余 萍，趙 迪，張春宇，矯艷平，王婷婷，江 楓

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧 沈陽 110016）

益生菌是一類有益于宿主健康的活性微生物，能夠定植在腸道內(nèi)，具有改善宿主腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老及緩解乳糖不耐受等生理功能[1-3]，常見的益生菌有乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococcus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）等。雙歧桿菌（Bifidobacteriumsp.）是一類常用于食品添加的益生菌，其中的一些種對胃酸和膽汁鹽有較好的耐受性，可有效補(bǔ)充腸道益生菌群，具有維護(hù)腸道生態(tài)平衡和促進(jìn)人體健康的作用，被廣泛應(yīng)用于益生菌乳產(chǎn)品、食品添加劑及醫(yī)藥行業(yè)中[4]。

隨著人們對益生菌的認(rèn)識和需求的不斷提高，學(xué)者們越來越關(guān)注于對益生菌益生特性的研究。研究結(jié)果表明，益生菌具有許多益生作用，如緩解便秘、抗氧化[5-7]、降低血清膽固醇[8-10]、增強(qiáng)人體免疫力[11]、抗糖尿病[12]、輔助緩解乳糖不耐受[13]、抗肥胖[14]、抗抑郁[15]、抗腫瘤[16]等。益生菌的應(yīng)用對人類的健康具有重要的意義。

乳雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道，促進(jìn)腸道健康，提高免疫力，抑制有害菌生長的多種生理功能[17]，但具有較好的耐酸、耐膽鹽等能力是其在腸道內(nèi)發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。因此，本研究對從嬰兒糞便中篩選分離的動物雙歧桿菌乳亞種菌株HCS04-002的益生特性進(jìn)行研究，為其在益生菌產(chǎn)品中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002：篩選自2月齡健康順產(chǎn)男嬰糞便，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏編號為CGMCC No.19509）。

鼠李糖乳桿菌（LGG）、植物乳桿菌（vegestar2.0）：科漢森健康與營養(yǎng)部中國區(qū)；羅伊氏乳桿菌（LR92）：北京多愛特生物科技有限公司；乳雙歧桿菌（BB-12）：北京中柏創(chuàng)業(yè)化工產(chǎn)品有限公司；干酪乳桿菌（LCZ）、瑞士乳桿菌（LH10）：北京柯拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；嗜酸乳桿菌（NCFM）：上海秘藍(lán)生物科技有限公司；發(fā)酵乳桿菌（CECT5716）：百施生物科技有限公司；嗜熱鏈球菌（ST6）、唾液乳桿菌（LS86）：上海交大昂立股份有限公司；德氏乳桿菌保加利亞亞種（LB42）：江蘇微康生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[18]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂200 g。

動物雙歧桿菌乳亞種固體培養(yǎng)基：酵母蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，葡萄糖25 g/L，低聚果糖5 g/L，L-蘋果酸5 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)pH值至7.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

動物雙歧桿菌乳亞種乳糖液體培養(yǎng)基：酵母蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，乳糖20 g/L，L-蘋果酸5 g/L，調(diào)pH至7.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30min。

甘油三酯培養(yǎng)基[19]：將2%的聚乙烯醇水溶液與植物油按體積比3∶1混合，用超聲波處理（控制參數(shù)每次超聲5 s，間隔時間5 s，共超聲70次）后混合均勻制成植物油乳化液，作為甘油三酯的來源。將植物油乳化液按5%的比例加入到乳雙歧桿菌培養(yǎng)基中，調(diào)pH值至7.2±0.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

膽鹽（色譜級）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；胃蛋白酶（酶活1 200萬U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鄰硝基酚（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；聚乙烯醇（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司；甘油三酯試劑盒：南京建成生物試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋、DHP-360/420電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；721型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-10CA生物顯微鏡：上海佑科儀器儀表有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；TGL-16M低溫高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司；LAI-3DT厭氧工作站：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐酸試驗

以pH為6.2～6.4的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，將傳代三次的菌液（109CFU/mL）按照10%（V/V）的接種量分別接種于pH分別為2.0、3.0的MRS液體培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基中，39 ℃條件下靜置培養(yǎng)17 h，取樣。用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1 000 μL移入無菌空平皿中，將冷卻至48 ℃的MRS固體培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。每個稀釋度2次重復(fù)，39 ℃靜置培養(yǎng)48～72 h后，按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》中的方法進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：N′為不同pH條件下的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為空白對照的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.2 耐膽鹽試驗

以不含牛膽鹽的的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，將傳代三次的菌液按照10%（V/V）的接種量分別接種于含有0.3%、0.5%、1.0%和1.5%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，39 ℃條件下靜置培養(yǎng)17 h，取樣，測定活菌數(shù)，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：N″為不同膽鹽含量下的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為空白對照的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.3 模擬胃液試驗

