謝全喜，侯楠楠，鹿曉慧，曹 斌，崔海英，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

益生菌是指攝入足夠的劑量時可以對宿主產(chǎn)生有益影響的活的微生物。目前，益生菌已被廣泛應用在動物營養(yǎng)與飼料等行業(yè)中，通過動物采食，益生菌進入機體腸道并有效保持胃腸道的微生態(tài)平衡，同時，具有促消化、提免疫及分泌產(chǎn)生一些維生素類物質供腸道吸收等功能[1-3]。芽孢桿菌屬（Bacillussp.）能夠促生長，增殖有益微生物，維持畜禽健康。目前，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等芽孢桿菌可作為飼料添加劑應用在畜禽養(yǎng)殖中[4]。

芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧并能夠產(chǎn)生具有抗逆性的內生孢子的桿狀細菌[5]，作為農(nóng)業(yè)部允許添加的益生菌之一，具有耐高溫、耐酸堿、易培養(yǎng)、耐貯藏和加工損失少等特點[6]，在微生態(tài)制劑和發(fā)酵飼料上得到廣泛應用。與其他益生菌相比，芽孢桿菌的熱穩(wěn)定性和在低pH值下生存的能力具有很大優(yōu)勢[7]。研究表明，芽孢桿菌在飼料發(fā)酵過程中或在動物消化道內能夠分泌多種酶類，包括蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等，這些酶類能將飼料中無法吸收的抗營養(yǎng)物質分解成小分子物質，提高飼料利用率，促進畜禽的消化吸收[8]。REIS M P等[9]報道指出，日糧添加枯草芽孢桿菌能夠有效促進肉雞對干物質、粗蛋白的消化吸收，提高飼料效率。另外，芽孢桿菌自身能夠分泌具有較強活性的蛋白酶和淀粉酶[10]，因其高產(chǎn)蛋白酶活性而被廣泛應用于改善飼料品質[11-12]，據(jù)不完全統(tǒng)計，來源于芽孢桿菌的酶制劑占整個酶市場的50%，其中應用最廣的是蛋白酶[13]。盧超等[14]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶活性達133.42 U/mL；令利軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌TG116高產(chǎn)堿性蛋白酶，且具有良好的溫度和pH值穩(wěn)定性。但目前益生菌在應用過程中容易受到抗生素的影響，對益生菌的功能產(chǎn)生影響，因此，有必要對益生菌對抗生素的耐藥性展開研究。

本研究以4株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和2株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）為研究對象，通過測定其成胞率、中性蛋白酶活性及對24種抗生素的耐受性，擴展芽孢桿菌的益生理論，為芽孢桿菌的生產(chǎn)及科研提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

4株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（編號BLCC1-0155、BLCC1-0442、BLCC1-0552和BLCC1-0615）、2株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）（編號BLCC1-0441和BLCC1-0588）：山東寶來利來生物工程股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

芽孢桿菌培養(yǎng)基[8]：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH值7.0，固體培養(yǎng)基需要加15.0 g/L瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 試劑

大環(huán)內酯類（紅霉素、羅紅霉素和克拉霉素）、β-內酰胺類（青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟和美羅培南）、喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星）、氨基糖苷類（鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和大觀霉素）、糖肽類（萬古霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素和強力霉素）、氯霉素類（氯霉素）、林可酰胺類（林可霉素）和磺胺類（甲氧嘧啶）共24種藥敏紙片：杭州濱和微生物試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SW-CJ-2F（2）超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成胞率的檢測

將6株芽孢桿菌凍干粉分別接種于芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h作為種子液，備用。

無菌條件下用接種環(huán)蘸取一環(huán)培養(yǎng)好的菌液進行革蘭氏染色，菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的是革蘭氏陰性菌（G-）。根據(jù)油鏡下鏡檢結果判斷芽孢桿菌形成脫落芽孢的數(shù)量，計算其成胞率，其計算公式如下：

1.3.2 中性蛋白酶活性的檢測

發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料的制備[8]：采用生料發(fā)酵。稱取一定量的玉米-豆粕型常規(guī)飼料于1 000 mL三角瓶中，料水比為1.0∶0.4（g∶mL），裝料量為100 g/瓶，按2.0%接種量分別接入1.3.1培養(yǎng)好的芽孢桿菌種子液，每個樣品設3個平行，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進行需氧固體發(fā)酵，分別于發(fā)酵12 h、24 h、36 h和48 h取樣檢測中性蛋白酶活性。

