嚴(yán) 婷，王鑫磊，朱海霞，李 慧，王金菊，李 超，王艷萍

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類能夠利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱。乳酸菌在自然界中分布相當(dāng)廣泛，其應(yīng)用價值也比較高，相關(guān)研究已證明乳酸菌具有維持腸道生理平衡、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、抗氧化等益生功能[1-4]，已廣泛用于食品、工業(yè)等領(lǐng)域[5-6]。

腸道中的乳酸菌能激活淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖、分化或增強(qiáng)免疫反應(yīng)[7]。PATURI G等[8]采用乳桿菌對小鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道中的白介素（interleukin，IL）-10和干擾素（interferon，IFN）-γ水平增加，免疫球蛋白（immune globulin，IgA）分泌也增加，證明乳桿菌可以提高小鼠免疫系統(tǒng)的功能。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LV108干預(yù)免疫抑制模型大鼠4周，顯著增加了大鼠腸道內(nèi)乳酸菌、雙歧桿菌，降低了腸桿菌、腸球菌的含量，證明乳桿菌可以增加腸道有益菌，減少有害菌的數(shù)量[9]。大量實驗表明，益生菌可以通過影響固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而在腸道和全身水平引起免疫調(diào)節(jié)作用[10-13]。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是一種烷基化劑，廣泛用于治療腫瘤和癌癥[14]。然而，有研究表明，CTX對人和動物的正常細(xì)胞都有毒性作用，其中骨髓抑制和免疫抑制是最常見的兩種副作用[15]，故CTX常被用來構(gòu)建免疫抑制小鼠模型[16]。本研究以源于發(fā)酵泡菜中的乳酸菌BC299為研究對象，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物技術(shù)對其進(jìn)行菌種鑒定，研究其耐酸、耐膽鹽、耐抗生素能力，并采用CTX誘導(dǎo)免疫抑制小鼠，研究其對免疫抑制模型小鼠腸道菌群多樣性和豐度的影響，為益生菌影響免疫調(diào)節(jié)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種菌株BC299：由本課題組篩選，保藏于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，菌種保藏號為CGMCC6326。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[17]：牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，檸檬酸銨2.0 g，吐溫80 1.0 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.4，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15～20 g。

1.1.3 主要試劑

革蘭氏染色試劑盒：南京建成生物有限公司；0.3%牛膽鹽：天津市英博生化試劑有限公司；16S rDNA基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物：天津金唯智生物科技有限公司；10%福爾馬林：天津市江天化工有限公司；API 50 CHL試劑盒：法國梅里埃公司；卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、青霉素G、利福平和頭孢噻吩：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YS100生物顯微鏡：日本NIKON公司；SU-1510掃描式電子顯微鏡：日本日立公司；全自動凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；HFsafe 900型超凈工作臺：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株BC299的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]對菌株BC299的形態(tài)進(jìn)行鑒定。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]進(jìn)行生理生化實驗，并采用API 50 CHL試劑條進(jìn)行碳水化合物發(fā)酵試驗。

分子生物學(xué)鑒定：參考王海英等[19-20]的方法采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株BC299的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。將得到的序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株BC299生長曲線及產(chǎn)酸曲線的測定

將-80 ℃凍藏的菌株BC299劃線于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃活化培養(yǎng)24 h；挑取單菌落，接種至3 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h作為種子液；按3%（V/V）的接種量將種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定其在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）及pH值的變化。

1.3.3 菌株BC299對模擬胃酸及牛膽鹽耐受性的測定

將菌株BC299種子液按4%（V/V）的接種量接種于pH=2.0的MRS液體培養(yǎng)基[21]，37 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)0 h、1 h、2 h時取樣，采用梯度稀釋法涂布于MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計數(shù)[22]，從而確定菌株BC299對模擬胃酸的耐受性。

將菌株BC299種子液按4%（V/V）的接種量接種于含0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，以不含膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作為對照，37 ℃靜置培養(yǎng)。每隔一定時間取樣，測定其在波長600 nm處的吸光度值升高0.3所需要的時間[23-24]，從而確定菌株BC299對0.3%牛膽鹽的耐受性。

1.3.4 菌株BC299的藥敏試驗

根據(jù)凡琴等[25]的方法，進(jìn)行菌株BC299的藥敏試驗。將菌株BC299按4%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體并用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，然后用滅菌的棉棒蘸取少量的菌液，分別接種于含卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、青霉素G、利福平和頭孢噻吩的MRS固體培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度均分別為512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL和0.125 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，記錄菌株的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）值，確定菌株的耐藥性。

1.3.5 免疫抑制模型小鼠的構(gòu)建及處理

參考WANG X等[26]的方法構(gòu)建免疫抑制模型小鼠，將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，即正常組、模型組、實驗組。模型組和實驗組小鼠，在試驗第1～3天、18天和22天腹腔注射80 mg/kg CTX，以誘導(dǎo)建立免疫抑制模型，正常組腹腔注射等量生理鹽水。在第4～28天，實驗組連續(xù)灌胃菌株BC299的菌懸液（1×109CFU/mL）0.2 mL，正常組和模型組連續(xù)灌胃生理鹽水0.2 mL。

