齊明明，孫建博

（中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇南京 210009）

近年來，由血栓引起的栓塞性疾病嚴重影響著人們的生活，與其密切相關(guān)的心血管疾病已成為全世界范圍內(nèi)造成中老年人發(fā)病甚至死亡的主要原因[1,2]。在藥物治療手段中，u-PA和t-PA等抗栓藥物具有較好的療效并被廣泛使用，但是有引起系統(tǒng)性出血的副作用[3,4]，因此，從中藥中尋找一種安全、有效、療效穩(wěn)定的抗栓藥物對于治療此類疾病具有重要的意義。

地龍性寒味咸，具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管疾病作用[5]?；钚缘佚埖鞍啄z囊以從中藥地龍中提取的活性蛋白為主要原料，殼聚糖及玉米淀粉為輔料?；钚缘佚埖鞍祝‥WAP）含有纖溶酶、蚓激酶、膠原酶、核酸和微量元素在內(nèi)等多種活性成分，是一種大分子復(fù)合酶[6,7]。EWAP能夠抑制血小板聚集，促進組織型纖溶酶原激活物的分泌，以及水解凝血酶[8,9]，具有改善微循環(huán)[10]、溶栓[11-13]、降壓[14-15]及改善動脈粥樣硬化[10,16]等多種藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，EWAP在體外對兔靜脈血栓有溶解作用，對已凝固的纖維蛋白膠板也有一定纖溶活性。其纖溶作用有直接纖維蛋白溶解和激活纖溶酶原的間接作用，但以直接纖溶為主[6]。地龍蛋白的藥用價值及保健價值被逐漸開發(fā)，早在2009年被國家衛(wèi)生部認定為 “ 新資源食品 ” （見中華人民共和國衛(wèi)生部2009年第18號公告），其作為新資源食品可起到保健預(yù)防的作用。為探索活性地龍蛋白作為一種抗血栓食品的抑制血栓生成效應(yīng)，本實驗通過對小鼠的凝血、出血時間的測定，大鼠動、靜脈血栓造模，以及對凝血四項的檢測，驗證了地龍膠囊在實驗動物體內(nèi)抗凝及抑制血栓生成的藥理活性，為活性地龍蛋白的開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

活性地龍蛋白膠囊（批號：20190304），南京龍福新科技實業(yè)有限公司；阿司匹林腸溶片（批號：181003），沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司；鞣花酸活化部分凝血活酶測定試劑盒、凝血酶原測定試劑盒、凝血酶測定試劑盒、纖維蛋白原測定試劑盒，山西亞森醫(yī)療器械有限公司；羧甲基纖維素鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水合三氯乙醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；通用型組織固定液，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，奧豪斯儀器有限公司；Steellex半自動血凝儀，北京中勤世帝生物技術(shù)有限公司；超低溫冰箱，Thermo Fisher Scientific；高速冷凍離心機，Kubota Corporation；電冰箱，合肥美菱股份有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊醫(yī)療器械廠；Leica DM2500正置熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.3 實驗動物

18～22 g ICR小鼠和180～220 g SD大鼠，SPF級，雌雄各半，大鼠購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（京）2019-0010；小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實驗動物合格證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)于23±2 ℃，自由進食和飲水，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)一周后開始試驗。

1.4 分組及給藥

活性地龍蛋白膠囊的劑量及配置：按照成人每天服用7粒，每粒含50 mg活性地龍蛋白，即人服用的劑量為5 mg/kgb·wt，將此劑量設(shè)為中等劑量，換算為大鼠的低、中、高劑量分別為：15.63 mg/kg、31.26 mg/kg和62.52 mg/kg（相鄰劑量比為1:2）；小鼠的低、中、高劑量分別為：22.50 mg/kg、45.00 mg/kg和90.00 mg/kg?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組均使用等劑量的0.5% CMC-Na溶液。陽性藥物阿司匹林的劑量及配制：人服用的劑量為每天100 mg，即1.43 mg/kgb·wt，換算為大鼠的劑量為：9.00 mg/kg；小鼠的劑量為13.00 mg/kg。將各個濃度的活性地龍蛋白膠囊、阿司匹林分別溶于0.5%的CMC-Na溶液中，灌胃使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 對小鼠尾出血時間影響