液體發(fā)酵24 h產(chǎn)中性蛋白酶活性和固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶活性檢測均參考國標GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》。

1.3.3 芽孢桿菌對抗生素耐受性的檢測

采用藥敏紙片擴散法檢測芽孢桿菌對24種抗生素的敏感性[16]。具體步驟：用無菌生理鹽水稀釋待檢菌株的24 h培養(yǎng)液至菌體濃度為108CFU/mL，取1 mL稀釋菌液分別加入平皿中，加入15 mL芽孢桿菌固體培養(yǎng)基，迅速搖勻放置待平板凝固后，將藥敏紙片平放于培養(yǎng)基上，靜置20 min后，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用精確至1 mm的直尺測量并記錄抑菌圈直徑，每種抗生素設3個平行，結果取3次平均值。目前，關于芽孢桿菌對抗生素的耐藥性還沒有一個統(tǒng)一標準，抗性判定參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）手冊進行[17]，判定標準見表1。表1中未列出的抗生素均按以下標準進行判定：抑菌圈直徑≤15 mm為耐藥（R）；16～19 mm為中介（I）；抑菌圈直徑≥20 mm為敏感（S）。同時計算耐藥率，其計算公式如下：

表1 菌株對部分抗生素耐藥判斷標準Table 1 Evaluation criteria of strain tolerance to some antibiotics

續(xù)表

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2019處理后，采用SPSS 20.0軟件的ANOVA程序進行顯著性分析，用Fisher氏最小顯著差檢驗（Fisher's least significant difference，LSD）法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。測定結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 6株芽孢桿菌芽孢的形成情況

6株芽孢桿菌液體發(fā)酵24 h后進行鏡檢，結果見圖1，成胞率見表2。

圖1 6株芽孢桿菌發(fā)酵24 h鏡檢結果Fig.1 Microscopic results of 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

表2 6株芽孢桿菌發(fā)酵24 h的成胞率Table 2 Cell formation rate of 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

由圖1及表2可知，菌株BLCC1-0552、BLCC1-0615和BLCC1-0441的成胞率較高，均為98%及以上，幾乎全部成胞，只有個別菌體存在；菌株BLCC1-0155次之，成胞率為80.67%；菌株BLCC1-0588成胞率為50.50%，但有較多死菌體存在；菌株BLCC1-0442成胞率最低，肉眼無可見脫落芽孢。芽孢桿菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工業(yè)生產(chǎn)中的高溫高壓等不利環(huán)境，采用芽孢的形式能高效率、低成本地生產(chǎn)高活性、高密度的芽孢桿菌制劑。

2.2 6株芽孢桿菌發(fā)酵液中中性蛋白酶活性檢測結果

6株芽孢桿菌液體發(fā)酵24 h后測定中性蛋白酶活力，結果見表3。

表3 6株芽孢桿菌發(fā)酵24 h中性蛋白酶活性檢測結果Table 3 Determination results of neutral protease activity produced by 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

由表3可知，菌株BLCC1-0615產(chǎn)中性蛋白酶活力最高，為100.32 U/mL；其次是菌株BLCC1-0552，產(chǎn)中性蛋白酶活力為90.58 U/mL；菌株BLCC1-0441產(chǎn)中性蛋白酶活力為24.72 U/mL，其他菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力較低。在成胞率相同的情況下，地衣芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶活能力低于枯草芽孢桿菌。

2.3 6株芽孢桿菌固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶活性檢測結果

6株芽孢桿菌固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶活性結果見表4。

表4 6株芽孢桿菌固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶活性檢測結果Table 4 Determination results of neutral protease activity of corn-soybean meal type conventional feed produced by 6 strains of Bacillus by solid-state fermentation

由表4可知，6株芽孢桿菌固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶活力以菌株BLCC1-0615最高，發(fā)酵48 h時達到2 154.49 U/g，其次是菌株BLCC1-0552和BLCC1-0441。結合成胞率和中性蛋白酶活力測定結果，選用枯草芽孢桿菌BLCC1-0615、BLCC1-0552和地衣芽孢桿菌BLCC1-0441進行抗生素耐受性研究。

2.4 芽孢桿菌對抗生素耐受性結果

3株芽孢桿菌對24種抗生素的耐受性試驗結果見表5。

表5 3株芽孢桿菌藥敏試驗結果Table 5 Susceptibility tests results of 3 strains of Bacillus

2.4.1 芽孢桿菌對大環(huán)內酯類抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對大環(huán)內酯類抗生素的耐受性見表6。

