楊勇波，向 平

宮頸癌是一種發(fā)生率較高的婦科惡性腫瘤疾病[1]，新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)則是在實(shí)施外科手術(shù)切除或放療前進(jìn)行的適當(dāng)療程化療，可明顯提高后續(xù)外科手術(shù)切除或放療的治療效果[2]。雖然NACT治療宮頸癌病人療效顯著，但病人死亡率仍較高，分析原因可能與部分病人化療敏感性差有一定關(guān)系[3]。因此在宮頸癌病人實(shí)施NACT治療前應(yīng)準(zhǔn)確篩查出這部分病人，有助于醫(yī)務(wù)人員制定個(gè)體化的治療方案，但目前尚缺乏有效的預(yù)測性指標(biāo)[4]。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種機(jī)體內(nèi)廣泛存在的糖蛋白分子，在細(xì)胞早期免疫應(yīng)答反應(yīng)、惡性腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等起著關(guān)鍵性作用。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，OPN表達(dá)與肺癌、惡性膠質(zhì)瘤周圍組織侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象及放化療敏感性之間存在密切的聯(lián)系，OPN表達(dá)水平較高的病人出現(xiàn)放化療抵抗現(xiàn)象的概率更高。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)則是一種限速酶，其具有促進(jìn)腫瘤新生血管組織形成、調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡現(xiàn)象、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移等多種生物學(xué)功能，在腫瘤發(fā)生及周圍組織侵襲、遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性作用[6-7]。目前OPN、COX-2與宮頸癌化療敏感性的相關(guān)性研究較少，因此本研究擬觀察OPN、COX-2在宮頸癌腫瘤病灶組織中的表達(dá)水平，并分析兩者與NACT化療敏感性的相關(guān)性關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院腫瘤科2017年2月至2019年2月住院期間行NACT治療的157例宮頸癌病人作為研究對(duì)象，根據(jù)相關(guān)腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為化療敏感組(112例)和化療不敏感組(45例)，2組病人臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。本課題已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核及批準(zhǔn)。

表1 2組病人一般臨床資料的比較

1.2 病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病人入院前未實(shí)施外科手術(shù)切除或放化療治療；(2)所有病人實(shí)施NACT治療前經(jīng)病理組織檢查均已確診為宮頸癌；(3)病人治療前已知曉研究內(nèi)容，并簽署自愿參加研究的同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并心肝腎等重要臟器功能障礙而無法實(shí)施NACT治療的病人；(2)合并有血液、神經(jīng)等其他系統(tǒng)，或者其他臟器組織惡性腫瘤疾病的病人。

1.3 NACT治療方法 所有病人入院后均實(shí)施相同的NACT治療方案(紫杉醇+順鉑，全身靜脈滴注化療)，紫杉醇藥物治療劑量為135 mg/m2，順鉑藥物治療劑量為60 mg/m2，2組病人均治療2個(gè)周期，每個(gè)治療周期間隔時(shí)間為3周，治療期間對(duì)出現(xiàn)的各種化療藥物不良反應(yīng)予以對(duì)癥支持治療，密切監(jiān)測病人的生命體征變化。

1.4 化療敏感評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)相關(guān)腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病人的化療敏感性予以評(píng)估[8]，療效分為完全緩解(CR)：腫瘤病灶組織完全消失，而且淋巴結(jié)直徑明顯減小，且減少幅度≤10 mm；部分緩解(PR)：腫瘤病灶組織最長徑之和減少≥30%；疾病進(jìn)展(PD)：腫瘤病灶組織最長徑之和增大≥20%，而且腫瘤病灶組織須絕對(duì)增大>5 mm，或者出現(xiàn)一個(gè)以上新腫瘤病灶組織；病情穩(wěn)定(SD)：腫瘤病灶組織最長徑之和減少<30%，或者腫瘤病灶組織最長徑之和增大<20%。CR和PR病人歸為化療敏感組，PD和SD病人歸為化療不敏感組。

1.5 研究方法

1.5.1 組織樣本采集方法 分別在2組病人NACT治療前及治療結(jié)束后3周采用宮頸活檢鉗各取200 mg腫瘤病灶組織。

1.5.2 OPN、COX-2蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blotting法檢測2組病人NACT治療前后OPN、COX-2蛋白表達(dá)水平，將100 mg宮頸癌腫瘤病灶組織置于1 mL RIPA裂解液中，提取總蛋白并計(jì)算蛋白濃度。在99 ℃溫度條件下煮沸作用10 min變性蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)入PVDF膜后，使用5%濃度的脫脂奶封閉液封閉處理1 h，稀釋一抗4 ℃溫度條件下孵育過夜作用，采用TBST溶液清洗處理PVDF膜3次，每次5 min，然后二抗室溫條件下孵育處理2 h，采用TBST液清洗處理PVDF膜3次，每次5 min，ECL法顯影處理后采用相應(yīng)軟件系統(tǒng)分析目的條帶的灰度，以GAPDH為內(nèi)參蛋白予以比對(duì)。

