邊名鴻，許 強(qiáng)，周陽(yáng)子，王靈香，李 蓉，程鑫凱

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.宜賓五糧液仙林生態(tài)酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644000）

桑樹(shù)在我國(guó)種植廣泛，桑葚作為桑蠶業(yè)的副產(chǎn)物，因其成分復(fù)雜、功效良多而深受人們喜愛(ài)。作為一種藥食兩用的水果，桑葚含有可溶性固形物、還原糖、醇類、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、萜烯類化合物等，不僅有保護(hù)肝臟、腎臟，治療高血壓、糖尿病等功效，還可作為食物原料和釀酒原料[1-3]。由于桑葚鮮果采摘期、貨架期短，極易腐壞變質(zhì)，因此深加工是桑葚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必經(jīng)之路[4]。以桑葚為原料釀造果酒，既可保留桑葚的固有風(fēng)味成分和營(yíng)養(yǎng)成分，還延長(zhǎng)了貨架期，提高了經(jīng)濟(jì)效益，是帶動(dòng)果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展、增加果農(nóng)收益的有效途徑[5]。但桑葚存在果皮薄、香氣成分較多但含量低、釀制的果酒香氣較弱等問(wèn)題，如何通過(guò)發(fā)酵增強(qiáng)其特征風(fēng)味是目前的研究熱點(diǎn)。

目前果酒釀造過(guò)程中，通常選用成熟的商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行發(fā)酵，以保證酒品的穩(wěn)定性。以純種酵母進(jìn)行發(fā)酵，雖然具有發(fā)酵過(guò)程易于控制的優(yōu)點(diǎn)，但是果酒香氣淡薄，風(fēng)味復(fù)雜性不夠，且口感單一，影響果酒潛在的多樣性。祝霞等[6-7]發(fā)現(xiàn)，如果在果酒發(fā)酵時(shí)添加一定量的非釀酒酵母，可在一定程度上改善果酒酒質(zhì)，增加果酒的香氣及風(fēng)味的復(fù)雜性。因此，對(duì)非釀酒酵母進(jìn)行篩選并與釀酒酵母一同混合發(fā)酵是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

非釀酒酵母曾一度被認(rèn)為是果酒發(fā)酵過(guò)程中的有害菌群，但隨著果酒釀造研究的深入，非釀酒酵母在果酒中的積極作用受到了學(xué)者們的重視[8-9]。它們可以合成多種酶，將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯、酸、高級(jí)醇等風(fēng)味物質(zhì)，改變酒體中有機(jī)酸的比例、降低乙酸的含量，致使果酒的果香、花香等特色芳香及特征風(fēng)味增強(qiáng)[10]。本研究從桑葚及桑葚園土壤樣品中篩選出性能較優(yōu)的酵母菌，通過(guò)與釀酒酵母混菌發(fā)酵桑葚汁，以期篩選出一株適合于桑葚酒發(fā)酵的非釀酒酵母。并對(duì)非釀酒酵母進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定與相關(guān)生長(zhǎng)特性研究，為該非釀酒酵母在桑葚果酒中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑園土壤樣品、成熟桑葚果實(shí)樣品：采樣于四川省宜賓市雪峰園林、閬中蠶種場(chǎng)桑樹(shù)基地；桑葚（云桑二號(hào)）：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BO213：法國(guó)LAFFORT公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

硫酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀（均為分析純）：重慶川東化工試劑廠；次甲基藍(lán)（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-1電子萬(wàn)用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；AR1140電子天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司；Thermo868 pH計(jì)：熱電（上海）科技儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑葚酒發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)

桑葚→打漿→調(diào)整成分→添加SO2→入罐→接種酵母→前發(fā)酵→后發(fā)酵→低溫靜置→陳釀→澄清處理→粗濾→精濾→桑葚酒

（1）果酒酵母的活化：把果酒酵母與等質(zhì)量糖混合，溶于10倍質(zhì)量、溫度35～40 ℃的水中攪拌均勻，靜置20 min，隨后加入2～3倍其體積的用于釀酒的果汁進(jìn)行稀釋即活化完畢。

（2）桑葚打漿：新鮮桑葚挑除腐爛、變質(zhì)的桑葚，去除石子、樹(shù)葉等異物。將適量的桑葚在自來(lái)水中進(jìn)行沖洗，去掉表面的泥土及污垢，然后用清水浸泡，瀝干后于打漿機(jī)中低速打漿。