1.3.6 小鼠小腸的HE染色

1.3.7 小鼠腸道糞便16S rDNA測序

在灌胃結(jié)束后，無菌采集各組小鼠糞便，收集完成后，立即將糞便放入-80 ℃冰箱保存。委托天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行腸道菌群分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌BC299的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株BC299在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，觀察菌落及細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株BC299的菌落呈乳白色，圓形，中心凸起，邊緣整齊。個體呈現(xiàn)單獨(dú)存在或短鏈狀排列，細(xì)胞呈短桿狀，寬0.4～0.6 μm，長1.3～2.3 μm，無芽孢，無鞭毛。

圖1 菌株BC299的菌落（a）及細(xì)胞（b，c）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b,c) morphology of strain BC299

2.1.2 生理生化試驗鑒定結(jié)果

菌株BC299的生理生化試驗結(jié)果見表1。由表1可知，菌株BC299為革蘭氏陽性菌；過氧化氫酶及硝酸鹽還原試驗呈陰性；不運(yùn)動；不產(chǎn)硫化氫；能酸化和凝固牛乳；10 ℃生長；45 ℃不生長；可以耐受45%的NaCl。應(yīng)用API 50 CHL試劑條對菌株BC299發(fā)酵碳水化合物的能力進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。將表2結(jié)果輸入API LAB Plus鑒定系統(tǒng)進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示菌株BC299為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[27]，初步判定菌株BC299為乳桿菌屬（Lactobacillussp.）。

孫敬文:“好歹我的綽號是別人送給我的,我不接受都沒辦法。而他的綽號是自己送給自己的,見人就推銷,別人想不接受都難!”

表1 菌株BC299的生理生化試驗結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strain BC299

表2 菌株BC299的碳水化合物發(fā)酵試驗結(jié)果Table 2 Results of carbohydrate fermentation tests of strain BC299

續(xù)表

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

基于16S rDNA基因序列，菌株BC299的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株BC299與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）S-24處于同一個分支，同源性為100%，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗結(jié)果鑒定菌株BC299為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列號為MW221321.1。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株BC299的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic tree of strain BC299 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 植物乳桿菌BC299的生長特性

2.2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線

菌株BC299的生長曲線及產(chǎn)酸曲線見圖3。由圖3可知，菌株BC299在培養(yǎng)的0～3 h處于生長適應(yīng)期，生長代謝緩慢，產(chǎn)酸較少；從第3小時開始，菌株BC299的生長速度不斷加快，進(jìn)入生長對數(shù)期，菌體呈幾何級數(shù)遞增，由生長代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸也在不斷地積累，pH值下降；21 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量和pH值均趨于穩(wěn)定。

圖3 植物乳桿菌BC299的生長曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.3 Growth and acid production curve of Lactobacillus plantarum BC299

2.2.2 耐酸及耐膽鹽特性

菌株BC299的耐酸特性見表3。由表3可知，在pH=2.0環(huán)境中，菌株BC299培養(yǎng)2 h后，活菌數(shù)由初始的（2.51±1.01）×108CFU/mL下降至（1.81±1.58）×106CFU/mL，一般認(rèn)為益生菌產(chǎn)品發(fā)揮功能特性的活菌數(shù)臨界值為106CFU/mL[28]，說明菌株BC299有在腸道中存活并發(fā)揮作用的可能性。

表3 植物乳桿菌BC299對酸的耐受性Table 3 Tolerance of Lactobacillus plantarum BC299 to acid

菌株BC299的耐膽鹽特性見表4。由表4可知，菌株BC299在含0.3%牛膽鹽的環(huán)境中，OD600nm值升高0.3的生長延滯時間為0.61 h，參考BAO Y等[23]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離獲得的乳桿菌株在0.3%膽鹽下耐受性結(jié)論，菌株BC299具有良好的膽鹽耐受性。

表4 植物乳桿菌BC299對膽鹽的耐受性Table 4 Tolerance of Lactobacillus plantarum BC299 to bile salts

2.2.3 耐藥性

菌株BC299對8種抗生素的MIC值見表5。

表5 植物乳桿菌BC299對8種抗生素的最小抑制濃度值Table 5 Minimum inhibitory concentrations value of Lactobacillus plantarum BC299 on 8 antibiotics

由表5可知，菌株BC299對卡那霉素和鏈霉素呈現(xiàn)出耐藥性，對紅霉素表現(xiàn)為中敏感，對氯霉素、氨芐西林、青霉素G、利福平和頭孢噻吩表現(xiàn)為敏感。

2.3 植物乳桿菌BC299對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 免疫抑制小鼠小腸HE切片結(jié)果

