孔鈺婷，何洪，安鳳平,2，宋洪波,2，黃群,2

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州 350002）（2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術(shù)重點實驗室，福建福州 350002）

太子參為石竹科植物孩兒參的塊根，全國各地均有種植，主要產(chǎn)自于福建、江蘇、貴州等地，具有益氣健脾，生津潤肺之功效，已被衛(wèi)計委確定列入 “ 可用于保健食品的中藥材名單 ” ，以飲食養(yǎng)生為主的藥膳食用習慣更為普遍，具有良好的藥用價值和保健作用[1]。已研發(fā)生產(chǎn)典型的藥品、功能與保健食品有太子參復方顆粒、口服液、養(yǎng)生酒等。隨著太子參生物活性研究的不斷深入，其在藥品和功能食品方面的研究與應用前景廣闊。已報道具有環(huán)肽、多糖、皂苷、氨基酸等多種活性成分，而關(guān)于太子參的功能研究則主要集中在太子參粗提物的心臟保護作用[2]、降血糖[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和抗疲勞[5]作用，但對腸道功能特性的研究較少有報道。

當機體細胞內(nèi)的自由基累積到一定程度會破壞機體氧化/抗氧化的平衡，產(chǎn)生氧化應激，生物細胞內(nèi)DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物分子就會發(fā)生改變甚至被破壞，如DNA修復機制受到破壞從而增強DNA突變的產(chǎn)生，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而喪失蛋白質(zhì)功能等，因此氧化應激與人類系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，而腸道作為物質(zhì)吸收和能量代謝的主要器官，極易受到自由基攻擊造成功能異常，影響機體代謝從而引發(fā)多種慢性疾病。許多研究已經(jīng)證明腸道菌群能影響宿主的氧化/抗氧化水平，益生菌產(chǎn)生的超氧化物、過氧化氫酶及抗氧化代謝物[6]，刺激宿主的抗氧化系統(tǒng)，可保護宿主細胞免受氧化應激等多種因素的影響[7]，激活抗氧化信號通路[8]。

本研究以太子參為原材料，通過實驗室提取與初步純化得到太子參醇提物，利用D-半乳糖致?lián)p動物模型初步研究太子參醇提物提高臟器抗氧化酶活的同時明確其對抗氧化相關(guān)腸道菌群具有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參購自福建咸康藥業(yè)有限公司，粉碎過40目備用。清潔級ICR小鼠購自福建醫(yī)科大學試驗動物中心，許可證號為SCXK（閩）2016-0002。

香草醛，α-萘酚阿拉丁試劑（上海）有限公司；冰醋酸，亞硝酸鈉，苯酚，國藥集團化學試劑有限公司；氯化鋁，上海泰坦科技股份有限公司；Rb1標準品，安徽西青果生物科技有限公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；D101大孔樹脂，艾美科?。ㄖ袊┥镝t(yī)藥有限公司。

D-半乳糖，Sigma公司；注射用生理鹽水，福州海王福藥制藥有限公司；蛋白定量測定試劑盒，總超氧化物歧化酶（T-AOC），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1780紫外分光光度計，日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，F(xiàn)DU-1200冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；HL-2S恒流泵，上海瀘西分析儀器廠有限公司；SpectraMax PLUS酶標儀，美國Molecular Devices公司；MS 3渦旋震蕩，德國IKA公司；Heraeus Fresco17離心機，Thermo Fisher Scientific公司；M199型切片刀，德國萊卡儀器（中國）有限公司；BMJ-A包埋機，常州中威電子儀器有限公司；BA210T型顯微鏡，Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 太子參醇提物的制備

粉碎過40目篩的太子參按料液比1:8加入70%乙醇，60 ℃水浴鍋中回流提取兩次，每次1 h，兩次濾液合并于50 ℃旋蒸濃縮至1/4。太子參濃縮液用石油醚萃取后旋蒸去除石油醚，用水補足體積，稀釋8倍后上大孔樹脂D101，水洗至Molish反應至陰性，30%乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得粉末。

1.3.2 總糖、黃酮和皂苷含量的測定

1.3.2.1 總糖的測定[9]

采用苯酚-濃硫酸法。取1 mL樣品溶液，加5%苯酚1 mL，混勻后加5 mL濃硫酸，混勻，室溫避光反應30 min后于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖為標品，繪制標準曲線。

1.3.2.2 黃酮的測定

參考Karen Pitura等[10]的方法測定，以蘆丁為標準品，繪制標準曲線。

1.3.2.3 皂苷的測定

取適量樣品溶液于10 mL具塞試管中，60 ℃水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞水浴加熱15 min后冰水浴冷卻，加入5 mL冰醋酸，搖勻，于560 nm波長處測定吸光度。以人參皂苷Rb1為標準品，繪制標準曲線[11]。

