黃曉寧，劉晶晶，韓北忠，陳晶瑜,*

（1.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100176）

中國釀酒行業(yè)已有數(shù)千年的歷史，白酒屬于我國特有酒品，其年消耗量位于世界蒸餾酒第一[1]，其中濃香型、醬香型和清香型白酒是三大主要香型白酒，多年來持續(xù)主導(dǎo)市場地位[2]。白酒多以大曲作為糖化發(fā)酵劑進(jìn)行開放式固態(tài)發(fā)酵，大曲為白酒釀造提供了必須的微生物及酶資源，造就了白酒獨(dú)特的風(fēng)味和品質(zhì)[3-4]。提高白酒發(fā)酵過程穩(wěn)定性和提升白酒質(zhì)量是目前整個白酒行業(yè)發(fā)展的共同目標(biāo)和技術(shù)難題[1]。

通過強(qiáng)化添加特定內(nèi)源性微生物以提升產(chǎn)品品質(zhì)是目前發(fā)酵食品提高產(chǎn)品質(zhì)量的主要途徑[5]，在干酪和葡萄酒的研究中均有證實(shí)[6-8]，同時也被嘗試應(yīng)用于白酒釀造中。例如：在大曲生產(chǎn)中強(qiáng)化加入釀酒酵母可以有效提高大曲中己酸乙酯等酯類物質(zhì)含量[9]；在濃香型白酒生產(chǎn)中強(qiáng)化加入芽孢桿菌能顯著提高酒醅中芳香族化合物含量等[10]。此外，通過采用內(nèi)源性菌株進(jìn)行大曲合成群落重構(gòu)，從而管理發(fā)酵過程，是未來白酒質(zhì)量控制與工業(yè)化發(fā)展的目標(biāo)[11-12]。

芽孢桿菌是不同香型大曲中共有的優(yōu)勢細(xì)菌之一，以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）最為常見[13-16]。芽孢桿菌具有強(qiáng)大的水解酶系統(tǒng)尤其是以產(chǎn)淀粉酶能力突出[17]。白酒釀造中以高粱作為原料，其中含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，淀粉降解后的小分子糖酸類物質(zhì)及蛋白質(zhì)降解后的氨基酸類物質(zhì)，為白酒中特征風(fēng)味化合物的合成提供了前體物質(zhì)[18]。

本研究選用前期分別由濃香型、醬香型和清香型大曲中分離得到的105 株芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶和蛋白酶活力測定，篩選特性優(yōu)良菌株用于白酒強(qiáng)化發(fā)酵，驗(yàn)證其對揮發(fā)性代謝物質(zhì)的貢獻(xiàn)。通過篩選得到內(nèi)源性特定功能芽孢桿菌，為白酒強(qiáng)化發(fā)酵及大曲發(fā)酵劑體外重建提供理論基礎(chǔ)和菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室前期研究中，從山西某酒廠、北京某酒廠和四川某酒廠的濃香型、醬香型和清香型大曲中分離鑒定得到105 株芽孢桿菌，包括B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. megaterium、B. pumilus、B. subtilis和B. tequilensis，菌株信息如表1所示。

表1 芽孢桿菌菌株Table 1 Bacillus strains tested in this study

Bacillus的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂14.0 g/L；酶活性測定液體發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖1 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO40.1 g/L、KH2PO40.5 g/L、CaCl20.05 g/L。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；可溶性淀粉、酪蛋白、3,5-二硝基水楊酸、三氯乙酸、福林-酚 北京索萊寶科技有限公司；4-甲基-2-戊醇美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；Synergy多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；57330-U型固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）手動進(jìn)樣手柄、PDMS/CAR/DVB固相微萃取頭 美國Supelco公司；6890-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌培養(yǎng)

對105 株芽孢桿菌進(jìn)行活化，劃線至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)后。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，180 r/min，30 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整OD600nm為1.0±0.1。吸取1 mL接種于酶活測定液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r/min培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后以10 000×g離心10 min取上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行酶活力測定。