表6 3株芽孢桿菌對大環(huán)內酯類抗生素耐受性的測定結果Table 6 Determination results of tolerance of 3 strains of Bacillus to macrolide antibiotics

大環(huán)內酯類抗生素是指化學結構中含有內酯環(huán)的一大類抗生素，主要通過阻斷50S亞基23S rRNA內部的肽酰胺轉移酶的活性來抑制細菌蛋白質合成，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑菌性[18]。由表6可知，枯草芽孢桿菌BLCC1-0552和BLCC1-0615對大環(huán)內酯類抗生素表現(xiàn)敏感（S），地衣芽孢桿菌BLCC1-0441對大環(huán)內酯類抗生素表現(xiàn)耐藥（R），兩種類型芽孢桿菌對大環(huán)內酯類抗生素耐藥性不同。

2.4.2 芽孢桿菌對β-內酰胺類抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對β-內酰胺類抗生素的耐受性見表7。

表7 3株芽孢桿菌對β-內酰胺類抗生素耐受性的測定結果Table 7 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to β-lactam antibiotics

β-內酰胺類抗生素是指結構中含有β-內酰胺環(huán)的一類抗生素，通過抑制細菌細胞壁中肽聚糖的形成而使細胞壁破損，水分滲入胞漿導致細菌菌體腫脹、變形、破裂溶解至死亡[19]。是現(xiàn)有抗生素中使用最廣泛的一類，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌性。臨床藥用頻率較高的有青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類等。由表7可知，被試3株芽孢桿菌對青霉素類（青霉素、阿莫西林和氨芐西林）和碳青霉烯類抗生素（美羅培南）耐藥性一致，分別為耐藥型（R）和敏感型（S）；而對頭孢菌素類抗生素（頭孢曲松和頭孢噻肟）耐藥性不一致，枯草芽孢桿菌BLCC1-0552和BLCC1-0615表現(xiàn)為敏感型（S），地衣芽孢桿菌BLCC1-0441表現(xiàn)為中介型耐藥（I）。

2.4.3 芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素的耐受性見表8。

表8 3株芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素耐受性的測定結果Table 8 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to tetracycline antibiotics

四環(huán)素類抗生素由放線菌屬產(chǎn)生或半合成的一類光譜抗生素，廣泛應用于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、細胞內支原體、衣原體和立克次氏體引起的感染[20]。該類抗生素價格低廉、應用方便、抗菌譜廣，被廣泛用作飼料添加劑應用在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[21]。主要通過與細菌胞內核糖體30S亞單位結合，這種有約束力的結合阻斷氨基?；?tRNA的對接，從而抑制細菌蛋白質合成，起到抗菌效果[22]。由表8可知，3株被試芽孢桿菌對四環(huán)素類抗生素耐藥型不一致，但均沒有表現(xiàn)為耐藥型（R）。

2.4.4 芽孢桿菌對喹諾酮類抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對喹諾酮類抗生素的耐受性見表9。

表9 3株芽孢桿菌對喹諾酮類抗生素耐受性的測定結果Table 9 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to quinolone antibiotics

在細菌細胞內，喹諾酮類藥物的作用靶位是脫氧核糖核酸旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ[23]，主要通過抑制其酶活性最終抑制脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）合成而發(fā)揮抗菌作用。喹諾酮類抗生素主要作用于革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌作用較弱[24]。由表9可知，3株被試芽孢桿菌對喹諾酮類抗生素耐藥型一致，表現(xiàn)為敏感型（S），與芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，喹諾酮類抗生素對其抑菌作用較弱相一致。

2.4.5 芽孢桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐受性見表10。

表10 3株芽孢桿菌對氨基糖苷類抗生素耐受性的測定結果Table 10 Determination results of tolerance of 3 strains of Bacillus to aminoglycoside antibiotics