1.3.3 體內(nèi)抗氧化能力的測定

1.3.3.1 試驗動物的分組與試驗方法

72只雄性ICR小鼠（20±2 g）適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為6組，分別為正常組（NC）、模型組（DG）、陽性對照組（PC）、低劑量組（LPEs）、中劑量組（MPEs）和高劑量組（HPEs），每組12只。除NC組外，其余各組每天頸后背皮下注射1000 mg/kg D-半乳糖致氧化損傷，NC組注射生理鹽水。LPEs組、MPEs組和HPEs組小鼠每天50、100、300 mg/kg[12]太子參醇提物灌胃，PC組小鼠每日灌服50 mg/kg Vc，DG組和NC組每日灌胃等體積生理鹽水，試驗周期為5周[13]。試驗期間每天早上8:40～9:40稱量體重，觀察小鼠的一般體征。所有動物試驗均遵照 “ 試驗動物護理和使用指南 ” 進行，并得到福建省醫(yī)科大學動物倫理委員會的審查和批準（編號：FJMUIACUC 2019-0075）。

1.3.3.2 臟器指數(shù)的測定

試驗周期結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12～14 h，摘眼球采血后頸部脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟、腎臟、腦、脾臟，用預冷的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干，稱重。計算公式為：

1.3.3.3 臟器抗氧化酶活性測定

CAT、SOD、GXH-PX和MDA的檢測根據(jù)南京建成試劑盒說明書的要求進行，對小鼠肝臟、腎臟、腦部勻漿與血清抗氧化酶活性和MDA含量的檢測。

1.3.3.4 肝臟切片

將小鼠肝組織用10%中性福爾馬林固定然后用乙醇梯度脫水。二甲苯洗脫，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇，依次放置5 min；再用蒸餾水浸洗5 min，石蠟包埋，切片（5 μm）。蘇木素對肝組織進行染色5～10 min，蒸餾水沖洗，伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，取出后置于二甲苯10 min，重復操作2次，中性樹膠封片，顯微鏡下放大100倍觀察。

1.3.3.5 小鼠盲腸內(nèi)容物的微生物分析

試驗周期結(jié)束后，無菌環(huán)境取出小鼠盲腸內(nèi)容物裝入無菌凍存管，液氮速凍后置-80 ℃保存。使用TIANamp Stool DNA kit試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中提取微生物總DNA，對16S rDNA基因V3V4區(qū)進行擴增。擴增體系：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，Dntp 2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNAPolymerase 0.25 μL。PCR擴增參數(shù)：初始變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min， 10 ℃ Hold，25～30個循環(huán)，利用IlluminaMiSeq平臺對群落DNA片段進行雙端測序。

1.3.3.6 小鼠小腸組織形態(tài)

小心取出小腸，用預冷的生理鹽水將內(nèi)容物沖洗出來后放入中性福爾馬林，用于病理切片分析。

1.2.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用DPS 7.5軟件進行統(tǒng)計分析，測定結(jié)果以x±s（平均值±標準差）表示。采用單因素方差分析并用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參醇提物總糖、黃酮和皂苷的含量

從表1可以看出，經(jīng)大孔樹脂D101富集、30%乙醇的洗脫物中，主要含有皂苷類、黃酮類和糖類物質(zhì)，其中皂苷類物質(zhì)含量達到613.48 mg/g干物質(zhì)。

表1 太子參醇提物總糖、黃酮、皂苷的含量（mg/g干物質(zhì)）Table 1 Total sugar, saponin and flavonoids in the extract of radix pseudostellariae

2.2 小鼠體重和生長狀況

圖1 太子參醇提物對小鼠體重變化的影響Fig.1 Effects of PEs on body weight changes of mice

如圖1所示，各組小鼠經(jīng)適應喂養(yǎng)后體重穩(wěn)定，未見顯著差異（0周）。隨著試驗的進行，DG組與各試驗組小鼠體重開始逐漸產(chǎn)生差異，表現(xiàn)為行動遲緩、毛發(fā)枯燥缺少光澤，說明皮下注射D-半乳糖對小鼠生長會造成一定影響[13]。試驗第5周時，NC組和PC組體重為41.20 g和39.20 g，經(jīng)低、中、高劑量太子參醇提物喂養(yǎng)小鼠的體重分別為39.40 g、39.70 g和40.60 g，而DG組為38.60 g，說明灌胃太子參醇提物和Vc對模型小鼠生長緩慢具有明顯促進作用。

2.3 臟器指數(shù)

表2 小鼠各臟器指數(shù)的測定結(jié)果（mg/g）Table 2 The determination of organ index in mice (mg/g)