1.3.2 淀粉酶和蛋白酶活力測定及蛋白電泳分析

淀粉酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸法[19]，蛋白酶活力測定采用福林-酚法[20]。粗酶液十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白酶譜參照Liu Jingjing等[21]的方法，采用分離膠10.5%，濃縮膠4.5%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶，蛋白酶酶譜在電泳分離膠中加入0.1%的明膠作為底物蛋白。

1.3.3 芽孢菌強(qiáng)化發(fā)酵

采用清香型白酒生產(chǎn)工藝流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵。將90 ℃的熱水加入到粉碎后的高粱中，加水量為高粱投料量的65%，總潤糝時間為20～22 h。后將高粱蒸煮60 min。之后加入投料量35%的冷水，冷卻到室溫后，加入投料量10%的大曲充分?jǐn)嚢杈鶆?，? L的藍(lán)蓋瓶中裝入500 g酒醅，設(shè)為對照組（CK）。除大曲外，分別以1%的比率接種所篩選的芽孢桿菌菌液（～1×107CFU/mL）作為強(qiáng)化發(fā)酵組（B.L-1和B.S-1），依據(jù)清香型白酒發(fā)酵過程中的溫度變化調(diào)整培養(yǎng)箱的溫度進(jìn)行發(fā)酵[22]，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個平行，發(fā)酵周期為28 d。發(fā)酵結(jié)束后，將瓶中的酒醅混勻，取50 g酒醅樣品進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.4 理化指標(biāo)檢測

參考Wang Haiyan等[23]方法檢測理化指標(biāo)。精確稱取樣品10.00 g，加入蒸餾水90 mL，高速勻漿后，用pH計測定懸浮液的pH值；采用105 ℃常壓恒重法測定水分含量；采用滴定法測定酸度。

1.3.5 風(fēng)味代謝物組分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatgraphy-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用。樣品前處理后[24]，加入2 μL 4-甲基-2-戊醇（125 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)，50 ℃萃取45 min后立即插入GC進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸5 min。GC-MS柱溫箱升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，后以2 ℃/min的速率升溫至85 ℃保持0.1 min，再以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持2 min。離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子電離，離子能量為70 eV，四極桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為20～350 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析；多元統(tǒng)計分析使用SIMCA軟件（V14.1），包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical clustering alg，HCA）觀測值間的距離以Ward法計算；基于偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）計算得到自變量重要性指標(biāo)（variable importance in projection，VIP）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌酶活性評價

2.1.1 淀粉酶和蛋白酶活性測定

如圖1所示，清香型大曲來源的芽孢桿菌酶活力普遍較高，其中枯草芽孢桿菌B.S-1與地衣芽孢桿菌B.L-1具有最高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力，其淀粉酶活力分別為（92.6±1.6）、（71.1±2.4 ）U/mL，蛋白酶活力分別為（66.4±3.6）、（56.6±2.4） U/mL。而濃香型和醬香型來源的芽孢桿菌酶活力普遍低于清香型大曲，此結(jié)果與Liu Jingjing等[21]研究結(jié)果一致，清香型大曲的淀粉酶活力普遍高于濃香型和醬香型大曲。

圖1 芽孢桿菌蛋白酶和淀粉酶活力散點(diǎn)圖Fig.1 Scattering plots of protease activity and amylase activity of Bacillus

2.1.2 芽孢桿菌發(fā)酵液SDS-PAGE及蛋白酶譜分析

以淀粉酶活力為13 U/mL作為臨界值，選擇酶活力相對較高的14 株芽孢桿菌粗酶液中的蛋白質(zhì)分布情況（圖2），通過SDS-PAGE分析，可見芽孢菌內(nèi)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布較廣，同時存在同種菌株內(nèi)蛋白差異性。其中B.S-1發(fā)酵液中蛋白酶種類最豐富（圖3a）。由于B.L-1和B.S-1的淀粉酶和蛋白酶活力最高，蛋白酶譜中顯示的蛋白酶種類豐富，因此選用這2 株菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵。