采用斷尾法研究活性地龍蛋白膠囊對小鼠尾出血時間的影響。將40只適應(yīng)性喂養(yǎng)后的ICR小鼠隨機分為5組，即空白對照組，阿司匹林陽性藥組，地龍低劑量組，地龍中劑量組，地龍高劑量組，每組各8只。分組后，按照2.1的劑量每天給予小鼠灌胃給藥（1 mL/100 g），連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，取小鼠于固定器中，使尾部與地面保持垂直，用鋒利剪刀距離尾尖1.5 mm處剪斷，并開始計時，用濾紙每隔一段時間輕觸斷口處，觀察濾紙是否沾有血跡，直至濾紙無血跡出現(xiàn)，并記錄時間，此時間即為尾出血時間。

1.6 對小鼠凝血時間的影響

采用毛細管法研究活性地龍蛋白膠囊對小鼠尾出血時間的影響。按照2.2方式分組后，每天給予灌胃給藥（1 mL/100 g），連續(xù)7 d。末次給藥后1h，用內(nèi)徑為1 mm長10 cm的玻璃毛細管（用前用砂輪在毛細管表面每5 mm做出劃痕，方便折斷）插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血，血液快速流出為佳，自血液流入管內(nèi)開始計時，每隔10 s折斷毛細管，每次折斷約5 mm，并緩慢向左右拉開，直至出現(xiàn)血凝絲停止計時，所得時間即為凝血時間。

1.7 對大鼠三氯化鐵致頸動脈血栓形成的影響

將66只適應(yīng)性喂養(yǎng)后的SD大鼠隨機分為6組，即假手術(shù)組、模型組、阿司匹林陽性藥組、地龍低劑量組、地龍中劑量組、地龍高劑量組，每組11只。分組后，按照2.1的劑量每天給予灌胃給藥（1 mL/100 g），連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，每組取8只，使用10%水合氯醛麻醉，分離大鼠兩側(cè)頸總動脈，血管下置小片塑料薄膜（4 cm×1.8 cm）用于保護血管周圍組織，將吸有20 μL 35% FeCl3的濾紙片（1 cm×1 cm）敷在頸總動脈上30 min，假手術(shù)組用生理鹽水代替35%FeCl3，觀察血液流通情況，去紙片20 min后，迅速剪下頸總動脈血栓部位血管1 cm，放于濾紙片上吸干余血精密稱濕重。放入70 ℃的烘箱2 h后稱干重。計算血栓形成抑制率。

血栓形成抑制率（%）=（模型組血栓重量-給藥組血栓重量）/模型組血栓重量×100

將每組剩余3只大鼠，分離左頸動脈，用浸滿35% FeCl3的濾紙敷于動脈上，假手術(shù)組用生理鹽水代替35% FeCl3，固定30 min，取頸動脈于4%多聚甲醛中固定，HE染色，切片，觀察血栓形成情況。

1.8 對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響

將2.4實驗動物末次給藥后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定。沿腹中線切開腹壁，玻璃分針分離出下腔靜脈，于下腔靜脈和左腎靜脈交叉下方手術(shù)線結(jié)扎，結(jié)扎后縫合腹壁。6 h后重新打開腹腔，在結(jié)扎下方2 cm處夾閉血管，剖開管腔，取出栓子，用濾紙吸干殘血后，精密稱濕重。置70 ℃烘箱中，烘2 h后精密稱干重，計算血栓形成抑制率。

1.9 對大鼠凝血參數(shù)的影響

將2.4實驗動物末次給藥1 h后10%水合氯醛麻醉，眼底靜脈叢取血，采用枸櫞酸鈉1:9抗凝采血，將抗凝血用離心機2500 r/min，離心15 min，取血漿用半自動血凝儀測定凝血酶原時間（PT）、鞣花酸活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