（3）調(diào)整成分：將打漿后的桑葚漿，按照實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整料水比；用檸檬酸調(diào)至3.5～4.5；添加白砂糖調(diào)整糖度至發(fā)酵液中糖含量為240 g/L。

（4）添加偏重亞硫酸鉀：添加偏重亞硫酸鉀使發(fā)酵液中SO2含量達(dá)到30 mg/L。

（5）接種發(fā)酵：按照2%（V/V）接種量接種已活化的果酒酵母，充分混勻。溫度控制在28 ℃，發(fā)酵8 d，定時(shí)進(jìn)行理化測(cè)定。

（6）后發(fā)酵：用8層紗布進(jìn)行簡(jiǎn)單過(guò)濾，在4～8 ℃條件下發(fā)酵7 d。

（7）陳釀：發(fā)酵結(jié)束后，在4 ℃條件下避光陳釀30 d，期間每隔7 d倒罐一次。

1.3.2 非釀酒酵母的篩選

分別取10 g桑葚（桑葚土壤）加入裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24h后，稀釋涂布，30 ℃培養(yǎng)2 d。利用美藍(lán)染色觀察記錄細(xì)胞形態(tài)特征、出芽情況。

酵母的一級(jí)篩選：采用杜氏管發(fā)酵法發(fā)酵，觀察各菌株產(chǎn)氣速度并記錄24 h與48 h的產(chǎn)氣量，比較各菌株發(fā)酵力，記錄發(fā)酵5 d后產(chǎn)酒情況，選擇酒精度低于5%vol的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)[11]。

酵母的二級(jí)篩選：將二級(jí)篩選中表現(xiàn)較好的酵母種子液接種到桑葚汁中，28 ℃發(fā)酵7 d，以桑葚汁為空白對(duì)照組，對(duì)桑葚酒進(jìn)行感官品評(píng)。

1.3.3 非釀酒酵母的復(fù)篩

將分離得到的酵母菌株分別接種于糖度調(diào)為20%的桑葚汁中，與BO213釀酒酵母以1∶1混菌發(fā)酵，28 ℃發(fā)酵7 d，測(cè)定總酯、總酸、還原糖、酒精度、揮發(fā)酸含量，并進(jìn)行感官品評(píng)及GC-MS分析對(duì)各菌株的發(fā)酵情況進(jìn)行對(duì)比分析。以釀酒酵母單菌發(fā)酵為空白對(duì)照組。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取該酵母基因組DNA，參照TAPIA-TUSSELLR等[12]的方法，采用酵母菌通用引物ITS1F：5'-CTTGGT-CATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS4B：5'-CAGGAGACTT-GTACACGGTCCAG-3'對(duì)5.8S rDNA-ITS序列進(jìn)行基因擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)進(jìn)而明確其種系型。利用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1.3.5 非釀酒酵母的生物學(xué)特性研究

參照范光森等[13]的方法研究酵母菌的生長(zhǎng)曲線、二氧化硫耐受性，乙醇耐受性、生長(zhǎng)溫度范圍、pH范圍。

1.3.6 測(cè)定方法

殘?zhí)呛?、總酸含量、揮發(fā)酸、總酯含量、游離二氧化硫測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[14]的方法。酒精度測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[15]的方法。揮發(fā)性風(fēng)味成分及感官品評(píng)：參照曾霞等[16]的方法。微生物總數(shù)檢測(cè)：使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 非釀酒酵母的篩選

2.1.1 非釀酒酵母的一級(jí)篩選

將20份樣品進(jìn)行富集與分離純化，共得到72株疑似酵母菌，將其進(jìn)行一級(jí)篩選。產(chǎn)氣能力強(qiáng)弱是衡量酵母發(fā)酵速度快慢的一個(gè)重要指標(biāo)，由表1可知，發(fā)酵24 h后，72株酵母菌均有產(chǎn)氣，其中23株酵母產(chǎn)氣較多，培養(yǎng)至48 h時(shí)，72株酵母菌均有產(chǎn)氣，其中36株酵母產(chǎn)氣較多，說(shuō)明這些酵母菌在厭氧化境下起酵速度較快、發(fā)酵性能較強(qiáng)。

表1 篩選酵母的產(chǎn)氣能力Table 1 Gas production capacity of screened yeasts

對(duì)產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的36株菌進(jìn)行酒精發(fā)酵研究，結(jié)果如表2所示。由表2可知，發(fā)酵5 d后，共有13株酵母產(chǎn)酒精度在5%vol以下。非釀酒酵母具有發(fā)酵能力強(qiáng)，但產(chǎn)酒能力低的特點(diǎn)，因此選擇發(fā)酵能力強(qiáng)而產(chǎn)酒能力低的13株酵母（編號(hào)為JM-1～JM-13）進(jìn)行下一步篩選。