圖2 芽孢桿菌發(fā)酵液SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of extracts of fermentation broths of 14 selected Bacillus with high enzyme activities

圖3 芽孢桿菌發(fā)酵液蛋白酶酶譜Fig.3 Zymogram analysis of proteases in fermentation broths of Bacillus with high enzyme activities

2.2 芽孢桿菌強(qiáng)化發(fā)酵

2.2.1 理化指標(biāo)分析

酒醅理化指標(biāo)的測定，是衡量白酒發(fā)酵的重要參數(shù)[23]。發(fā)酵結(jié)束后，分別測定酒醅中的水分含量、酸度及pH值（圖4A）。模擬發(fā)酵中理化指標(biāo)pH值、總酸度和水分含量總體與工廠大生產(chǎn)結(jié)果相似[12,24]。強(qiáng)化B.S-1組水分含量高于對照組，強(qiáng)化B.L-1組總酸度高于對照組，可能由于強(qiáng)化B.L-1后，增加了有機(jī)酸含量，或是減弱了酒醅微生物對酸性物質(zhì)的降解作用，但3 組之間pH值并無顯著性差異。故強(qiáng)化發(fā)酵后，酒醅基本理化指標(biāo)并未出現(xiàn)很大差異，發(fā)酵穩(wěn)定進(jìn)行。

圖4 強(qiáng)化發(fā)酵后理化指標(biāo)和揮發(fā)性物質(zhì)含量Fig.4 Physicochemical characteristics and concentrations of volatile compounds in fermented grains produced by enhanced fermentation

2.2.2 揮發(fā)性代謝物分析

發(fā)酵酒醅中共檢測得到38 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類、酸類、醇類、醛酮類、酚類和雜環(huán)類。其中強(qiáng)化B.L-1組中的中的酯類、酸類、醇類和其他類物質(zhì)的總含量明顯高于對照組，而強(qiáng)化B.S-1組中酯類，酸類和醇類與對照組無顯著性差異，醛酮酚類物質(zhì)含量顯著提高（圖4B）。通過對比不同類別代謝物分組中的各物質(zhì)的相對豐度（圖5），可以看出，B.L-1和B.S-1強(qiáng)化發(fā)酵后乙酸乙酯的相對含量均有所提高，這與He Guiqiang等[10]的結(jié)果一致，在濃香型白酒發(fā)酵中使用強(qiáng)化大曲（添加B. velezensis和B. subtilis）發(fā)酵后顯著提高了白酒中酯類物質(zhì)含量。在強(qiáng)化B.L-1后，乙醇相對豐度降低，而苯乙醇占比增加，有助提高白酒中花香及蜂蜜香味[25]。強(qiáng)化B.L-1后酒醅中酸性物質(zhì)占比基本與對照組一致，而強(qiáng)化B.S-1后辛酸和己酸相對含量增加。此外，4-乙基-2-甲氧基苯酚在2 組強(qiáng)化組中占比均有所提高，苯酚，苯乙醛相對含量均降低。添加內(nèi)源性芽孢桿菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，理論上改變了微生物群落中不同微生物相對豐度，故而影響到微生物代謝及微生物間相互作用，最終使得發(fā)酵代謝產(chǎn)物有所差異，增加了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

圖5 強(qiáng)化發(fā)酵后揮發(fā)性代謝物相對含量Fig.5 Relative abundance of volatile compounds in fermented grains produced by enhanced fermentation