采用prim 8軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以Mean±SEM表示，使用單因素方差分析的方法進行檢驗，若p＜0.05則表示存在顯著性差異，若p＜0.01則表示存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性地龍蛋白膠囊對小鼠尾出血時間的影響

實驗采用斷尾法研究活性地龍蛋白膠囊對小鼠尾出血時間的影響，將斷尾開始截至濾紙上無血跡出現(xiàn)的時間記作出血時間作為觀察指標。小鼠進行斷尾后，受損部位的血管內(nèi)皮下膠原和皮下基質(zhì)暴露，血小板黏附于膠原上，隨后發(fā)生血小板聚集、釋放等，出現(xiàn)血小板血栓，使受損血管出現(xiàn)堵塞，血流停止。實驗結(jié)果（表1）顯示，隨著活性地龍蛋白膠囊給藥劑量的升高，尾出血時間也隨之延長（p＜0.01），低、中、高劑量的活性地龍蛋白膠囊，均能顯著延長小鼠的止血時間（13.75～18.88 min）。與空白組對照（3.13 min），表明活性地龍蛋白膠囊可以延長小鼠尾出血時間，且具有劑量依賴性。

表1 活性地龍蛋白膠囊對小鼠尾出血時間的影響Table 1 Activity of Dilong capsules on the influence of tail bleeding time in mice (Mean±SEM, n=8)

2.2 對小鼠凝血時間的影響

表2 活性地龍蛋白膠囊對小鼠凝血時間的影響Table 2 Activity of Dilong capsules on the influence of the clotting time in mice (Mean±SEM, n=8)

實驗采用毛細玻管法研究地龍對小鼠全血凝血時間的影響，將取血開始至首次出現(xiàn)凝血絲的時間記作凝血時間作為觀察指標。實驗結(jié)果（表2）顯示，隨著活性地龍蛋白膠囊給藥劑量的升高，凝血時間也隨之延長（72.63～82.63 s），其中地龍低、中、高劑量組均出現(xiàn)極顯著性差異（p＜0.01），與空白組對照（41.88 s），表明活性地龍蛋白膠囊可以延長小鼠全血凝血時間，且具有劑量依賴性。

2.3 對大鼠FeCl3致頸動脈血栓形成的影響

表3 活性地龍蛋白膠囊對大鼠三氯化鐵致頸動脈血栓形成濕重的影響Table 3 Ferric trichloride to Activity of Dilong capsules on rats carotid arterial thrombosis wet weight (Mean±SEM, n=8)

實驗采用三氯化鐵法誘導(dǎo)頸動脈血栓形成，將取出的血栓稱重為血栓濕重，將血栓烘干，稱重為干重，并計算得到血栓形成抑制率。實驗結(jié)果（表3、表4顯示），模型組與假手術(shù)組相比，具有顯著性差異，證明三氯化鐵可以誘導(dǎo)血栓形成。各劑量組與模型組相比，可以得出隨著活性地龍蛋白膠囊劑量升高，抑制血栓效果逐漸增強（濕重抑制率25.29%～38.37%；干重抑制率41.17%～51.76%）。其中，地龍膠囊低劑量與模型組出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），中、高劑量組出現(xiàn)極顯著性差異（p＜0.01）。

將三氯化鐵誘導(dǎo)形成血栓的血管進行HE染色，得到結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組相比，血栓生成明顯；地龍低、中、高劑量組與模型組相比，血栓生成較模型組減少。

表4 活性地龍蛋白膠囊對大鼠三氯化鐵致頸動脈血栓形成的干重影響Table 4 Ferric trichloride to activity of Dilong capsules on rats carotid thrombosis of dry weight (Mean±SEM, n=8)

