苑園園，龔建剛，王子?jì)?，郭凱元，孫 煒，封龍寬，季明月

（1.衡水學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；3.天津市紅橋區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，天津 300131）

乳酶生也叫食母生，是一種微生態(tài)活菌制劑，其在腸道中能分解乳糖生成乙酸和乳酸，進(jìn)而降低pH值。同時(shí)，通過分解乳糖產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠抑制有害微生物的繁殖，起到緩解消化異常、減輕腹瀉腹脹等作用[1-2]。乳酶生生產(chǎn)菌種開始時(shí)命名為“乳酸腸球菌”，后更改為腸鏈球菌（Streptococcus faecalis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）[3]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，由于早期鑒定手段落后或命名不規(guī)范等原因，乳酶生生產(chǎn)菌株糞腸球菌有可能為屎腸球菌（E.faecium）。2015年中國(guó)藥典二部正文品種第一部分已對(duì)該問題進(jìn)行了正式更改[7]。16S rDNA在原核生物中具有高度保守性，可通過比較其序列同源性高低來判斷微生物種屬關(guān)系，是菌種鑒定中常用的分子生物學(xué)方法[8]，也是傳統(tǒng)形態(tài)和生理生化鑒定法的補(bǔ)充和佐證。

屎腸球菌是一種農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑使用的乳酸菌，能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、抑制其他有害菌生長(zhǎng)[9-12]，如果開發(fā)成動(dòng)物微生態(tài)制劑會(huì)有很大的應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵是提高其生物量即活菌量，但由于屎腸球菌作為乳酸菌的一種，常使用的MRS培養(yǎng)基價(jià)格高，難以推廣應(yīng)用。

本試驗(yàn)通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從乳酶生片中分離乳酸菌，采用生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，并以活菌數(shù)為響應(yīng)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其增殖培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，以期降低制造成本的同時(shí)，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基[13]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉20 g，硫酸鎂0.28 g，硫酸錳0.18 g，加蒸餾水至1 L。固體培養(yǎng)基中添加20 g瓊脂粉。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.2 主要試劑

乳酶生片（15 g）：桂林南藥股份有限公司；TIANamp細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；蛋白胨（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；酵母浸粉、乳糖（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳清粉（食品級(jí)）：河南鄭州萬盛食品添加劑公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FLC-3型超凈工作臺(tái)：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；YXQ-SG46-280S型高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CP214型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；QL-861型旋渦振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ST300型便攜式pH計(jì)：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；SimpliAmpTM熱循環(huán)儀：美國(guó)ABI公司；070-851型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

用無菌鑷子夾取一粒乳酶生片，加入滅菌生理鹽水中溶解，按10倍梯度稀釋，選擇合適稀釋度的稀釋液涂布到基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基平板中，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d。選取形態(tài)一致的單菌落反復(fù)純化后，凍存于甘油管，并命名為Y1。使用前在基礎(chǔ)增殖液體培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min條件下活化2次。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察：將菌株Y1劃線接種于基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基平板，37 ℃條件培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，采用顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)[14]：對(duì)菌株Y1進(jìn)行觸酶、精氨酸產(chǎn)氨、耐膽鹽、耐鹽性、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：采用TIANamp細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株Y1的DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1541R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA基因序列，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化

將菌液按3%（V/V）的接種量接種到pH 7.0的基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基中，于200 r/min、不同溫度（23 ℃、30 ℃、37 ℃、44 ℃）條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)，考察溫度對(duì)活菌數(shù)的影響，確定最適培養(yǎng)溫度。在此基礎(chǔ)上，依次考察不同接種量（1%、3%、5%）、不同初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對(duì)活菌數(shù)的影響。

1.3.4 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：選取不同碳源（乳糖、乳清粉、蔗糖、糖蜜、紅糖、可溶性淀粉）代替基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基中葡萄糖，將菌液按1%（V/V）的接種量接種，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定活菌數(shù)。在此基礎(chǔ)上，依次考察碳源添加量（0、1 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L）、氮源種類（乳清粉、牛肉膏、硫酸銨、豆餅粉代替蛋白胨）及添加量（0、5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L）、生長(zhǎng)因子種類（番茄汁、胡蘿卜汁[15]、玉米漿代替酵母浸粉）及添加量（0、2.5 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L）對(duì)活菌數(shù)的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乳糖添加量（A）、乳清粉添加量（B）及酵母浸粉添加量（C）為考察因素，活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for proliferation medium optimization