由表2可知，與NC組相比，DG組小鼠各臟器指數(shù)顯著降低，說明皮下注射D-半乳糖小鼠確實發(fā)生了機體損傷。通過灌胃Vc和太子參醇提物均可提高致?lián)p小鼠的臟器指數(shù)，其中高劑量效果顯著（p＜0.05），與DG組相比，分別提高了22.76%（脾臟）、2.66%（大腦）、6.38%（肝臟）和8.51%（腎臟），基本達到了正常水平，效果好于Vc。PC組各臟器指數(shù)與DG組差異不顯著，其原因有待進一步研究。

2.4 體內(nèi)抗氧化酶活和MDA含量

圖2 小鼠臟器中抗氧化酶活Fig.2 Effects of PEs on antioxidant activity in organ tissues of mice

如圖2所示，DG組小鼠各臟器組織中CAT、SOD和GSH-PX活力均顯著低于NC組，表明皮下注射D-半乳糖能使小鼠體內(nèi)抗氧化水平降低。各劑量組小鼠CAT、SOD和GSH-PX活力均有所提升，其中HPEs組肝臟、腎臟和腦組織中的CAT活力均達到正常水平，MPEs組與HPEs組之間無顯著差異。中、高劑量組肝臟、腎臟和腦組織中CAT酶活達到或超過PC組的CAT酶活水平。與DG組相比，三個劑量組各器官的SOD酶活均有不同程度上升，其中HPEs組肝臟、腎臟和腦部SOD酶活分別提高16.64%，19.94%和14.55%，低中劑量的太子參醇提物即可達到Vc效果，而HPEs組腎臟中SOD酶活顯著高于PC組，因此高劑量太子參醇提物增強各臟器SOD酶活的能力顯著強于Vc。PC組GSH-PX酶活與NC組相比無顯著性差異（p＞0.05），LPEs組小鼠肝臟、腎臟和腦部的GSH-PX酶活高于DG組，但差異不顯著，MPEs組的效果好于LPEs組；HPEs組小鼠肝臟、腎臟和腦部的GSH-PX酶活與正常組無顯著性差異。與張振明等[14]研究結(jié)果類似，由此可見太子參醇提物對D-半乳糖致?lián)p傷小鼠的抗氧化能力的改善明顯量效關(guān)系，高劑量太子參醇提物的效果優(yōu)于Vc。

圖3 小鼠臟器中MDA的含量Fig.3 Effects of PEs on MDA content in organ tissues of mice

丙二醛（MDA）含量越高，意味著生物膜受氧化破壞越嚴重[15]。圖3表明，與NC組相比，皮下注射D-半乳糖使得小鼠肝臟、腎臟和腦部的MDA含量顯著增加，進行太子參醇提物和Vc進行干預后，與DG組相比各臟器內(nèi)MDA含量均有不同程度下降，其中MPEs、HPEs組各器官MDA含量可恢復至正常水平，總體上HPEs組清除MDA的效果要好于Vc。這進一步表明高劑量太子參醇提物抗氧化能力優(yōu)于Vc。

2.5 肝臟組織切片

肝臟是參與D-半乳糖代謝的主要器官，過量D-半乳糖可增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，可能導致器官損傷[16]。從圖4a可以看出NC組小鼠的肝臟細胞結(jié)構(gòu)具有正常的中心靜脈和肝細胞，核大而圓；圖4b顯示DG組肝組織有大量脂肪泡蓄積，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，說明肝臟出現(xiàn)異常[17]。PC組和太子參醇提物干預各組肝組織情況較DG組好，胞質(zhì)豐富，脂肪蓄積減少，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝血竇以中央靜脈為中心呈均勻的散狀分布，肝組織形態(tài)得到不同程度的恢復，其中HPEs組肝組織情況與NC組接近，說明高劑量太子參醇提物對氧化應激造成的肝臟組織損傷修復效果好。

圖4 小鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig.4 Tissue slices of mice liver

2.6 UPGMA聚類分析

圖5 基于Unweighted UniFrac距離矩陣的UPGMA聚類分析圖Fig.5 UPGMA clustering analysis based on unweighted UniFracdistance matrix

通過比較不同樣品間Unifrac距離的遠近來判斷其微生物構(gòu)成的相似性并聚類，從圖5所示的聚類分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，除個別樣品有重疊外，MPEs組和HPEs組明顯成一簇，相似程度高，而DG組與NC組存在分離，說明NC組、DG組與MPEs和HPEs組微生物構(gòu)成差異較大。