表2 篩選酵母的產(chǎn)酒能力Table 2 Alcohol production capacity of screened yeasts

2.1.2 非釀酒酵母的二級(jí)篩選

由表3可以看出，將13株酵母接入桑葚汁中發(fā)酵后，通過(guò)嗅聞發(fā)現(xiàn)，菌株JM-1、JM-7、JM-8、JM-13果香較好，與桑葚果實(shí)香味契合，可接受性較高。其中菌株JM-7果香尤為突出，典型性強(qiáng)。選擇菌株JM-1、JM-3、JM-4、JM-7、JM-8、JM-9、JM-13七株可接受度在7分以上的酵母進(jìn)行下一步篩選。

表3 篩選酵母的產(chǎn)香結(jié)果Table 3 Results of aroma produced by screened yeasts

2.1.3 非釀酒酵母的復(fù)篩

混菌發(fā)酵對(duì)桑葚酒酒體理化指標(biāo)有一定影響，并且不同酵母混菌發(fā)酵對(duì)桑葚酒的影響效果不同。由表4可知，所選7株酵母與釀酒酵母BO213混菌發(fā)酵，得到的桑葚酒酒精度均在11%vol以上；菌株JM-1和JM-7與菌株BO213混菌發(fā)酵對(duì)糖利用較徹底，其余桑葚酒均符合NYT1508—2017《綠色食品果酒》中干型果酒標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)比總酯含量可以看出，混菌發(fā)酵有利于酒體中總酯的提升。對(duì)比8款桑葚酒的感官品評(píng)結(jié)果可以看出，菌株JM-7與BO213混菌發(fā)酵感官品評(píng)得分最高，體現(xiàn)有典型桑葚果香并略帶優(yōu)雅酯香。而菌株JM-1、JM-4、JM-8與BO213混菌發(fā)酵后，口感與香味較BO213單菌發(fā)酵的桑葚酒要差，原因可能是非釀酒酵母與釀酒酵母之間產(chǎn)生了一定的抑制作用，使得酵母發(fā)酵能力下降[18]。

表4 混菌發(fā)酵桑葚酒的理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical indexes of mulberry wine fermented by mixed yeasts

2.2 桑葚酒風(fēng)味物質(zhì)分析

不同酵母發(fā)酵性能存在差異，對(duì)果酒香氣的貢獻(xiàn)也明顯不同，這主要是因?yàn)椴煌湍妇?xì)胞內(nèi)有著不同的酶促反應(yīng)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致發(fā)酵酒體中香味物質(zhì)相差巨大[19-20]。由表5可以看出，異戊醇、辛酸乙酯、苯乙醇在香味物質(zhì)中占比最高，是桑葚酒香味成分的主要物質(zhì)，在酒體放香中起到很大作用。異戊醇在酒體香味物質(zhì)中含量比例過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酒體風(fēng)味不協(xié)調(diào)，產(chǎn)生苦味，含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致飲酒后頭痛，混菌發(fā)酵中異戊醇的占比均有降低。菌株JM-7與JM-9兩株酵母產(chǎn)乙酸乙酯與乙酸辛酯能力較強(qiáng)，菌株JM-1產(chǎn)苯乙醇能力較強(qiáng)。結(jié)合發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果、感官品評(píng)與理化指標(biāo)，綜合選擇酵母JM-7作為桑葚發(fā)酵的非釀酒酵母菌株。

表5 混菌發(fā)酵桑葚酒風(fēng)味物質(zhì)成分分析結(jié)果Table 5 Analysis results of flavor components of mulberry wine fermented by mixed yeasts

2.3 菌株JM-7分子生物學(xué)

提取菌株JM-7的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，得到約600 bp的片段，清晰可見(jiàn)，無(wú)雜帶，可用于5.85S rDNAITS測(cè)序，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖1 菌株JM-7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of strain JM-7

圖2 基于ITS基因序列菌株JM-7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain JM-7 based ITS gene sequences

由圖2可知，菌株JM-7與2株異常威克漢姆酵母聚在一起，其相似度為98%。將測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果將該菌株鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anmalus）。

