李 娜，楊江華，韋宇拓

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

乳酸菌是指發(fā)酵糖類后主要產(chǎn)物為乳酸的一類沒有芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌[1-2]，因其具有耐膽鹽、耐酸、抑制有害微生物生長等益生功能，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品和飲料的生產(chǎn)中[2-3]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是目前常用的益生菌之一，常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中，而且在人體胃腸道也常發(fā)現(xiàn)它的存在[4-5]，其具有抗衰老[6]、減輕腸道生態(tài)失調(diào)[7]、提高青貯有氧穩(wěn)定性[8]等功能。近幾年，國內(nèi)外研究學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌的其他功能，如植物乳桿菌CCFM436可以減少錳離子在組織中的積累[9]；植物乳桿菌H6可顯著降低高膽固醇血癥飲食小鼠的血清膽固醇水平[10]；植物乳桿菌發(fā)酵顯著降低了水稻中鎘的水平，并且被認(rèn)為是開發(fā)無鎘大米食品的一種策略[11]。

高細(xì)胞密度發(fā)酵（high cell density fermentation，HCDF）是指在一定的培養(yǎng)條件和體系內(nèi)，在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上，盡可能多的積累生物量[12-14]。工業(yè)化生產(chǎn)，需要用低成本的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)出更高的產(chǎn)物。高密度培養(yǎng)核心在于為菌體提供合適的營養(yǎng)成分和生長條件[15-16]。隨著食品、飼料等需規(guī)?；a(chǎn)的產(chǎn)品對發(fā)酵工藝的要求逐步提高，摸索發(fā)酵劑的高活力的保存便顯得更加重要[17-18]。本研究的主要目的是以植物乳桿菌ZJ316為研究對象，在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對其高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后植物乳桿菌的保藏以及作為發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316：由廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 試劑

蔗糖、牛肉膏、酵母粉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、檸檬酸銨、三水合乙酸鈉、檸檬酸（均為分析純或生化試劑）：上海生物工程有限公司；吐溫80（分析純）：國藥集團(tuán)試劑有限公司；玉米漿干粉：北京鴻潤寶順有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[19]：葡萄糖20.00 g，蛋白胨10.00 g，牛肉膏5.00 g，酵母粉4.00 g，吐溫80 1.00 mL，七水磷酸氫二鉀2.00 g，七水硫酸鎂0.20 g，四水硫酸錳0.05 g，檸檬酸三銨2.00 g，三水合乙酸鈉5.00 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加15 g瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁E-201-C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；U Quamt TM酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；Eppendorf Centrifuge 5415D臺式離心機(jī)：德國Eppendorf公司；BIOTECH-5BG-4 5L多聯(lián)發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌體密度的測定

將發(fā)酵后的菌液稀釋至合適的倍數(shù)，用紫外分光光度計(jì)測定菌液在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。

1.3.2 活菌數(shù)的測定

乳酸菌活菌數(shù)的測定方法按照國標(biāo)GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[20]執(zhí)行。

1.3.3 pH值的測定

采用pH計(jì)在室溫條件下測定發(fā)酵后菌液的pH值。

1.3.4 種子液的制備

將在-80 ℃冰箱中甘油保存的菌種，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，作為種子液。

1.3.5 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

碳源種類及其添加量的確定：用20 g/L的麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、淀粉依次代替MRS液體培養(yǎng)基的葡萄糖。按2%（V/V）的接種量接種于含有50 mL不同碳源培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，初始pH值為6.2，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵24 h，然后測定菌液的菌體密度。篩選出最適碳源后，考察碳源添加量（10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、90 g/L）對菌體密度的影響。

氮源種類及其添加量的確定：在優(yōu)化碳源的基礎(chǔ)上，用19 g/L的玉米漿干粉、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏依次代替MRS液體培養(yǎng)基中的主要氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉），以優(yōu)化碳源后的MRS培養(yǎng)基作為對照。測定菌液的菌體密度，篩選出最適氮源。在此基礎(chǔ)上，考察氮源添加量（0、20 g/L、60 g/L、100 g/L、140 g/L）對菌體密度的影響。

緩沖鹽種類及濃度的確定：在碳氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，用NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-Na2HPO4、Na2HPO4-檸檬酸緩沖鹽體系依次代替MRS液體培養(yǎng)基中的緩沖鹽（乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨），三種緩沖鹽體系的濃度分別選擇0、0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L。測定菌液的菌體密度，篩選出最適緩沖鹽。

微量元素添加量的確定：在最適碳、氮源、緩沖鹽的基礎(chǔ)上，依次考察硫酸鎂添加量（0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L）、硫酸錳添加量（0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4g/L）、吐溫80添加量（0.5mL/L、1.0mL/L、2.0mL/L、3.0mL/L、4.0 mL/L）對菌體密度的影響。

1.3.6 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對菌體密度影響顯著的3個(gè)因素蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）、Na2HPO4-檸檬酸濃度（C）為考察因素，以O(shè)D600nm值為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12.0軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for Lactobacillus plantarum ZJ316 high-density fermentation medium optimization

