎn)過程中，發(fā)酵時間過長還會增加生產(chǎn)成本、降低生產(chǎn)效率，嚴重影響企業(yè)的經(jīng)濟效益。10株供試菌株發(fā)酵酸乳的發(fā)酵時間在5～12.5 h之間，其中發(fā)酵時間低于8 h的菌株有8株；滴定酸度在59.65 °T～77.76 °T之間，其中菌株KSDB-1的滴定酸度最高達到了77.76 °T，顯著高于其他供試菌株（p＜0.05），具有較好的產(chǎn)酸能力。

2.1.3 單菌株產(chǎn)香性能測試

不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵酸乳產(chǎn)香能力如圖2所示。乙醛和雙乙酰是構成酸乳典型風味的重要化合物，其含量以及兩者之間的比例會對酸乳的風味產(chǎn)生較大的影響。一般認為當酸奶中乙醛含量在23 mg/L～40 mg/L時，才能產(chǎn)生具有良好風味的酸乳[14]。研究表明乙醛與雙乙酰的含量比值大于3:1時，酸乳的風味最佳[15]。10株供試菌株乙醛和雙乙酰含量比值均大于3:1。菌株HDS-13、DDB14、KSDB-1具有較好的產(chǎn)香能力較好，其中菌株HDS-13的雙乙酰含量為2.88 mg/L，乙醛含量達到了30.08 mg/L，能顯著改善酸乳的風味。

圖2 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)香性能測試Fig.2 Aroma production performance test of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains

2.2 酸乳的貯藏穩(wěn)定性

表3 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵酸乳貯藏期間酸度的變化（°T）Table 3 Changes in titration acidity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains (°T)

表4 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵酸乳貯藏期間黏度的變化（mPa·s）Table 4 Changes in viscosity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains (mPa.s)

2.2.1 單菌株發(fā)酵酸乳貯藏期間酸度的變化

不同供試菌株發(fā)酵酸乳樣品4 ℃貯藏期間酸度值的變化如表3所示，10株供試菌株發(fā)酵酸乳貯藏1 d時酸度在46.65 °T～82.76 °T之間，其中菌株KSDB-1和菌株HDS-13發(fā)酵的酸乳酸度顯著高于其他供試菌株（p＜0.05），分別為82.76 °T和70.14 °T。乳酸菌后酸化是導致酸乳貯藏期品質(zhì)變化主要原因之一，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種是導致發(fā)酵乳發(fā)生后酸化的主要菌株[16]。10株供試菌株發(fā)酵酸乳表現(xiàn)出不同程度的后酸化程度，其中菌株DDB-14和菌株HDB-17發(fā)酵的酸乳貯藏1～14 d后后酸化程度顯著高于其他菌株（p＜0.05）其余菌株后酸化能力相對弱，符合優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑具有的特點。

不同供試菌株發(fā)酵酸乳樣品4 ℃貯藏期間黏度值的變化如表4所示，黏度是評定酸乳質(zhì)量的重要指標之一，選擇產(chǎn)黏性好的菌株能夠改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)，但是黏度較大對工業(yè)化生產(chǎn)不利[17]。10株供試菌株發(fā)酵完成后黏度值在215 mPa·s到1395.67 mPa·s之間，其中菌株DDB-14和菌株KSDB-1具有較好的產(chǎn)黏能力，發(fā)酵完成時的黏度分別在1031.67 mPa·s和1305.67 mPa·s，顯著高于其它菌株（p＜0.05）。大多數(shù)菌株貯藏1 d，黏度達到峰值，貯藏7 d后黏度值開始出現(xiàn)小幅度下降。

2.2.3 單菌株發(fā)酵酸乳貯藏期間持水力的變化

不同供試菌株發(fā)酵酸乳樣品4 ℃貯藏期間持水力的變化如表5所示，持水力的強弱直接影響著發(fā)酵乳乳清的析出程度[18]。10株供試菌株發(fā)酵酸乳的持水力在35%～50%之間，貯藏1 d持水力達到峰值，貯藏14 d后出現(xiàn)不同程度的下降，這可能是因為貯藏期間發(fā)酵乳酸度的變化，造成發(fā)酵乳組織結果發(fā)生變化從而導致持水力的變化[19]。菌株DDB-14、HDB-17和KSDB-1貯藏1 d后持水力分別54.83%、50.82%和56.55%，其貯藏7 d后差異不顯著（p＜0.05），說明這些菌株發(fā)酵乳樣品貯藏期間能保持良好的組織穩(wěn)定性。

表5 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵酸乳貯藏期間持水力的變化（%）Table 5 Changes in water-holding capacity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains(%)