將傳代三次的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、4 ℃、10 min）獲得菌泥，用磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗2次，獲得的菌泥重懸于10 mL模擬胃液中，39 ℃條件下消化3 h，分別于0 h、3 h取樣測活菌數(shù)，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：N為在模擬胃液中消化0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N#為在模擬胃液中消化3 h后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 模擬腸液試驗

將傳代三次的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、5 ℃、10 min）獲得菌泥，用PBS緩沖液沖洗2次，獲得的菌泥重懸于10 mL人工腸液中，39 ℃條件下培養(yǎng)4 h，于0 h、2 h、4 h分別取樣測活菌數(shù)，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：N為在模擬腸液中消化0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N*為在模擬腸液中培養(yǎng)2 h、4 h后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.5 緩解乳糖不耐受功能試驗

一級培養(yǎng)：取1環(huán)菌液于動物雙歧桿菌乳亞種固體培養(yǎng)基平板劃線，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)48 h。

二級培養(yǎng)：將一級培養(yǎng)結(jié)束的單菌落接種至5 mL動物雙歧桿菌乳亞種乳糖液體培養(yǎng)基中，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)20 h。

三級培養(yǎng)：按照5%（V/V）的接種量，將二級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至100 mL動物雙歧桿菌乳亞種乳糖液體培養(yǎng)基中，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)20 h。采用ONPG法測定β-半乳糖苷酶活力[20]。

β-半乳糖苷酶活力單位定義：在30 ℃每分鐘水解釋放1 μmol ONP所需的酶量為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.6 降甘油三酯體外試驗

一級培養(yǎng)：取1環(huán)菌液于動物雙歧桿菌乳亞種固體培養(yǎng)基平板劃線，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)48 h。

二級培養(yǎng)：將一級培養(yǎng)結(jié)束的單菌落接種至10 mL動物雙歧桿菌乳亞種液體培養(yǎng)基中，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)20 h。

三級培養(yǎng)：取10 mL二級種子液接種至200 mL動物雙歧桿菌乳亞種液體培養(yǎng)基中，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)17 h。

將三級培養(yǎng)的菌液以3%的接種量接種于100 mL甘油三酯培養(yǎng)基中，39 ℃條件下厭氧、靜置培養(yǎng)24 h，采用甘油三酯試劑盒測定甘油三酯（triglyceride，TG）含量[21-22]。同時，以未接種菌液的甘油三酯培養(yǎng)基的TG含量為空白對照，計算菌株HCS04-002的TG降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HCS04-002的耐酸試驗結(jié)果

菌株HCS04-002在pH 2.0和3.0條件下培養(yǎng)17 h后的活菌數(shù)及存活率見表1。

表1 菌株HCS04-002的耐酸試驗結(jié)果Table 1 Results of acid tolerance tests of strain HCS04-002

由表1可知，菌株HCS04-002在pH 3.0、39 ℃條件下培養(yǎng)17 h，活菌數(shù)相對于空白對照雖有下降，但活菌對數(shù)值仍維持在5.6以上，存活率達(dá)61.76%；在pH 2.0、39 ℃條件下培養(yǎng)17 h，活菌數(shù)相對于pH 3.0略有下降，活菌對數(shù)值降至5.47，存活率仍能達(dá)到60.11%。說明該菌株對酸環(huán)境具有一定的耐受能力。

2.2 菌株HCS04-002的耐膽鹽試驗結(jié)果

菌株HCS04-002經(jīng)0.3%、0.5%、1.0%和1.5%牛膽鹽處理17 h后的活菌數(shù)及存活率見表2。

表2 菌株HCS04-002的耐膽鹽試驗結(jié)果Table 2 Results of bile salt tolerance tests of strain HCS04-002

由表2可知，隨著牛膽鹽含量的增加，菌株HCS04-002的存活率呈下降趨勢，當(dāng)牛膽鹽含量達(dá)到1.5%時，存活率仍能達(dá)到72.64%，說明該菌株耐膽鹽能力較強(qiáng)，有利于其在宿主腸道中的定植。

2.3 菌株HCS04-002的模擬胃液試驗結(jié)果

菌株HCS04-002經(jīng)模擬胃液處理3 h后的活菌數(shù)及存活率見表3。

表3 菌株HCS04-002模擬胃液試驗結(jié)果Table 3 Results of simulated gastric fluid tests of strain HCS04-002

由表3可知，菌株HCS04-002在模擬胃液中的存活能力較強(qiáng)，經(jīng)模擬胃液處理3 h，存活率高達(dá)99.89%。

2.4 菌株HCS04-002的模擬腸液試驗結(jié)果

菌株HCS04-002經(jīng)模擬腸液處理一段時間后的活菌數(shù)及存活率見表4。

表4 菌株HCS04-002模擬腸液試驗結(jié)果Table 4 Results of simulated intestinal fluid tests of strain HCS04-002