1.3.5 菌體活菌計(jì)數(shù)方法

將發(fā)酵液10倍梯度稀釋，取0.1 mL適宜稀釋度液體涂布于基礎(chǔ)增殖固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)GB/T 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液中的活菌數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)處理均包括3次平行試驗(yàn)，結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示。采用Design Expert V8.0.6軟件擬合試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)擬合方程做顯著性檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酶生片中乳酸菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從乳酶生片中分離得到一株菌株，編號(hào)為Y1，其在基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基上的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株Y1的菌落形態(tài)（a）和細(xì)胞形態(tài)（b）Fig.1 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of strain Y1

由圖1可知，菌株Y1的菌落呈圓形，直徑約1 mm，乳白色，邊緣整齊，稍隆起；經(jīng)鏡檢菌體為球形，成雙或短鏈狀排列，革蘭氏陽性菌。

2.1.2 生理生化試驗(yàn)

菌株Y1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，菌株Y1不能產(chǎn)過氧化氫，不能利用鼠李糖，能利用果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、纖維二糖等，說明該乳酸菌能夠利用大部分單糖及二糖。此外，該菌株能夠在6.5%NaCl和40%膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[17]，初步判斷分離到的菌株Y1為腸球菌屬（Enterococcussp.）。

表2 菌株Y1的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strain Y1

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列菌株Y1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株Y1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Y1 based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株Y1與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于一支，親緣關(guān)系最近，序列相似性為99.79%。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性，判定菌株Y1為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

2.2 屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 最適培養(yǎng)溫度的確定

由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株Y1的活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)。菌株Y1在23 ℃、30 ℃、37 ℃條件下生長(zhǎng)較好，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，菌株Y1的活菌數(shù)最高為1.16×109CFU/mL；但當(dāng)溫度升高到44 ℃時(shí)，活菌數(shù)最低為1.65×108CFU/mL，這些結(jié)果符合屎腸球菌生長(zhǎng)溫度范圍在10～45 ℃之間的特征[18]。因此，選擇37 ℃作為最適培養(yǎng)溫度。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of culture temperature on Enterococcus faecium Y1 growth

2.2.2 最適接種量的確定

由圖4可知，當(dāng)接種量為1%時(shí)，菌株Y1的活菌數(shù)最高為1.21×109CFU/mL，接種量為3%和5%時(shí)，活菌數(shù)均有所下降，可能是因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響了菌種的生長(zhǎng)。因此，選擇接種量1%為最適接種量。

圖4 不同接種量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different inoculum on Enterococcus faecium Y1 growth

2.2.3 最適初始pH值的確定

由圖5可知，隨著初始pH值的增大，菌株Y1的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)，活菌數(shù)最高，達(dá)1.23×109CFU/mL。說明隨著初始pH值的升高，菌種中和發(fā)酵過程中的有機(jī)酸的能力增強(qiáng)[19]，減輕了對(duì)菌體的毒害作用。當(dāng)初始pH值為4.0時(shí)，平板上沒有菌生長(zhǎng)，其原因可能是發(fā)酵產(chǎn)生的大量乳酸積累，抑制了菌體的生長(zhǎng)，這一結(jié)果也恰好符合屎腸球菌生長(zhǎng)的初始pH范圍在4.5～9.6之間的特征，為菌株Y1是屎腸球菌的鑒定結(jié)果提供了一個(gè)證據(jù)。因此，確定該菌株的最適初始pH值為8.0。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of initial pH of medium on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3 菌株Y1增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 碳源種類對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，活菌數(shù)最高，為1.3×109CFU/mL，原因可能是屎腸球菌Y1對(duì)單糖和雙糖利用速度較快[18]。因此，確定最佳碳源為乳糖。

圖6 碳源對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of carbon sources on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3.2 乳糖添加量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響

碳源的濃度直接影響培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)[20-21]，由圖7可知，隨著乳糖添加量的增加，菌株Y1的活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是當(dāng)乳糖含量過低時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，而當(dāng)乳糖含量過高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，pH值過快下降，進(jìn)而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分離子化程度受到影響，微生物生長(zhǎng)趨勢(shì)減緩[22]。當(dāng)乳糖添加量為10 g/L時(shí)，活菌數(shù)最高為1.49×109CFU/mL。因此，確定最佳乳糖添加量為10 g/L。

圖7 乳糖添加量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of lactose addition on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3.3 氮源種類對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響

