朱 琳 張 蕊 張 冰 葉 金 王松雪王松山 郭寶元 張志軍 劉鑫輝

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院1，北京 100037)(呂梁學(xué)院2，呂梁 033000)

“民以食為天，食以安為先”，我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，糧食安全是關(guān)系著國(guó)計(jì)民生的重大問題，尤其是新冠疫情爆發(fā)以來，更突顯了糧食安全的重要性。我國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)，也是最大的稻米消費(fèi)國(guó)，2019年，我國(guó)水稻產(chǎn)量達(dá)20 961萬t[1，2]。農(nóng)藥的使用保障了水稻生產(chǎn)免受病蟲草害的威脅，在保障其穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和品質(zhì)安全中起到重要的作用，同時(shí)，農(nóng)藥作為一種人造化學(xué)品，其具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)人體和環(huán)境都存在著明顯的危害[3]，因此，世界各國(guó)對(duì)糧食和環(huán)境中的農(nóng)藥殘留有嚴(yán)格的限定。我國(guó)的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019規(guī)定了34種農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物在大米中的殘留限量[4，5]。依據(jù)國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局推動(dòng)的“優(yōu)質(zhì)糧食工程”要求[6]，根據(jù)大米樣品基質(zhì)的特點(diǎn)，從上述34種農(nóng)藥中，選擇14種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。

目前，現(xiàn)有農(nóng)藥殘留檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法主要采用GPC和SPE等凈化方法[7-9]，QuECHERS凈化方法報(bào)道較多[10,11]，但是由于農(nóng)藥品種較多，其理化性質(zhì)相差較大，采用現(xiàn)有的凈化方法，難免會(huì)造成目標(biāo)物的損失。隨著儀器靈敏度和抗干擾能力的提升，進(jìn)一步降低了儀器對(duì)樣品前處理的要求，逐漸出現(xiàn)了樣品提取液直接稀釋無需凈化的方法，大幅度的降低了前處理的時(shí)間和步驟，減少了前處理成本，同時(shí)也避免了復(fù)雜前處理導(dǎo)致的目標(biāo)物損失，且適用于多目標(biāo)物的同時(shí)分析[12]。本研究通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立了一種無需使用特殊凈化材料，可快速檢測(cè)大米中14種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，為有效監(jiān)測(cè)大米中的農(nóng)藥殘留提供了有力的技術(shù)支持。同時(shí)，所建立的方法前處理與真菌毒素前處理基本一致[12，13]，為后續(xù)進(jìn)行真菌毒素與農(nóng)藥殘留協(xié)同監(jiān)測(cè)提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售，共9份樣品。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：多菌靈(carbendazim)、甲萘威(carbaryl)、異丙威(isoprocarb)、芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、敵稗(propanil)、稻瘟靈(isoprothiolane)、禾草敵(molinate)、馬拉硫磷(malathion)、喹硫磷(quinalphos)、稻豐散(phenthoate)、敵瘟磷(edifenphos)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、丁草胺(butachlor)；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨：色譜級(jí)；實(shí)驗(yàn)用水。

1.2 儀器與設(shè)備

6470A三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，1290 Infinity II液相色譜系統(tǒng)，H1750臺(tái)式高速離心機(jī)，3-30k高速冷凍離心機(jī)，VX-III多管渦旋振蕩器，WH-866旋渦混合器。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別用甲醇配制14種農(nóng)藥(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)混合標(biāo)準(zhǔn)的儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存；使用空白大米提取液(按照1.4制備)將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制成不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.4 樣品處理

樣品經(jīng)粉碎過40目篩后，準(zhǔn)確稱取5.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶劑，渦旋搖勻20 min后，以4 000 r/min離心10 min使固液分離。準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL去離子水稀釋，渦旋混勻1 min，然后在 4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過濾，待測(cè)[12，13]。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Waters CORTECSTMUPLC C18柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)，保護(hù)柱為CORTECSTMUPLC C18柱(2.1 mm×5 mm，1.6 μm)；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸和1 mmol /L甲酸銨的水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，流速；0.4 mL/min。

