高世南，徐志華，李 楊，雷勇輝，孫燕飛*

（1.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

馬奶發(fā)酵后的酸馬奶是具有草原特色的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品。酸馬奶又稱為馬奶酒、策勒（我國內(nèi)蒙古自治區(qū)常用）、艾日格（蒙古國常用）等，是以新鮮馬奶為原料，結(jié)合自然發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制成的一種古老的乳酸菌保健品[1]。在新疆地區(qū)的哈薩克族和蒙古族牧民家庭中，至今還保留著制作和飲用酸馬奶的習(xí)俗[2]。新鮮馬奶自采集后的短時(shí)間內(nèi)，在含有的多種微生物菌群共同互助作用下會(huì)自然發(fā)酵產(chǎn)生口味變酸的現(xiàn)象，成為酸味的乳制品[3]。酸馬奶風(fēng)味的改變和其中的發(fā)酵微生物有密切聯(lián)系，酸馬奶中的發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括多種類型的乳酸菌（如嗜溫乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌、乳球菌、嗜熱乳桿菌等），酵母菌（如乳糖發(fā)酵酵母、非乳糖發(fā)酵酵母、單孢酵母等）以及其他未鑒定出的菌種[4]。

自1895年對酸馬奶自然發(fā)酵過程中起重要作用微生物的研究開始，許多研究人員已經(jīng)對中國新疆地區(qū)[5]、內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)[6-7]、蒙古國[8]等的酸馬奶采用了包括傳統(tǒng)鑒定培養(yǎng)、焦磷酸高通量測序技術(shù)、Illumination MiSeq高通量測序技術(shù)、Pacbio SMRT第三代測序技術(shù)等在內(nèi)的方法研究酸馬奶中微生物群落多樣性，這些研究大多數(shù)集中于乳酸菌菌群多樣性，分析發(fā)酵酸馬奶中乳酸菌屬在發(fā)酵過程中豐富度和多樣性變化。這表明新鮮馬奶在采集后的自然發(fā)酵過程中，乳酸菌菌群發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，馬奶中蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源。

近年來，許多研究人員利用微生物菌劑改良鹽堿地并取得了良好效果：逄煥成等[9]通過玉米盆栽試驗(yàn)，表明施用微生物制劑能夠降低鹽堿土的pH和含鹽量，并對玉米的株高和地上部分干物質(zhì)的積累有促進(jìn)作用；王維華等[10]對不同鹽梯度的土壤施用乳酸菌菌肥，結(jié)果表明乳酸菌菌肥可以提高鹽脅迫下其他微生物的活性；侯景清等[11]以西紅柿為材料進(jìn)行田間試驗(yàn)，認(rèn)為施加乳酸菌復(fù)合制劑能夠顯著降低鹽堿土的pH，增加土壤養(yǎng)分，并且能夠降低土壤中病原微生物的數(shù)量。這顯示了乳酸菌菌劑對于改良鹽堿土具有較大的應(yīng)用潛力。

本研究選用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，分析了采集于新疆那拉提大草原的新鮮馬奶在自然發(fā)酵變酸后細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)；并對其可培養(yǎng)優(yōu)勢菌群（乳酸菌）進(jìn)行分離純化鑒定，為將來將其應(yīng)用在新疆鹽堿地改良方面奠定基礎(chǔ)，亦為新疆酸馬奶中乳酸菌資源開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

將采集于新疆伊犁新源縣那拉提草原的新鮮馬奶分裝入無菌容器中，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[12]：酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH 6.2～6.4。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，pH 7.4～7.6。

糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：溴甲酚紫（1.6%）1 mL，肉膏5.0 g/L，糖（或醇）1%，蛋白胨10.0 g/L，pH7.6。

1.1.3 主要試劑

Taq酶（5 U/μL）：大連TAkaRa公司；氯化鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、檸檬酸氫二銨、吐溫-80、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、15%過氧化氫、結(jié)晶紫染液、番紅染液、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、瓊脂糖、TE緩沖液等（均為分析純或生化試劑）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；RS-232精密電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；FroFleX聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏設(shè)備實(shí)驗(yàn)有限公司；HY-5A回旋式振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸馬奶可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)細(xì)菌菌群高通量測序分析

無菌條件下選擇適量酸馬奶樣品與蒸餾水按照體積比為1∶10進(jìn)行稀釋，將稀釋好并振蕩均勻的酸馬奶樣品選擇部分分批次進(jìn)行0.22 μm的濾膜抽濾：樣品標(biāo)號后，使用減壓抽濾裝置進(jìn)行振蕩液抽濾富集；待錐形瓶內(nèi)的所有振蕩液抽濾完畢，用干凈的分裝袋封存濾膜送樣至上海美吉生物公司完成高通量測序。樣本的16S rDNA V4區(qū)（引物為515F和806R）高通量測序后，對優(yōu)化序列在97%水平上歸并劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），將高質(zhì)量豐度的序列作為該OTU的代表性序列，相似度大于97%的序列將聚為同一個(gè)OTU，用于細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的分類地位鑒定，在不同分類水平上分析該樣品中細(xì)菌群落的含量及種群結(jié)構(gòu)差異[13]。