表6 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種對12種抗生素耐藥性的結果Table 6 Results of resistance of different Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusto 12 antibiotics

表7 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵上清液中抑菌能力的測定Table 7 Determination of bacteriostatic capacity in fermentation supernatants of different Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

2.3 乳酸菌抗生素耐藥性測定

不同德氏乳桿菌保加利亞亞種的抗生素耐藥性結果如表6所示，乳酸菌的食用歷史長達數(shù)千年，是世界公認的 “ GRAS ” 的微生物[20]。但近年來，越來越多的研究表明，對人和動物體內(nèi)具有特殊生理功能有益菌群的乳酸菌也產(chǎn)生了耐藥性[21]。10株供試菌株對頭孢唑啉、氯霉素、萬古霉素、四環(huán)素、克拉霉素、利福平均敏感，對青霉素、頭孢唑啉先鋒、氨芐西林普遍敏感，對復方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星耐藥率較高。綜合可知，10株供試菌株可以認為是比較安全的，可以作為有益的菌株進一步應用于食品工業(yè)中。

2.4 乳酸菌培養(yǎng)上清液抑菌能力測定

不同德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵上清液中抑菌能力如表7所示。在發(fā)酵過程中，乳酸菌能夠?qū)⑻寝D化為乳酸，并且有些能夠產(chǎn)生抗菌活性代謝物，如過氧化氫、細菌素等，從而抑制腐敗菌及食源性致病菌的繁殖[22]。10株供試菌株普遍對6種致病菌呈現(xiàn)不同程度的抑制能力，其中菌株HDS-13、DDB-14、HDB-1、HDS-18、KSDB-1對6種致病菌抑制能力顯著高于其他菌株（p＜0.05），說明這些供試菌株對細菌具有廣譜抑菌特性，能有效抑制腸道致病菌的生長。

2.5 相關酶活能力測定

不同德氏乳桿菌保加利亞亞種相關酶活能力如圖3所示。乳酸脫氫酶是糖代謝途徑中的關鍵酶，可以催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應，其活性大小與微生物的產(chǎn)酸能力有關[3]。由圖3a可知，10株供試乳酸脫氫酶酶活在0.12855～0.3586 U/mg之間，其中菌株HDS-12和KSDB-1乳酸脫氫酶活力顯著高于其他菌株（p＜0.05），分別為0.3586 U/mg和0.3473 U/mg。

圖3 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種相關酶活能力的測定Fig.3 Determination of related enzyme activity of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus

β-半乳糖苷酶能水解乳糖為葡萄糖和半乳糖,生產(chǎn)低乳糖食品,以緩解乳糖不耐癥，同時又具有轉半乳糖基活性,可用于低聚半乳糖的合成[23]。由圖3b可知，10株供試菌株β-半乳糖苷酶酶活在0.1320～0.7093 U/mg之間。其中菌株HDS-12，HDB-17β-半乳糖苷酶活力顯著高于其他菌株（p＜0.05），分別為0.6967 U/mg和0.7093 U/mg。

α-半乳糖苷酶又稱蜜二糖酶，屬于外切糖苷酶類，水解酶的一種，該酶在食品工業(yè)、輕化工領域有較高的應用價值，被認為是最有應用潛力的酶制劑之一，可用于生產(chǎn)能夠促進腸道益生菌增值的益生元α-低聚半乳糖[24]。由圖3b可知，10株供試α-半乳糖苷酶酶活在0.1113～1.3263 U/mg之間，其中菌株DDS-15β-半乳糖苷酶活力顯著高于其他菌株（p＜0.05），為1.3263 U/mg，未來可對其進一步研究。

3 結論

本文通過單菌株發(fā)酵特性和益生特性實驗對實驗室保存的10株德氏乳桿菌保加利亞亞種進行了分析研究，并篩選出性能較好的菌株KSDB-1。菌株KSDB-1凝乳時間為6.3 h，凝乳酸度為76.02 °T，表現(xiàn)出較好的產(chǎn)酸能力，同時黏度和持水力分別為1305.67 mPa·s和50.55%，表現(xiàn)出較好的產(chǎn)黏能力和組織穩(wěn)定性，貯藏15 d內(nèi)后酸化程度較弱，各指標相對穩(wěn)定，且具有良好的產(chǎn)香能力，對大部分抗生素表現(xiàn)為敏感，具有較高的安全性，能有效抑制腸道致病菌的生長，乳酸脫氫酶活力較高，適合對其培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵工藝進行進一步優(yōu)化，以期將其應用于工業(yè)化生產(chǎn)中。