1.5.3 OPN、COX-2 mRNA表達(dá)檢測 所有病人NACT治療前后腫瘤病灶組織采用Trizol試劑盒提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，采用RT-PCR法檢測OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平，COX-2上游引物為：5′-AGT GAG CGT CAG GAG CA-3′，下游引物為：5′-GTG GGA ACA GCA AGG AT-3′，長度為187 bp，OPN上游引物為：5′-ATG CTA CAG ACG AGG ACA TCA C-3′，下游引物為：5′-CTC ATC ATT GGC TTT CCG CTT A-3′，長度為212 bp，β-actin上游引物為：5′-GGG CTG CTT TTA ACT CTG GTA A-3′，下游引物為：5′-GCT CCT GGA AGA TGG TGA TGG G-3′，長度為180 bp，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2.5 μL，ddH2O 8 μL，總體積為25 μL。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃10 min，95 ℃ 15 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。整個(gè)RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后采集相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)算OPN、COX-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 彩超檢測方法 采用三維彩色多普勒超聲檢測2組病人NACT治療前后血管形成指數(shù)(vascularization index,VI)、血流指數(shù)(flow index,FI)、血管血流指數(shù)(vascularization flow index,VFI)等相關(guān)參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析和logistic回歸法分析。

2 結(jié)果

2.1 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2蛋白表達(dá)水平比較 化療不敏感組治療前OPN、COX-2 蛋白表達(dá)水平明顯高于化療敏感組(P<0.01)，化療不敏感組治療后OPN、COX-2 蛋白表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05)，而化療敏感組治療后OPN、COX-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)(見表2、圖1)。

表2 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2蛋白表達(dá)水平比較

2.2 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平比較 化療不敏感組治療前OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于化療敏感組(P<0.01)，化療不敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05)，而化療敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)(見表3)。

表3 2組病人治療前后宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平與超聲相關(guān)參數(shù)的關(guān)系 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平與VI、FI均呈正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，而與VFI無明顯相關(guān)性關(guān)系(P>0.05)(見表4)。

表4 治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平與超聲相關(guān)參數(shù)的關(guān)系(r)

2.4 影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析 以化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平及超聲相關(guān)參數(shù)為自變量，以化療敏感性為因變量進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素分析，結(jié)果顯示：化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平及VI、FI為化療敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表5)。

表5 影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析

3 討論

NACT的治療有效率可超過70%,但仍有部分宮頸癌病人對(duì)NACT不敏感，不但對(duì)后續(xù)治療時(shí)機(jī)造成明顯的延誤，而且還可耗費(fèi)過多的醫(yī)療資源，明顯增加病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故準(zhǔn)確評(píng)估病人對(duì)NACT的化療敏感性顯得極為關(guān)鍵[9]。目前醫(yī)務(wù)人員多采用婦科常規(guī)檢查、影像學(xué)檢查等對(duì)宮頸癌病人NACT治療效果予以評(píng)估，但準(zhǔn)確性易受到較多因素的影響，從而導(dǎo)致誤診、漏診情況發(fā)生[10]。由于腫瘤相關(guān)標(biāo)志物與惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后之間存著密切的聯(lián)系，不但可用來評(píng)估宮頸癌病人NACT的治療效果，還可通過實(shí)驗(yàn)室檢測治療前后表達(dá)水平變化而預(yù)測宮頸癌病人NACT的化療敏感性[11]。

OPN是一種分泌型糖蛋白，其具有較多生物學(xué)功能作用，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周圍組織浸潤、遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移等方面起著關(guān)鍵性作用[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌及交界性卵巢腫瘤病人病灶組織中的OPN表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織及良性卵巢組織。還有研究[14-15]證實(shí)，OPN可明顯增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的周圍組織侵襲能力，且在宮頸癌組織表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)OPN表達(dá)水平與惡性腫瘤細(xì)胞的含氧量及放化療敏感性之間存在密切的聯(lián)系。COX-2是一種機(jī)體內(nèi)花生四烯酸合成和釋放前列腺素過程中的重要限速酶，一般情況下多數(shù)臟器組織呈低水平表達(dá)，但在炎癥感染反應(yīng)、腫瘤疾病發(fā)生等因素刺激下可短期內(nèi)明顯升高[16]。COX-2具有調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡，誘導(dǎo)腫瘤新生血管組織形成，介導(dǎo)細(xì)胞之間黏附作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等多種生物學(xué)功能，從而在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞周圍組織浸潤、遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移等方面起著關(guān)鍵性作用[17]。有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，COX-2表達(dá)水平升高可通過多種途徑明顯增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力，使得惡性腫瘤細(xì)胞可順利穿透脈管屏障系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤病灶組織出現(xiàn)直接局部浸潤現(xiàn)象及遠(yuǎn)處臟器組織的轉(zhuǎn)移，并且與宮頸癌病人預(yù)后有著密切的聯(lián)系。因此推測OPN、COX-2可作為臨床預(yù)測宮頸癌病人NACT化療敏感性的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。本研究顯示，化療敏感組治療后OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較治療前明顯降低(P<0.05)，提示NACT方案中的化療藥物可有效抑制化療敏感組病人宮頸癌組織中OPN、COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，而化療不敏感組治療前后OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示NACT方案中的化療藥物無法有效抑制化療不敏感組病人宮頸癌組織中的OPN、COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)本研究還比較了2組病人治療前OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療不敏感組治療前OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于化療敏感組(P<0.05)，提示NACT治療前檢測OPN、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平有助于醫(yī)務(wù)人員預(yù)測宮頸癌病人的化療敏感性。

本研究進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)，治療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平與VI、FI等呈正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，而與VFI無明顯相關(guān)性關(guān)系(P>0.05)，影響宮頸癌病人化療敏感性的logistic多因素分析結(jié)果顯示，化療前宮頸癌組織OPN、COX-2 mRNA表達(dá)水平及VI、FI為化療敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示宮頸癌組織中的OPN、COX-2表達(dá)水平與化療敏感性之間存在密切的聯(lián)系，可用于宮頸癌病人NACT治療前化療敏感性的預(yù)測，在臨床應(yīng)用中具有較高的價(jià)值。