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異代謝組分析

2.3.1 總體代謝物層級聚類和PCA

基于強(qiáng)化發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)的構(gòu)成，采用HCA對不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行聚類（圖6A），B.L-1組較B.S-1組和對照組距離更遠(yuǎn)，說明代謝物變化較大。通過PCA模型從整體上反映添加不同芽孢桿菌強(qiáng)化后的發(fā)酵酒醅中的代謝差異，累計模型擬合度良好。B.L-1組與對照組在PC1方向上差異顯著，而B.S-1組和對照組在PC2方向上差異較顯著（圖6B），通過圖6C看出，乙酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸酯、己酸乙酯苯乙醛等物質(zhì)貢獻(xiàn)了PC1方向的得分，而乳酸乙酯、苯乙烯、4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸、4-乙基苯酚、1-己醇等物質(zhì)貢獻(xiàn)了PC2方向的得分（圖6C）。

圖6 基于揮發(fā)性代謝物的HCA和PCA圖Fig.6 PCA and HCA plots for volatile compounds

2.3.2 差異代謝產(chǎn)物分析

采用同時滿足基于PLS-DA模型的變量投影重要度VIP＞1、變量差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5或FC＜0.5和t檢驗(yàn)P≤0.05確定強(qiáng)化組分別與對照組的差異代謝產(chǎn)物[26]，結(jié)果如表2所示，在強(qiáng)化B.L-1和B.S-1組分別有21 個和11 個差異代謝物。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚，辛酸乙酯，3-甲基丁酸乙酯，四甲基吡嗪在2 組強(qiáng)化中均顯著性增高。4-乙基-2-甲氧基苯酚又稱4-乙基愈創(chuàng)木酚是白酒中的特征香氣物質(zhì)之一，其來源主要是通過微生物降解與木質(zhì)素相關(guān)的酚酸類物質(zhì)形成[27]。四甲基吡嗪不僅是白酒釀造中的特征香氣物質(zhì)，也是白酒中的健康因子，由于其抗氧化活性使得它在心血管疾病防治方面有重要意義[28]。在Wang Peng等[29]的研究中，強(qiáng)化添加地衣芽孢桿菌也可以顯著提高大曲中四甲基吡嗪的含量。芽孢桿菌中的堿性脂肪酶是辛酸乙酯合成的一種有效催化劑[30]，故可能提高了辛酸乙酯的含量；同時芽孢桿菌作為外來菌株加入整個發(fā)酵體系，會影響發(fā)酵過程中微生物間相互作用，從而使得多種揮發(fā)性物質(zhì)含量有所改變[31]。此外，2,3-丁二醇和苯乙醇在B.L-1組中顯著升高，而苯乙烯和乳酸乙酯在B.S-1組強(qiáng)化發(fā)酵后顯著升高。強(qiáng)化添加B.L-1和B.S-1后，特征風(fēng)味物質(zhì)有所不同，故對于白酒風(fēng)味的提升后續(xù)可嘗試多種微生物復(fù)配添加的方式。

表2 強(qiáng)化發(fā)酵后的差異代謝物Table 2 Differential metabolites in fermented grains between enhanced fermentation and control

3 結(jié) 論

通過對濃香，醬香和清香型大曲中分離得到的芽孢桿菌淀粉酶和蛋白酶特性的分析，篩選出地衣芽孢桿菌B.L-1和枯草芽孢桿菌B.S-1，模擬清香型白酒發(fā)酵工藝進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后強(qiáng)化B.L-1組酒醅中多種揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著高于對照組，而強(qiáng)化B.S-1組中主要是醛酮酚類物質(zhì)含量有所提高。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、四甲基吡嗪在2 組強(qiáng)化中均為差異代謝物，含量顯著升高。通過強(qiáng)化不同芽孢桿菌進(jìn)行模擬發(fā)酵可以顯著提高酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)含量，菌株B.L-1和B.S-1均具有作為功能微生物進(jìn)行大規(guī)模強(qiáng)化發(fā)酵的潛力，也可用于大曲人工合成群落中淀粉及蛋白質(zhì)降解功能菌及健康因子產(chǎn)生菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。同時，基于酶學(xué)特性分析進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)良菌株的篩選是一種高效的功能菌株篩選途徑，可廣泛用于白酒及其他傳統(tǒng)谷物類發(fā)酵食品中。