由表4可知，隨著處理時間的增加，活菌數(shù)對數(shù)值基本沒有下降，存活率幾乎達(dá)100.00%，說明該菌株在模擬腸液環(huán)境中存活能力非常強(qiáng)。

2.5 菌株HCS04-002緩解乳糖不耐受功能試驗結(jié)果

菌株HCS04-002與部分商業(yè)菌株的β-半乳糖苷酶活力測定結(jié)果見表5。

β-半乳糖苷酶又稱乳糖酶，能夠催化β-D-半乳吡喃糖苷水解或者轉(zhuǎn)糖基化[23]，水解乳制品中的乳糖，解決人們在飲用乳制品時出現(xiàn)的乳糖消化吸收差的問題。由表5可知，與現(xiàn)有部分商品菌株對照，菌株HCS04-002的β-半乳糖苷酶活力最高，為0.784 U/mL，比丹麥科漢森的動物雙歧桿菌乳亞種BB-12提高了7%，比意大利薩科的羅伊氏乳桿菌LR92提高了57%。說明動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002具有較好的乳糖酶活力，對緩解乳糖不耐受具有一定的作用。

表5 菌株HCS04-002的β-半乳糖苷酶活力測定結(jié)果Table 5 Determination results of β-galactosidase activity of strain HCS04-002

2.6 菌株HCS04-002降甘油三酯體外試驗結(jié)果

菌株HCS04-002與部分商業(yè)菌株的甘油三酯降解率測定結(jié)果見表6。

表6 菌株HCS04-002甘油三酯降解率測定結(jié)果Table 6 Determination results of triglyceride degradation rate of strain HCS04-002

由表6可知，動物雙歧桿菌乳亞種菌株HCS04-002的TG降解率最高，為43.0%，相比對照菌株中甘油三酯降解率最高的動物雙歧桿菌乳亞種BB-12菌株，其TG降解率提高9%；相比植物乳桿菌vegestar 2.0，其TG降解率提高20%，說明該菌株具有較好的降解甘油三酯能力。

3 討論

胃酸和膽鹽具有抗菌作用，乳酸菌攝入人體內(nèi)后，不僅要通過惡劣的胃液，還要抵抗來自胰腺的膽鹽，能否耐受胃酸消化作用和膽鹽環(huán)境并有一定數(shù)量活菌進(jìn)入腸道粘附定植是其發(fā)揮益生作用的首要因素。因此，對酸和膽鹽及胃腸液的耐受能力是評價益生菌功能性的重要指標(biāo)。有報道指出，在pH3.0、膽鹽0.3%環(huán)境下存活能力是衡量菌株耐受胃腸道的標(biāo)準(zhǔn)之一[24]。菌株動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002經(jīng)耐酸耐膽鹽試驗存活率仍在60%以上，在人工胃液和人工腸液中處理3 h，能保持99%以上的存活率，表明其能夠有效穿過胃腸液發(fā)揮其益生作用。

乳糖不耐受是一個全球性問題，尤其在中國，是乳糖不耐受的高發(fā)地。乳糖在人體內(nèi)無法被直接吸收，需經(jīng)乳糖酶消化分解成葡萄糖和半乳糖才能夠被人體吸收[25]。人體中乳糖酶的活性和分泌量受多種繼發(fā)性因素的影響，導(dǎo)致人體無法消化乳制品中的乳糖，部分患者出現(xiàn)腹痛、脹氣和腹瀉等消化不良癥狀，因此乳糖酶制劑將不斷被乳糖不耐受人群所了解并普及應(yīng)用。本試驗中動物雙歧桿菌乳亞種菌株HCS04-002具有0.784 U/mL的β-半乳糖苷酶活力，有望應(yīng)用于乳糖酶制劑產(chǎn)品中，為解決乳糖不耐受問題提供更多選擇。

本試驗動物雙歧桿菌乳亞種菌株HCS04-002還具有一定的甘油三酯降解能力。世界貿(mào)易組織（world trade organization，WTO）預(yù)測，到2030年心血管疾病將是導(dǎo)致死亡的主要原因，影響全世界約2.36億人們的健康[26]。甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。但如果甘油三酯過量，則可造成動脈硬化、冠心病、心梗、腦卒等，與正常血脂水平人群相比，高血脂人群具有高出3倍的心臟病誘發(fā)風(fēng)險。利用菌株HCS04-002的甘油三酯降解能力，可應(yīng)用于降血脂保健藥品及功能食品的制備。

4 結(jié)論

動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002具有良好的耐逆環(huán)境能力，能夠在pH2.0、膽鹽1.5%的嚴(yán)苛條件下保持較高的存活率；能夠耐受人工胃液和人工腸液的作用，以較高的存活率進(jìn)入腸道有效發(fā)揮益生作用；具有較高的乳糖酶活力，對乳糖不耐受具有緩解作用；具有甘油三酯降解功能，在降血脂產(chǎn)品方面有一定的應(yīng)用前景。