由表10可知，3株芽孢桿菌對氨基糖苷類抗生素具有不同程度的耐藥性。對慶大霉素和卡那霉素耐受性結果一致，均表現(xiàn)為敏感型（S）；對新霉素和大觀霉素耐受性結果一致，均表現(xiàn)為中介型（I）；對鏈霉素耐受性結果不一致，其中枯草芽孢桿菌BLCC1-0552表現(xiàn)為中介型（I），枯草芽孢桿菌BLCC1-0615和地衣芽孢BLCC1-0441表現(xiàn)為敏感型（S）。氨基糖苷類抗生素主要通過抑制一個或多個參與核糖體翻譯的生化步驟來抑制細菌細胞生長，通過與細菌30S核糖體亞基結合，抑制細菌蛋白質合成，從而達到殺菌作用[25]。主要對革蘭氏陰性菌有很強的殺菌作用，抗菌效果明顯[26]。但隨之產(chǎn)生的耐藥問題也日趨嚴重，細菌對其耐藥機制主要有氨基糖苷類修飾酶對抗生素的修飾作用，細菌靶位修飾及藥物的主動外排[27]。但革蘭氏陽性菌芽孢桿菌對氨基糖苷類抗生素中的新霉素、大觀霉素和鏈霉素表現(xiàn)中介型耐藥，具有一定的耐受性，其抑菌機理有待進一步研究。

2.4.6 芽孢桿菌對其他抗生素的耐受性

3株芽孢桿菌對其他抗生素的耐受性見表11。

表11 3株芽孢桿菌對其他抗生素耐受性的測定結果Table 11 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to other antibiotics

由表11可知，3株被試芽孢桿菌對萬古霉素和林可霉素耐藥型一致，分別表現(xiàn)為敏感型（S）和耐藥型（R）；對氯霉素和甲氧嘧啶耐藥型不一致，其中2株枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為敏感型（S）和耐藥型（R），地衣芽孢桿菌BLCC1-0441表現(xiàn)為中介型（I）和敏感型（S）。

2.5 芽孢桿菌對24種抗生素耐藥性的統(tǒng)計結果

3株芽孢桿菌對24種抗生素的耐受性統(tǒng)計結果見表12。

表12 3株芽孢桿菌對24種抗生素耐藥性統(tǒng)計結果Table 12 Statistical results of tolerance of 3 strains of Bacillus to 24 antibiotics

由表12可知，枯草芽孢桿菌BLCC1-0552和BLCC1-0615的耐藥率均為20.83%，低于地衣芽孢桿菌BLCC1-0441（29.17%）。其中枯草芽孢桿菌BLCC1-0552和BLCC1-0615對青霉素類（青霉素、阿莫西林和氨芐西林）、甲氧嘧啶和林可霉素共5種抗生素具有耐藥性；地衣芽孢桿菌BLCC1-0441對大環(huán)內酯類（紅霉素、羅紅霉素和克拉霉素）、青霉素類（青霉素、阿莫西林和氨芐西林）和林可霉素共7種抗生素具有耐藥性，說明兩種類型芽孢桿菌對抗生素耐藥性不完全一致。

3株芽孢桿菌中對24種抗生素敏感率最高的是枯草芽孢桿菌BLCC1-0615，敏感率為70.83%，對氨基糖苷類（鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素）、大環(huán)內酯類（紅霉素、羅紅霉素和克拉霉素）、頭孢菌素類（頭孢曲松和頭孢噻肟）、碳青霉烯類（美羅培南）、喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星）、四環(huán)素類（四環(huán)素和強力霉素）、氯霉素類（氯霉素）和糖肽類（萬古霉素）共17種抗生素表現(xiàn)敏感；其次是枯草芽孢桿菌BLCC1-0552，敏感率為62.50%；敏感率最低的是地衣芽孢桿菌BLCC1-0441，為41.67%。

3 結論

6株芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌BLCC1-0552、BLCC1-0615和地衣芽孢桿菌BLCC1-0441發(fā)酵24 h后成胞率較高，均達到98%；液體發(fā)酵24 h后產(chǎn)中性蛋白酶活性較高，分別為89.94 U/mL、99.32 U/mL和25.40 U/mL；枯草芽孢桿菌BLCC1-0615固體發(fā)酵玉米-豆粕型常規(guī)飼料產(chǎn)中性蛋白酶最高，發(fā)酵48 h時達到2 290 U/g；枯草芽孢桿菌BLCC1-0615對24種抗生素中的17種表現(xiàn)敏感，敏感率最高為70.83%。綜合比較，表現(xiàn)較高成胞率、產(chǎn)中性蛋白酶能力及對抗生素較低耐受性的菌株為枯草芽孢桿菌BLCC1-0615，該菌株具有作為飼料添加劑應用于畜禽飼料中的潛力。