1.3.2 Alpha多樣性分析

對新疆伊犁那拉提大草原酸馬奶高通量測序結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性的相關(guān)分析，應(yīng)用QIIME（1.8.0）軟件平臺(tái)計(jì)算酸馬奶樣本細(xì)菌群落的生物多樣性，繪制稀疏曲線，由此來判定當(dāng)前樣本的測序深度是否能夠完全呈現(xiàn)該菌群群落樣本所包含的微生物多樣性。超（Chao）1指數(shù)用來評估物種總數(shù)，ACE指數(shù)估計(jì)群落中包含的OTU數(shù)目，兩者主要是側(cè)重表現(xiàn)群落豐富度；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)評估樣本中群落多樣性。目的在于對OTU豐度矩陣中的酸馬奶樣本在90%的最低測序水平深度下，隨機(jī)抽取樣本后，使用平臺(tái)運(yùn)算上述4種多樣性指數(shù)。

1.3.3 酸馬奶中乳酸菌的分離純化和保藏

利用MRS分離鑒定培養(yǎng)基，滅菌后與乳酸菌培養(yǎng)的同等條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)24 h，排除培養(yǎng)基污染因素，將酸馬奶按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋分離，移取稀釋液0.1 mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～72 h[14]。根據(jù)乳酸菌菌落和菌體形狀圓形、表面凸起、邊緣光滑、顏色呈乳白色等特征鏡檢確認(rèn)后[15]，隨機(jī)挑取不同的疑似單菌落，平板劃線純化2～3次，將純化后的疑似乳酸菌于MRS斜面培養(yǎng)，4 ℃干燥冷藏。

1.3.4 分離菌株的生理生化鑒定

將分離純化后的單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察乳酸菌菌落形態(tài)特征和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶接觸實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及生長溫度實(shí)驗(yàn)，對菌株進(jìn)行初步鑒定。最后依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗(yàn)陰性的菌株暫時(shí)認(rèn)定為乳酸菌[16]，進(jìn)行下一步的基因型分子鑒定分析，給疑似菌株編號并采用斜面4 ℃低溫保藏。

1.3.5 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用傳統(tǒng)DNA抽提法（酚-氯仿法）[17]，提取酸馬奶樣品中分離純化得到的乳酸菌的總DNA。將抽提的樣本DNA進(jìn)行濃度檢測，選擇OD260nm/OD280nm=1.8～2.0且波長260 nm處有明顯吸收峰的樣本，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增16S rDNA全長PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）序列比對，用Mega軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸馬奶中OTU劃分和細(xì)菌多樣性組成分析

通過Illumination MiSeq高通量測序，酸馬奶樣品中的菌群微生物多樣性指數(shù)如表1所示。由表1可知，總共產(chǎn)生了高質(zhì)量有效16Sr RNA基因序列38 901條，依據(jù)樣本基因序列相似程度來歸并劃分OTU，一共獲得了235個(gè)OTU；Chao1和ACE指數(shù)分別為249.76、252.23，表明OTU數(shù)目較多，酸馬奶中細(xì)菌菌群豐富度較大；香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Simpson）指數(shù)分別為1.41和0.47，表明細(xì)菌菌群多樣性較低。

表1 酸馬奶菌群微生物多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of microbial flora in koumiss

可分類操作單元OTU在Alpha多樣性分析以及對于各分類水平劃分都具有非常重要的意義。對樣本進(jìn)行16S rDNA高通量測序后，最終酸馬奶樣品的細(xì)菌菌群可以注釋到17個(gè)門、36個(gè)綱、73個(gè)目、110個(gè)科、156個(gè)屬，核心OTU為乳桿菌屬以及醋桿菌屬。

2.2 Alpha多樣性分析

由圖1A可知，酸馬奶樣本的稀釋性曲線隨著抽取序列數(shù)的增加還未進(jìn)入平臺(tái)期；但根據(jù)圖1B和圖1C可知，Shannon曲線以及Chao1曲線均傾向于平緩：其中Chao1曲線進(jìn)入到了平臺(tái)期，且Shannon曲線也已飽和，說明在本次研究中所得到的樣本測序結(jié)果可以充分體現(xiàn)當(dāng)前樣本所包含的細(xì)菌多樣性，滿足了細(xì)菌測序量后繼所需的生物信息學(xué)分析要求。酸馬奶細(xì)菌菌群多樣性已經(jīng)不會(huì)再隨著樣本總量的增加而有較大的改變，即使測序深度繼續(xù)增加也已無法檢測出大量還未發(fā)掘的新型菌種，現(xiàn)有的測序結(jié)果足以反映大多數(shù)細(xì)菌菌群的物種信息；根據(jù)圖1D可知，Rank-Abundance曲線在橫坐標(biāo)上的范圍下降快速，反映酸馬奶樣本中優(yōu)勢菌群所占比例很高，細(xì)菌多樣性較低。