1.3.7 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，將初始pH值調(diào)為6.2，依次考察接種量（1%、2%、3%、4%和5%）、發(fā)酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對菌體密度的影響。

1.3.8 植物乳桿菌ZJ316生長曲線的測定

將活化之后的植物乳桿菌ZJ316的種子液接種于3 L優(yōu)化培養(yǎng)基（5 L發(fā)酵罐），在優(yōu)化條件進(jìn)行發(fā)酵，每隔3 h取樣檢測其活菌數(shù)、OD600nm值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做三個(gè)平行，以MRS液體培養(yǎng)基為對照，繪制出菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 碳源的選擇

碳源種類及其添加量對植物乳桿菌ZJ316生長的影響見圖1。

圖1 不同碳源種類（a）及蔗糖添加量（b）對植物乳桿菌ZJ316生長的影響Fig.1 Effect of different carbon source types(a)and sucrose additions(b)on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

由圖1a可知，當(dāng)20 g/L的麥芽糖作為碳源時(shí)，OD600nm值最高為2.31，蔗糖、α-乳糖次之，淀粉最低，說明植物乳桿菌ZJ316對麥芽糖的利用效率最好，這與DONG Z等[21]的研究結(jié)果一致。雖然植物乳桿菌ZJ316對麥芽糖利用效率最好，但是價(jià)格昂貴，根據(jù)節(jié)約成本原則，后續(xù)將選擇蔗糖作為培養(yǎng)基的最適碳源。

由圖1b可知，當(dāng)蔗糖添加量為30 g/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值最高達(dá)到2.30，繼續(xù)增加蔗糖添加量至90 g/L，OD600nm值下降至2.06。這可能是由于碳源濃度過高，抑制了植物乳桿菌ZJ316的生長代謝。因此，確定蔗糖的最適添加量為30 g/L。

2.1.2 氮源的選擇

氮源種類及其添加量對植物乳桿菌ZJ316生長的影響見圖2。

圖2 不同氮源種類（a）及玉米漿干粉添加量（b）對植物乳桿菌ZJ316生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source types(a)and corn syrup powder additions(b)on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

由圖2a可知，當(dāng)酵母粉作為氮源時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值最高為2.55，其次是玉米漿干粉。NORO N等[22]研究表明，玉米漿干粉可在發(fā)酵過程中維持培養(yǎng)基的pH值在4.6～4.8之間，減小發(fā)酵時(shí)所產(chǎn)乳酸對發(fā)酵體系pH值的影響，減緩培養(yǎng)基pH值降低對菌體生長的抑制，為植物乳桿菌提供更好的生存環(huán)境，從而更有助于菌體的生長[23]。由于玉米漿干粉與酵母粉的結(jié)果不存在顯著性差異（P＞0.05），考慮到經(jīng)濟(jì)因素，后續(xù)將選擇玉米漿干粉作為最適氮源。

由圖2b可知，隨著玉米漿干粉添加量的增加，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)玉米漿干粉添加量為60 g/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值最高為2.47，由于添加量20 g/L和60 g/L對結(jié)果的影響沒有顯著性差異（P＞0.05），考慮到經(jīng)濟(jì)因素，確定玉米漿干粉的最適添加量為20 g/L。

2.1.3 緩沖鹽的選擇

由圖3可知，在Na2HPO4-檸檬酸緩沖鹽體系中，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度明顯高于其余兩組緩沖鹽，當(dāng)其濃度為0.1 mol/L時(shí)，菌體密度最高，OD600nm能達(dá)到3.58。這可能與檸檬酸有很強(qiáng)的氧化能力有關(guān)，它屬于有機(jī)酸，有機(jī)酸在發(fā)酵過程中被利用，會(huì)使發(fā)酵體系的pH值上升，尤其是有機(jī)酸鹽氧化會(huì)伴隨著堿性物質(zhì)的產(chǎn)生，使pH值進(jìn)一步上升，從而緩解了發(fā)酵過程中乳酸的產(chǎn)生對發(fā)酵液體系pH值的影響，更有利于菌體的生長[24]。因此，后續(xù)將選擇Na2HPO4-檸檬酸緩沖鹽作為最適緩沖鹽體系。

圖3 不同緩沖鹽體系及濃度對植物乳桿菌ZJ316生長的影響Fig.3 Effect of different buffer salt systems and concentrations on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

2.1.4 微量元素添加量的選擇

由圖4a可知，隨著硫酸鎂添加量的升高，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)硫酸鎂添加量為0.2 g/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度最高，為3.59。因此，確定硫酸鎂的最適添加量為0.2 g/L。

圖4 不同MgSO4（a）、MnSO4（b）及吐溫80（c）添加量對植物乳桿菌ZJ316生長的影響Fig.4 Effect of different MgSO4(a),MnSO4(b) and Tween 80 (c)additions on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

由圖4b可知，當(dāng)培養(yǎng)基中硫酸錳的添加量為0.1 g/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度最高，為3.61。當(dāng)硫酸錳添加量＞0.1 g/L之后，菌密度有略微下降。可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中過高的金屬離子錳，抑制了植物乳桿菌ZJ316的生長，從而導(dǎo)致菌體密度下降。因此，確定硫酸錳的最適添加量為0.1 g/L。