2.4 菌株JM-7的生長(zhǎng)曲線

由圖3可以看出，菌株JM-7生長(zhǎng)迅速，延滯期較短，5 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，36 h到達(dá)平穩(wěn)期。

圖3 菌株JM-7的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain JM-7

2.5 菌株JM-7的耐受性分析

2.5.1 溫度耐受性

發(fā)酵溫度對(duì)酵母的生長(zhǎng)和增殖有很大影響，對(duì)果酒的香氣有很大影響。由圖4可知，菌株JM-7在28 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)酵母仍能生長(zhǎng)。發(fā)酵溫度為12 ℃時(shí)，酵母生長(zhǎng)明顯受到抑制。果酒前發(fā)酵及后發(fā)酵溫度范圍16～32 ℃，該酵母能滿足發(fā)酵要求。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株JM-7生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on strain JM-7 growth

2.5.2 pH耐受性

pH對(duì)酵母生長(zhǎng)與發(fā)酵有較大影響，能影響酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及生物酶活性[21]。從圖5可以看出，菌株JM-7耐酸性較強(qiáng)，pH6.0為最適生長(zhǎng)pH。果酒發(fā)酵環(huán)境為酸性，pH 3～4.5之間，菌株JM-7雖然在低pH的環(huán)境下，生長(zhǎng)受到一定影響，但依舊能達(dá)到1.0×108CFU/mL，能較好地適應(yīng)果酒發(fā)酵。

圖5 不同pH對(duì)菌株JM-7生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different pH on strain JM-7 growth

2.5.3 酒精度耐受性試驗(yàn)

酒精是酵母的產(chǎn)物，也是酵母生長(zhǎng)的抑制劑和毒素[22]。酒精發(fā)酵過(guò)程中，非釀酒酵母在發(fā)酵前期占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但隨著發(fā)酵產(chǎn)的酒精越來(lái)越多，其優(yōu)勢(shì)被釀酒酵母所替代。因此需要非釀酒酵母對(duì)酒精有一定的耐受性，增加酵母的存活幾率，更多的釋放酶或其他酯類物質(zhì)。果酒發(fā)酵酒精度一般在7%vol～13%vol。從圖6可以看出，菌株JM-7的酒精耐受性較弱，在酒精度≥8%vol的環(huán)境中，菌株JM-7的生長(zhǎng)就受到了嚴(yán)重的抑制，因此，作為混釀菌株，需要盡量避免高酒精度對(duì)菌體帶來(lái)抑制作用[23-25]。

圖6 不同酒精度對(duì)菌株JM-7生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different alcohol content on strain JM-7 growth

2.5.4 二氧化硫耐受性

圖7 不同二氧化硫濃度對(duì)菌株JM-7生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of different sulfur dioxide concentration on strain JM-7 growth

果酒發(fā)酵環(huán)境中SO2含量一般在30～50 mg/L，在果實(shí)霉變、損壞的情況下可以將SO2含量提高至80～100 mg/L。菌株JM-7在SO2含量為100 mg/L發(fā)酵時(shí)受抑制不明顯，表明其SO2耐受性很好。

3 結(jié)論

通過(guò)杜氏管發(fā)酵、酒精發(fā)酵與感官品評(píng)對(duì)桑葚及桑葚園土壤中存在的酵母進(jìn)行篩選，最終確定一株較適合桑葚酒發(fā)酵的非釀酒酵母，經(jīng)鑒定為異常威克漢遜酵母（Wick erhamomyces anmalus）。其與釀酒酵母BO213混釀的桑葚酒感官評(píng)分為90.2分，總酯含量為3.21 g/L，還原糖含量為3.9 g/L，酒精度、總酸、揮發(fā)酸分別為11.7%vol、7.97 g/L、0.51 g/L。研究菌株JM-7生長(zhǎng)曲線及耐受性發(fā)現(xiàn)，該酵母生長(zhǎng)速率快，5 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，36 h達(dá)到穩(wěn)定期，最高菌體濃度為4.5×108CFU/mL，對(duì)溫度、pH、SO2都有較好的耐受性，在16～36 ℃、pH2～10、SO2質(zhì)量濃度0～100 mg/L均能正常生長(zhǎng)，但對(duì)酒精的耐受性較差，在酒精度為8%vol時(shí)生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，在12%vol時(shí)不能生長(zhǎng)。在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，后續(xù)研究可優(yōu)化該酵母發(fā)酵桑葚酒的工藝并研究其發(fā)酵過(guò)程，促進(jìn)桑葚酒品質(zhì)的提升及品類的豐富。