梯度洗脫條件：0 min，95%A，12 min，5%A，后運(yùn)行5 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

帶噴射流技術(shù)的ESI源(簡(jiǎn)稱AJS)，干燥氣溫度為250 ℃，干燥氣流速為7 L/min；鞘氣溫度為325 ℃；鞘氣流速為11 L/min；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；DMRM正離子掃描模式；經(jīng)優(yōu)化后，各農(nóng)殘母離子及定量、 定性子離子保留時(shí)間、碎裂電壓及碰撞能量見表1。

表1 14種農(nóng)藥殘留質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 大米樣品農(nóng)殘種類

本研究選擇14種(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)農(nóng)藥，其主要為我國(guó)食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的大米中使用較為頻繁且在液質(zhì)上響應(yīng)較好的農(nóng)藥[6-9]。

2.2 農(nóng)殘質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI源正離子模式下，對(duì)14種農(nóng)殘單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對(duì)各自子離子進(jìn)行全掃描，每種農(nóng)殘選擇2個(gè)響應(yīng)值高的特征離子對(duì)作為定量及定性離子對(duì)，并進(jìn)行MRM及DMRM參數(shù)的優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)見表1。每種農(nóng)殘均以其相應(yīng)的加氫的準(zhǔn)分子離子作為特征母離子。

2.3 農(nóng)殘色譜分析方法的優(yōu)化

通過對(duì)流動(dòng)相含0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸和1 mmol/L甲酸銨的水溶液與甲醇梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定各農(nóng)殘?jiān)贑18柱上的最佳分離率及檢測(cè)時(shí)間，經(jīng)優(yōu)化，利用C18柱分離的14種農(nóng)藥提取離子色譜圖詳見圖1，峰6與峰7、峰8，峰9與峰10的提取離子色譜圖會(huì)有重疊，但各峰的定量離子和定性離子是不同，因此，不影響其定量分析。

2.4 農(nóng)殘前處理方法的選擇

注：峰1：多菌靈，峰2：甲萘威，峰3：異丙威，峰4：芐嘧磺隆，峰5：敵稗，峰6：稻瘟靈，峰7：禾草敵，峰8：馬拉硫磷，峰9：喹硫磷，峰10：稻豐散，峰11：敵瘟磷，峰12：甲基嘧啶磷，峰13：甲基毒死蜱，峰14：丁草胺。圖1 基于UPLC-MS/MS的C18色譜柱DMRM掃描模式下14種農(nóng)藥提取離子(EIC)色譜圖

在前期方法開發(fā)的基礎(chǔ)上[12，13]，本研究采用直接提取稀釋離心法用于大米樣品中多農(nóng)藥的快速前處理，提高了提取效率。使用本前處理方法對(duì)大米樣品進(jìn)行處理，上機(jī)檢測(cè)溶液澄清透明，對(duì)近百份大米基體樣品進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱柱壓未見顯著升高，方法靈敏度未發(fā)生顯著下降，表明本前處理方法不會(huì)對(duì)色譜柱和質(zhì)譜儀造成明顯的污染，適用于大量大米樣品的檢測(cè)。

2.5 大米樣品農(nóng)殘方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)及線性范圍

基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，該比值用來評(píng)估基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)效應(yīng)(SSE)。該比值等于或接近1時(shí)(在0.85～1.15)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；小于0.85時(shí)，表明存在明顯離子抑制作用，大于1.15時(shí)，表明存在明顯離子增強(qiáng)作用[13]。大米樣品14種農(nóng)殘的基質(zhì)效應(yīng)及線性范圍詳見表2。

表2 14種農(nóng)殘的基質(zhì)效應(yīng)及線性范圍

表2(續(xù))

由表2可知，大米中14種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)及其線性關(guān)系，其中有9種農(nóng)殘(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷)未有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，5種農(nóng)殘(禾草敵、馬拉硫磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，但這14種農(nóng)殘基質(zhì)標(biāo)液在線性范圍內(nèi)均線性相關(guān)。