2.7 屬水平群落組成熱

從圖6的上方進化樹可以看到，NC、PC和LPEs組聚成一類，MPEs和HPEs組聚成一類，DG組單獨聚成一類，表明DG組與各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上相似程度較低，說明注射D-半乳糖致?lián)p對小鼠腸道微生物屬水平組成影響較大。在DG組中，甲基桿菌屬（Methylobacterium）、阿爾法變形桿菌（Unclassified-Alphaproteobacteria）、普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、理研菌屬（Rikenella）等為代表的潛在致病菌屬含量增加。與DG組相比，HPEs組腸道微生物表現(xiàn)為上調(diào)的菌屬有擬桿菌屬（Parabacteroides）、梭菌屬（Anaerotruncus）、另枝菌屬（Alistipes）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）、S24-7等菌屬的豐度，其中Parabacteroides屬SCFAs產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生戊酸[18]，Anaerotruncus能編碼表達合成丁酸鹽所需要的酶[19]，Alistipes可能具有預防和治療如結(jié)腸直腸癌等腸道疾病的潛力[20]，相對于其他腸道微生物具有更強的金屬抗性[21]，而S24-7屬于丁酸鹽產(chǎn)生菌[22]。MPEs組上調(diào)Bifidobacterium、Bacteroides和Prabacteroides，其中Bacteroides為腸道優(yōu)勢厭氧菌，能幫助宿主分解多糖[23]，與攝入黨參能提高Bacteroides的研究結(jié)果類似[24]。LPEs組盲腸微生物表現(xiàn)為上調(diào)Odoribacter、梭菌屬（Clostridium）和普氏菌屬（Prevotella）。Clostridium可以合成強抗氧化劑3-吲哚丙酸(色氨酸脫氨的產(chǎn)物)，消除D-半乳糖產(chǎn)生的自由基從而保護大腦免受氧化傷害；而Prevotella可提高SCFAs的合成速率，增強對組蛋白去乙酰化酶和G蛋白偶聯(lián)受體的抑制作用并減少腦損傷[25]。作為主要益生菌，雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌（Lactobacillus）能改善健康人的總抗氧化狀態(tài)并降低氧化應激指標[26]。有報道人參中的多糖能夠改善某些人參皂苷的腸道生物轉(zhuǎn)化，同時改善腸道菌群的紊亂情況，特別是促進Lactobacillus和Bacteroides生長[27]。本文也有類似試驗結(jié)果，特別是與NC組相比，小鼠注射D-半乳糖后腸道Bifidobacterium和Lactobacillus相對豐度明顯降低，喂食Vc以及高劑量太子參醇提物顯著增加了Bifidobacterium和Lactobacillus的豐度。益生菌的代謝活動可通過清除氧化劑化合物或阻止其在腸道中的生成發(fā)揮抗氧化作用[28]。

圖6 結(jié)合聚類分析的屬水平群落組成熱圖（豐度前60菌屬）Fig.6 Heat map of genera-level community based on the cluster analysis (relative abundant Top 60)

圖7 小鼠小腸組織切片圖Fig.7 Intestinal tissue sections of mice

2.8 小腸組織切片

腸粘膜的完整性受損易使腸內(nèi)微生物易位進入淋巴系統(tǒng)[29]，更多有害的致病菌會粘附在腸道上皮，與Bifidobacterium和Lactobacillus等有益菌競爭。過量的ROS會減少腸道粘液層厚度，粘液松散會大大降低粘液屏障的保護作用[30]。Bifidobacterium和Lactobacillus均已被證明具有降低動物腸道內(nèi)毒素水平和改善粘膜屏障功能[31]。從圖7小腸切片圖可見，NC組小腸組織學形態(tài)呈正常狀態(tài)，絨毛排列致密，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整；DG組絨毛排列較稀疏，絨毛頂部有萎縮現(xiàn)象，說明腸絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常；PC組較DG組的粘膜損傷情況有所恢復，但絨毛呈短錐狀，分支仍較少。隨著太子參醇提物劑量的增加，粘膜損傷逐漸修復，圖7f所示HPEs組小鼠小腸絨毛損傷情況明顯恢復，致密程度恢復接近正常水平。

3 結(jié)論

本研究表明，太子參醇提物在一定程度上能增強D-半乳糖模型鼠的抗氧化能力。通過臟器指數(shù)、抗氧化酶活、肝臟組織形態(tài)、小腸微生物等指標進行評價，結(jié)果表明太子參醇提物能改善D-半乳糖模型鼠生長遲緩的情況，顯著提高小鼠肝臟、腎臟和腦部的CAT、SOD和GSH-PX酶活，降低MDA含量，保護肝臟組織免受氧化損傷，小鼠體內(nèi)總抗氧化能力提高。同時，該太子參醇提物能有效提高小腸內(nèi)容物中Bifidobacterium、Lactobacillus、Bacteroides和Blautia相對豐度，降低Unclassified-Alphaproteobacteria、Rikenella屬等相對豐度，盲腸絨毛致密程度恢復接近正常水平，腸道總體患病風險降低，使得機體總體抗氧化水平得到提高。