菌株BC299對小鼠小腸HE切片的影響見圖4。由圖4可知，正常組小鼠小腸絨毛排列整齊，組織結(jié)構(gòu)清晰；模型組小鼠小腸絨毛變短萎縮，組織結(jié)構(gòu)混亂；實驗組小鼠小腸組織的絨毛長度及組織形態(tài)較模型組有一定程度改善。以上結(jié)果表明，菌株BC299對免疫抑制小鼠小腸組織狀態(tài)有一定調(diào)節(jié)作用。

圖4 小鼠小腸的組織病理學(xué)觀察結(jié)果（400×）Fig.4 Histopathology observation results of small intestine of mice(400×)

2.3.2 小鼠糞便樣本中菌群OTU數(shù)及α多樣性分析

小鼠糞便樣本中菌群操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）結(jié)果見圖5。由圖5可知，正常組、模型組與實驗組小鼠的腸道菌群總OTUs值分別為241個、241個和243個，各組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。小鼠糞便樣本中菌群α多樣性分析結(jié)果見表6。由表6可知，3組小鼠糞便樣本的Coverage均＞0.99，說明樣本中序列沒有被測出的概率較低，取樣合理，具有代表性。ACE指數(shù)和超1（Chao1）指數(shù)反映了分類學(xué)上的物種豐富度，香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)反映了樣本中微生物的多樣性。ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各組別之間沒有存在顯著性差異（P＞0.05），故進(jìn)一步對各組小鼠在門和科水平上的菌群相對豐度進(jìn)行比較分析。

表6 小鼠糞便樣本中菌群alpha多樣性指數(shù)Table 6 Alpha-diversity indexes of flora in mice fecal samples

圖5 小鼠糞便樣本中菌群操作分類單元數(shù)量Fig.5 Operational taxonomic unit number of microflora in mice fecal samples

2.3.3 小鼠糞便樣本在門水平上的菌群豐度及差異

菌株BC299對免疫抑制小鼠腸道菌群門水平的影響見圖6。由圖6可知，擬桿菌門（Bacteroidetes）、硬壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）占據(jù)了門水平整個豐度的90%以上。與正常組相比，模型組擬桿菌門相對豐度降低，實驗組擬桿菌門相對豐度增加。與正常組相比，模型組硬壁菌門相對豐度升高，實驗組硬壁菌門相對豐度降低。結(jié)果表明，菌株BC299對免疫抑制小鼠腸道菌群在門水平上的主要菌群的豐度有一定的影響。

圖6 腸道菌群門水平的細(xì)菌分類學(xué)分析Fig.6 Bacterial taxonomic profiling of gut microbiota at the phylum level

2.3.4 小鼠糞便樣本在科水平上的菌群豐度及差異

菌株BC299對免疫抑制小鼠腸道菌群科水平的影響見圖7。由圖7可知，毛螺菌科（Lachnospiraceae）、乳酸桿菌科（Lactobacilaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和擬桿菌科（Bacteroidaceae）的相對豐度較高。占比較高的毛螺菌科、瘤胃球菌科和擬桿菌科的相對豐度結(jié)果見表7。由表7可知，與正常組相比，模型組給藥CTX造成了毛螺菌科相對豐度的增加；與模型組相比，給予菌株BC299懸液后，實驗組毛螺菌科豐富度顯著降低（P＜0.05）。與正常組相比，模型組瘤胃球菌科的相對豐度顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組瘤胃球菌科相對豐度顯著降低（P＜0.05），擬桿菌科相對豐度顯著增加（P＜0.05）。有研究顯示，毛螺菌科和瘤胃球菌科與免疫反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)；在免疫抑制改善組小鼠腸道菌群中擬桿菌科豐度較高[29]。結(jié)果表明，菌株BC299能夠正向調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)菌群的相對豐度。

圖7 腸道菌群科水平的細(xì)菌分類學(xué)分析Fig.7 Bacterial taxonomic profiling of gut microbiota at the family level

表7 科水平優(yōu)勢菌的相對豐度Table 7 Relative abundance of dominant bacteria at the family level

3 結(jié)論

以傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離得的一株乳酸菌BC299為研究對象，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16S rDNA基因序列分析，鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其對pH2.0和0.3%膽鹽具有良好的耐受性，對卡那霉素和鏈霉素呈現(xiàn)出耐藥性，對紅霉素表現(xiàn)為中敏感，對氯霉素、氨芐西林、青霉素G、利福平和頭孢噻吩均表現(xiàn)為敏感。動物試驗結(jié)果表明，植物乳桿菌BC299能夠改善CTX誘導(dǎo)小鼠的小腸絨毛和組織形態(tài)的破壞，對免疫抑制小鼠的腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，能正向調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)菌群的相對豐度，使小鼠腸道內(nèi)毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的相對豐度顯著降低（P＜0.05），擬桿菌科（Bacteroidaceae）的相對豐度顯著增加（P＜0.05）。