由圖4c可知，當(dāng)吐溫80添加量為1 mL/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的菌密度最高，為3.64。當(dāng)吐溫80添加量＞1mL/L之后，菌體密度下降。因此，確定吐溫80的最適添加量為1 mL/L。

2.1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 12.0軟件對影響植物乳桿菌ZJ316生長的3個(gè)主要因素進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design Expert 12.0軟件對表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值OD600nm值（Y）與蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）、Na2HPO4/檸檬酸緩沖鹽濃度（C）的關(guān)系的多元二次回歸方程：

由表3可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)的P值=0.051 3＞0.05，不顯著；并且模型的決定系數(shù)R2=0.986 8，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.969 8，說明該模型可以很好的擬合實(shí)際情況，具有較高的可靠性。由表3亦可知，一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

蔗糖、玉米漿干粉、Na2HPO4-檸檬酸三者的交互作用形成的響應(yīng)曲面和等高線圖見圖5。由圖5可知，AB、AC的等高線圖呈橢圓形，說明AB、AC交互作用明顯，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖5 蔗糖、玉米漿干粉、Na2HPO4-檸檬酸交互作用對植物乳桿菌ZJ316生長影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sucrose，dried corn steep liquor powder and Na2HPO4-citric acid on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

2.1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

根據(jù)模型可以得出，當(dāng)蔗糖添加量為43.41 g/L，玉米漿干粉添加量為59.46 g/L，Na2HPO4-檸檬酸緩沖鹽濃度為0.12 mol/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值最大理論預(yù)測值為4.004，在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次試驗(yàn)，得到植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值為4.065±0.020，與預(yù)測值相近，說明模型可靠，因此，該模型可用于預(yù)測植物乳桿菌ZJ316培養(yǎng)基菌體密度的變化。

2.2 植物乳桿菌ZJ316高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由圖6a可知，隨著接種量的增大，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)接種量為4%時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值可達(dá)4.31；當(dāng)接種量＞4%之后，OD600nm值下降，可能是因?yàn)槌跏冀臃N量太大，導(dǎo)致菌體大量生長，而培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體同時(shí)生長，致使菌體密度發(fā)生下降。因此，確定最適接種量為4%，該結(jié)果與陳百瑩等[25]的研究結(jié)果一致。

圖6 接種量（a）、發(fā)酵溫度（b）及初始pH值（c）對植物乳桿菌ZJ316生長的影響Fig.6 Effect of inoculum (a),fermentation temperature (b) and initial pH value (c) on the growth of Lactobacillus plantarum ZJ316

由圖6B可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度最高達(dá)5.00，隨著培養(yǎng)溫度的升高，OD600nm值急劇下降，可能是因?yàn)楦邷貢?huì)使植物乳桿菌ZJ316的胞內(nèi)酶失活，從而影響菌體生長。因此，確定最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

由圖6c可知，當(dāng)初始pH值在5.0～6.5的范圍內(nèi)時(shí)，隨著pH值的升高，植物乳桿菌ZJ316的菌體密度不斷提高；當(dāng)初始pH值為6.5時(shí)，菌體密度到達(dá)峰值為5.17；當(dāng)初始pH值增加到7.0時(shí)，菌體密度明顯下降，可能是過堿的環(huán)境不利于菌體的生長。因此，確定最佳初始pH值為6.5。

2.3 植物乳桿菌ZJ316的生長曲線

為了探索植物乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)工藝路線，選擇了5 L發(fā)酵罐的小試發(fā)酵體系進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。在優(yōu)化培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，對植物乳桿菌ZJ316進(jìn)行高密度發(fā)酵，同時(shí)以MRS培養(yǎng)基作為對照，測得的生長曲線見圖7。

圖7 植物乳桿菌ZJ316的生長曲線Fig.7 Growth curve of Lactobacillus plantarum ZJ316

由圖7可知，植物乳桿菌ZJ316在優(yōu)化培養(yǎng)基中的菌體密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MRS液體培養(yǎng)基。在優(yōu)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm值達(dá)到5.13，對數(shù)生長期延長，更加有利于菌體的生長和產(chǎn)物的積累。

3 結(jié)論

在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到植物乳桿菌ZJ316高密度培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為蔗糖43.41 g/L、玉米漿干粉59.46 g/L、Na2HPO4-檸檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7 H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐溫80 1 ml/L；最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量4%、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH值6.5。在此優(yōu)化條件下，經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)24 h，植物乳桿菌ZJ316的OD600nm值達(dá)到5.13，活菌數(shù)最高可達(dá)8.01×109CFU/mL，相比于MRS液體培養(yǎng)基分別提高1.65、3.44倍。優(yōu)化后的培養(yǎng)基采用蔗糖作為主要碳源，并且采用廉價(jià)的玉米漿干粉作為氮源，減少了經(jīng)濟(jì)成本，簡化了培養(yǎng)基的制備步驟。