由圖8可知，當(dāng)?shù)礊槿榍宸蹠r(shí)，活菌數(shù)明顯高于其他氮源?？赡芤?yàn)槿榍宸蹱I(yíng)養(yǎng)豐富，含有屎腸球菌生長(zhǎng)所需乳清蛋白、氨基酸等物質(zhì)。乳清粉是干酪素或干酪生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，來源廣泛易得[23]。因此，確定最佳氮源為乳清粉。

圖8 氮源對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of nitrogen sources on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3.4 乳清粉添加量對(duì)屎腸球菌Y1的影響

由圖9可知，隨著乳清粉添加量的增加，菌株Y1的活菌數(shù)呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)乳清粉添加量為10 g/L時(shí)，活菌數(shù)最高為2.07×109CFU/mL。因此，確定最佳乳清粉添加量為10 g/L。

圖9 乳清粉添加量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of whey powder addition on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3.5 生長(zhǎng)因子對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響

由圖10可知，當(dāng)以酵母浸粉為生長(zhǎng)因子時(shí)，活菌數(shù)高于其他組。同時(shí)考慮到酵母浸粉來源和質(zhì)量穩(wěn)定，微生物利用和增殖穩(wěn)定[24]。因此，確定酵母浸粉為最佳生長(zhǎng)因子。

圖10 生長(zhǎng)因子對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effect of growth factors on Enterococcus faecium Y1 growth

2.3.6 酵母浸粉添加量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響

由圖11可知，隨著酵母浸粉添加量的增加，菌株Y1的活菌數(shù)呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)酵母浸粉添加量為20 g/L時(shí)，活菌數(shù)最高，為2.05×109CFU/mL。因此，確定最佳酵母浸粉添加量為20 g/L。

圖11 酵母浸粉添加量對(duì)屎腸球菌Y1生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effect of yeast extract powder addition on Enterococcus faecium Y1 growth

2.4 屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析

屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

借助Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，擬合得到三元二次回歸方程：

表3 屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for proliferation medium optimization of Enterococcus faecium Y1

由表4可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P值＞0.05，不顯著，說明該模型能較好地模擬和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)誤差較小。決定系數(shù)R2=0.985 3，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.966 5，說明試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果有98.53%的符合度，只有1.88%不能由該模型來解釋。方程中一次項(xiàng)A和C、交互項(xiàng)AC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)曲面越陡峭，說明在固定一個(gè)因素不變時(shí)，其余兩個(gè)因素的交互作用對(duì)屎腸球菌Y1活菌數(shù)影響越大；相反響應(yīng)曲面越平滑，說明對(duì)屎腸球菌Y1活菌數(shù)影響越小[25]。由圖12可知，乳清粉添加量（B）和酵母浸粉添加量（C）等高線圖呈圓形，表明兩因素間的交互作用不顯著。乳糖添加量（A）和乳清粉添加量（B）、乳糖添加量（A）和酵母浸粉添加量（C）的等高線呈橢圓形，表明兩因素之間交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖12 各因素間交互作用對(duì)屎腸球菌Y1活菌數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.12 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the viable bacteria count of Enterococcus faecium Y1

由Design Expert V8.0.6軟件分析得到屎腸球菌Y1增殖培養(yǎng)基的最佳配方為乳糖添加量10.60 g/L，乳清粉添加量10.30 g/L，酵母浸粉添加量22.23 g/L，理論上預(yù)測(cè)屎腸球菌Y1的活菌數(shù)為2.94×109CFU/mL。

2.4.3 驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果

為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)培養(yǎng)基配方修訂為乳糖添加量11 g/L，乳清粉添加量10 g/L，酵母浸粉添加量22 g/L。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)優(yōu)化的最佳配方進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出屎腸球菌Y1活菌數(shù)的平均實(shí)際值為2.90×109CFU/mL，與理論值相差不大，說明該模型的分析準(zhǔn)確度和可信度較高，重復(fù)性和可操作性較強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法從乳酶生片中生分離得到一株乳酸菌Y1，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為屎腸球菌（Enterococcus faecium），其最適培養(yǎng)條件為初始pH 8.0，生長(zhǎng)溫度37 ℃，接種量1%，最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為乳糖11 g/L，乳清粉10 g/L，酵母浸粉22 g/L，硫酸鎂0.28 g/L，硫酸錳0.18 g/L。在最佳培養(yǎng)條件及最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)所得E.faeciumY1的活菌數(shù)為2.90×109CFU/mL，比優(yōu)化前活菌數(shù)提高了80.12%。