因此，在進(jìn)行大米樣品檢測(cè)時(shí)，為了提高方法的準(zhǔn)確性，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，需采用基質(zhì)匹配曲線進(jìn)行定量。

2.5.2 定量限及檢出限

以性噪比S/N≥10確定各農(nóng)殘的定量限 (LOQ)，并在定量限濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收以驗(yàn)證各農(nóng)殘的定量限(LOQ)，以性噪比S/N≥3確定各農(nóng)殘的檢出限(LOD)。14種農(nóng)殘定量限和檢出限詳見表3。

由表3可知，有11種農(nóng)藥(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基毒死蜱)在1～100 μg/kg添加水平下的回收率為87.0%～115.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～8.7%，定量限為1 μg/kg，有2種農(nóng)殘(甲基嘧啶磷和稻瘟靈)在2～100 μg/kg添加水平下的回收率為91.4%～115.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～8.3%，定量限2 μg/kg，丁草胺在5～100 μg/kg添加水平下的回收率為89.0%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.9%～1.3%，定量限為5 μg/kg。這14種農(nóng)殘?jiān)谙鄳?yīng)的定量限范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率為87.0%～115.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～8.7%，檢出限均小于0.4 μg/kg。由此可見，該方法不僅回收率高，精密度高，而且定量限大大低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019相應(yīng)農(nóng)殘限量的要求，因此，本方法可以滿足日常檢測(cè)和監(jiān)測(cè)需求。

2.5.3 回收率及精密度

取空白大米樣品，分別添加低、中、高三種濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”樣品處理方法進(jìn)行處理，其中，低濃度、高濃度加標(biāo)水平進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，中濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，14種農(nóng)殘加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果詳見表3。

表3 14種農(nóng)殘加標(biāo)回收率、精密度及定量限、檢出限及最大殘留限量

2.6 大米實(shí)際樣品的測(cè)定

利用開發(fā)的UPLC-MS/MS的方法對(duì)市售的9個(gè)大米樣品進(jìn)行測(cè)試分析，經(jīng)分析可知，市售9份大米樣品中有4份樣品存在農(nóng)藥殘留，占比總樣品量的44%，其中多菌靈檢出2份，檢出率為22%，稻瘟靈檢出4份，檢出率為44%，其中農(nóng)藥殘留總量最高的樣品中稻瘟靈殘留量為166.8 μg/kg，多菌靈留量為2.4 μg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2763—2019規(guī)定的稻瘟靈1 mg/kg的限量，多菌靈2 mg/kg的限量。從本次市場(chǎng)初步篩查的結(jié)果來看，市售9份大米中14種農(nóng)藥均未超過食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763限量要求，因此，本次所采集的市售大米在農(nóng)藥殘留方面是相對(duì)安全的，可放心食用。

3 結(jié)論

基于超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)，建立了同時(shí)檢測(cè)大米中14種農(nóng)藥殘留的方法，樣品經(jīng)提取、稀釋、離心、過濾后直接上機(jī)，減少前處理的目標(biāo)物損失，采用加標(biāo)回收法驗(yàn)證了方法準(zhǔn)確度和精密度，本方法14種農(nóng)殘加標(biāo)回收率為87.0%～115.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～8.7%，多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基毒死蜱定量限為1 μg/kg，甲基嘧啶磷和稻瘟靈定量限為2 μg/kg，丁草胺定量限為5 μg/kg，14種農(nóng)殘的檢出限均小于0.4 μg/kg，本方法的定量限和檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于食品安全標(biāo)準(zhǔn)大米中農(nóng)藥最大殘留限量的要求，本方法適用于大量大米樣品農(nóng)藥殘留的快速準(zhǔn)確定量分析，同時(shí)，該方法前處理與真菌毒素前處理基本一致[12，13]，為后續(xù)建立真菌毒素與農(nóng)藥殘留協(xié)同監(jiān)測(cè)方法提供了可能，為進(jìn)一步保障我國(guó)大米質(zhì)量安全提供了技術(shù)保障。