圖1 酸馬奶樣品的Alpha多樣性分析結(jié)果Fig.1 Alpha diversity analysis results of koumiss

2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

酸馬奶的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示。該酸馬奶樣本從門的分類水平上來看，細(xì)菌菌群中優(yōu)勢門為厚壁菌門（Firmicutes）占所有菌群的85.78%，其次為變形菌門（Proteobacteria）占12.72%，其他門占1.50%；從綱的分類水平上看，細(xì)菌菌群的優(yōu)勢綱為芽孢桿菌綱（Bacilli）占所有菌群的85.52%，γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）和β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）也均有分布，分別占6.54%、4.39%和1.82%；從目的分類水平上，細(xì)菌菌群的優(yōu)勢目是乳桿菌目（Lactobacillales），占所有菌群的85.51%，分布較多的還有紅螺菌目（Rhodospirillales）和假單胞菌目（Pseudomonadales），分別占3.54%和3.44%；在科的分類水平上，細(xì)菌菌群中的優(yōu)勢科是乳桿菌科（Lactobacillaceae）占所有菌群的83.95%，醋桿菌科（Acetobacteraceae）和莫拉氏菌科（Moraxellaceae）也有分布，分別占3.42%和3.25%；在屬的分類水平上來看，細(xì)菌菌群中優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）占83.95%，醋桿菌屬（Acetobacter）占3.36%，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）占3.24%，腸桿菌屬（Enterobacter）占2.04%，其他菌屬占7.40%。

圖2 酸馬奶樣品中細(xì)菌相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria in koumiss samples

2.4 乳酸菌的形態(tài)特征

從酸馬奶中分離純化出1株菌株MN-Is，參照文獻(xiàn)[18]觀察其菌落形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)，如圖3所示，菌落形態(tài)觀察為圓形，乳白色，邊緣光滑，表面突起，菌株革蘭氏染色結(jié)果為紫色，由此推斷菌株MN-Is屬于革蘭氏陽性菌。

圖3 菌株MN-Is菌落形態(tài)圖（a）和革蘭氏染色圖（b）Fig.3 Colony morphology (a) and Gram chromatogram (b) of strain MN-Is

2.5 菌株MN-Is生理生化檢測

菌株MN-Is的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示：細(xì)胞無運(yùn)動(dòng)行為，接觸酶試驗(yàn)為陰性，能夠在15 ℃以及45 ℃條件下生長，能夠利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等碳源，不能利用棉籽糖[19]。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化初步經(jīng)鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillussp.）。

表2 菌株MN-Is的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical tests of strain MN-Is

2.6 乳酸菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

菌株MN-Is的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，菌株MN-Is與通過結(jié)合菌株MN-Is形態(tài)特征、生理生化特性檢測結(jié)果，鑒定出菌株MN-Is屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株MN-Is的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain MN-Is based on 16S rDNA gene sequences

3 討論

傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離出酸馬奶中的乳酸菌種類有限，僅分離得到優(yōu)勢屬中的乳桿菌屬，可能的原因是研究中采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，其成分含量并不能適用于所有乳酸菌，在后續(xù)的研究中應(yīng)利用不同種類的培養(yǎng)基。其次，研究中采用的培養(yǎng)溫度是37 ℃，根據(jù)張?zhí)m威等[20]的研究表明，溫度會(huì)影響混合生長的乳酸菌培養(yǎng)，且當(dāng)溫度達(dá)到44 ℃時(shí)，有利于不同乳酸菌的生長比例到達(dá)平衡，這提示在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置不同的溫度梯度，以適應(yīng)不同種類乳酸菌的生長。

不同地區(qū)酸馬奶的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異并不十分明顯，烏日汗等[21]采用Illumina MiSeq第二代測序技術(shù)對內(nèi)蒙古科爾沁地區(qū)的酸馬奶進(jìn)行了細(xì)菌多樣性分析，結(jié)果表明酸馬奶引子中細(xì)菌主要分布于四個(gè)屬：乳桿菌屬、醋桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬，其中乳桿菌屬是絕對優(yōu)勢菌群；布仁其其格等[22]采用454焦磷酸測序分析內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)酸馬奶不同發(fā)酵時(shí)期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明酸馬奶中乳桿菌屬是優(yōu)勢細(xì)菌屬，乳球菌屬是次優(yōu)勢細(xì)菌屬。此外，還分布有醋酸菌屬和不動(dòng)桿菌屬等多種細(xì)菌；趙飛燕等[23]利用PacBio SMRT測序技術(shù)分析內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)鮮馬奶的細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明在細(xì)菌屬水平，優(yōu)勢菌群主要有芽孢桿菌屬（23.44%）、乳球菌屬（18.18%）和類芽孢桿菌屬（13.8%），這提示鮮馬奶的細(xì)菌多樣性比發(fā)酵后的酸馬奶更豐富。

4 結(jié)論

采用Illumina MiSeq高通量測序首次對新疆新源縣那拉提草原的酸馬奶細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行了分析與鑒定。結(jié)果表明，酸馬奶的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)豐富，但菌群多樣性較低，其中厚壁菌門（Firmicutes）為酸馬奶中的優(yōu)勢菌門，占所有菌群的85.78%；乳桿菌屬（Lactobacillus）為酸馬奶中的優(yōu)勢菌屬，占所有菌群的84%。通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法分離出1株菌，編號為MN-Is，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。