圖1 FeCl3致頸動脈血栓生成HE染色Fig.1 FeCl3 carotid thrombosis generation HE staining

2.4 對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響

實驗采用結(jié)扎法致使下腔靜脈血栓形成，將取出的血栓稱重為血栓濕重，將血栓烘干，稱重為干重，并計算得到血栓形成抑制率。結(jié)果（表5、表6）顯示，模型組與假手術(shù)組相比，具有顯著性差異，證明結(jié)扎下腔靜脈可以誘導(dǎo)血栓形成（濕重抑制率68.32%～76.53%；干重抑制率61.25%～72.49%）?；钚缘佚埖鞍啄z囊低、中、高劑量組與模型組相比均出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.01）。可以得出，活性地龍蛋白膠囊可以抑制大鼠下腔靜脈結(jié)扎誘導(dǎo)的血栓生成，且隨著地龍劑量升高，抑制血栓效果逐漸增強。

表5 活性地龍蛋白膠囊對大鼠下腔靜脈血栓形成濕重的影響Table 5 Activity of Dilong capsules on the influence of the inferior vena cava thrombosis wet weight of rats (Mean±SEM,n=8)

表6 活性地龍蛋白膠囊對大鼠三氯化鐵致頸動脈血栓形成的干重影響Table 6 Activity of Dilong capsules on rats caused by FeCl3of the dry weight of influence (Mean±SEM, n=8)

2.5 對大鼠凝血參數(shù)的影響

表7 活性地龍蛋白膠囊對大鼠凝血參數(shù)的影響Table 7 The influence of activity of Dilong capsules on rat blood coagulation parameters (Mean±SEM, n=8)

采用眼底靜脈叢取血，用半自動血凝儀測定凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）作為觀察指標。結(jié)果如表7顯示，與空白組相比（PT/s 20.43，APPT/s 39.65，TT/s 30.05），地龍低、中、高劑量組PT（23.68～24.94）、APTT（44.03～46.60）、TT（35.31～41.15）時間均可顯著延長（p＜0.05，p＜0.01）。

3 討論

食品類抗凝血、抑血栓活性物質(zhì)主要以天然產(chǎn)物為主，其中以地龍和納豆為典型代表。納豆的有效成分為納豆激酶，其作為一種絲氨酸蛋白，可特異性作用于交聯(lián)纖維蛋白血栓，水解其成為蛋白質(zhì)和氨基酸，進而使血栓溶解[17]。地龍應(yīng)用于心血管領(lǐng)域的治療具有悠久的歷史，其中以由黃芪、赤芍、當歸尾佐以地龍組成的 “ 補陽還五湯 ” 為典型代表，用于治療腦梗死、腦出血及腦出血后遺癥[16]?，F(xiàn)代研究認為，地龍主要活性蛋白質(zhì)為纖溶酶、蚓激酶和蚓膠原酶[6,7]。

纖溶酶[18]首次由Jeon OH從地龍中得到的抗凝、纖溶活性的絲氨酸蛋白酶類糖蛋白，因其具有胰酶激活位點，可以水解纖維蛋白原α/β鏈和凝血酶，具有纖溶酶的活性。Mihara H等[19]首次從地龍中提取出蚓激酶，可溶解纖維蛋白及纖維蛋白原、溶解血栓并抑制血小板聚集[20]。鐘良偉等[21]從地龍中分離出的三種膠原酶，對陳舊性血栓的外殼蛋白有溶解效果。

4 結(jié)論

本試驗通過手術(shù)造模方式分別研究活性地龍蛋白膠囊對小鼠止血時間的影響、對小鼠全血凝血時間的影響、對大鼠三氯化鐵誘導(dǎo)頸動脈血栓的影響、對大鼠下腔靜脈血栓的影響和對大鼠凝血參數(shù)的影響。與正常組比較，活性地龍蛋白膠囊可以延長小鼠尾出血及凝血時間（p＜0.01），且具有劑量依賴性，高劑量組（90.00 mg/kg）延長尾出血活性（18.88 min）及凝血效果（82.63 s）最好。另外，與模型組相比，地龍膠囊隨劑量升高抑栓效果逐漸增強，高劑量組（62.52 mg/kg）活性最好（濕重抑制率76.53%；干重抑制率72.49%）。該實驗為活性地龍蛋白膠囊在溶栓方面的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。