丁麗麗，呂欣然，高永悅，崔曉玲，王小咪，白鳳翎,*，儀淑敏，郭曉華

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，國(guó)家魚(yú)糜及魚(yú)糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 錦州 121013；2.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276815）

水產(chǎn)品具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美等特點(diǎn)，受到廣大消費(fèi)者的青睞。但是，水產(chǎn)品極易受到脂質(zhì)和蛋白氧化等影響，使水產(chǎn)品產(chǎn)生色澤變暗、彈性變差以及安全性降低等不良變化[1-3]。最終導(dǎo)致水產(chǎn)品整體質(zhì)量下降，給人們健康帶來(lái)危害[4-5]。

目前預(yù)防和延緩水產(chǎn)品氧化最主要的方式是向水產(chǎn)品中添加抗氧化劑。植物源抗氧化劑主要有酚類(lèi)、植物多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)及維生素類(lèi)等植物提取物，動(dòng)物源抗氧化劑主要由動(dòng)物自身組織產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)（如肌肽）和動(dòng)物水解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物兩部分組成，合成類(lèi)抗氧化劑主要包括丁基羥基茴香醚、特丁基對(duì)苯二酚等，這3 類(lèi)抗氧化劑都存在成本高、作用機(jī)制單一等缺點(diǎn)[6-11]。微生物源抗氧化劑中以乳酸菌最為常見(jiàn)，乳酸菌作為天然抗氧化劑，具有完整的抗氧化體系及評(píng)價(jià)體系的同時(shí)還具有來(lái)源廣泛、成本低廉、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。相對(duì)于其他類(lèi)抗氧化劑，開(kāi)發(fā)微生物源抗氧化劑更具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

從自然界乳酸菌資源中篩選具有抗氧化活性的菌株已成為研究熱點(diǎn)。王惋等[14]通過(guò)體外抗氧化和胃腸道環(huán)境的耐受性實(shí)驗(yàn)，從發(fā)酵蔬菜中分離出具有較好抗氧化性、耐酸性和疏水性的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A15。李默等[15]從發(fā)酵肉制品中分離到希臘魏斯氏菌（Weissella hellenica）L23，可作為抗氧化發(fā)酵劑用于肉制品生產(chǎn)。唐宇[16]從發(fā)酵豆乳中分離到干酪乳桿菌（L. casei）16，該菌具有抗氧化活性，同時(shí)能提高糖苷型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化率，使發(fā)酵后的豆乳更具營(yíng)養(yǎng)。研究表明，抗氧化乳酸菌主要來(lái)源于發(fā)酵食品，魚(yú)腸道來(lái)源的抗氧化乳酸菌較少。

本實(shí)驗(yàn)從魚(yú)腸道的乳酸菌中篩選具有抗氧化活性的優(yōu)良菌株，因其可在魚(yú)腸道中定植且對(duì)宿主無(wú)害，在腸道內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用維持氧化還原平衡，同時(shí)還具有耐低溫、有效抑制致病菌等優(yōu)點(diǎn)，可以被廣泛的應(yīng)用在冷凍及鮮活水產(chǎn)品的抗氧化加工中[17-18]。因此，從豐富的魚(yú)腸道微生物資源中篩選具有抗氧化活性的乳酸菌對(duì)開(kāi)發(fā)水產(chǎn)品抗氧化制劑具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌菌株：來(lái)源于遼寧錦州地區(qū)的草魚(yú)、鱸魚(yú)、刀魚(yú)、牙鲆、大菱鲆、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)。

應(yīng)試菌株：志賀氏菌（Shigella Castellani）CMCC（B）51572、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 9027、熒光假單胞菌（P. fluorescens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ACCC11091、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）CMCC63301及單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115均由學(xué)院微生物學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）ATCC53103 北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、亞油酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、鄰菲羅琳、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國(guó)Sigma公司。

氯化鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%）、氯化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%）、磷酸二氫鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.024%）、磷酸氫二鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.144%）TaqPCR Master mix、細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、DNA Marker、PCR擴(kuò)增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-8C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ABI stepone plus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌完整細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞提取物的制備

稱(chēng)取0.2 g氯化鉀、8 g氯化鈉、0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉，先溶于800 mL去離子水，調(diào)節(jié)至pH 7.2后，加去離子水定容至1 L，最后經(jīng)121 ℃滅菌15 min以制備磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。乳酸菌以2%的接種量（終濃度為109CFU/mL）接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。將第3代活化后的菌株分為兩組，一組4 ℃、6 000 r/min離心15 min，收集菌體，收集的菌體經(jīng)PBS洗滌2 次，重懸于PBS中，作為乳酸菌完整細(xì)胞備用。另一組將菌懸液冰浴超聲破碎（15 min變幅桿：φ6；超聲開(kāi)1 s；超聲關(guān)2 s；功率33%），在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，作為乳酸菌無(wú)細(xì)胞提取物備用。

1.3.2 抗氧化活性乳酸菌的初篩

乳酸菌的DPPH自由基清除能力，參照文獻(xiàn)[19]并稍加改進(jìn)，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：Bi為樣品組吸光度；Bj為空白組吸光度；Bc為對(duì)照組吸光度。

1.3.3 抗氧化活性的乳酸菌的復(fù)篩

1.3.3.1 乳酸菌的羥自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]的方法稍加改進(jìn)，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率公式如下：

式中：Bs為樣品組吸光度；Bb為對(duì)照組吸光度；Bp為空白組吸光度。

1.3.3.2 乳酸菌的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]的方法稍加改進(jìn)，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽(yáng)性對(duì)照?？怪|(zhì)過(guò)氧化率公式如下：

式中：B為樣品組吸光度；Bo為對(duì)照組吸光度。

1.3.3.3 乳酸菌的超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]的方法稍加改進(jìn)，以鼠李糖乳桿菌LGG作陽(yáng)性對(duì)照。超氧陰離子自由基清除率公式如下：

式中：B為樣品組吸光度；Bo為空白組吸光度。

1.3.4 乳酸菌的抑菌活性測(cè)定

以志賀氏菌、埃希氏大腸桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及單核細(xì)胞性李斯特菌為應(yīng)試菌株，采用牛津杯打孔法[23]測(cè)定乳酸菌的抑菌活性。

1.3.5 乳酸菌菌株的鑒定

1.3.5.1 生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[24]對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定。

1.3.5.2 16S rDNA序列分析

參照文獻(xiàn)[25]的方法稍加改進(jìn)，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性乳酸菌的初篩

DPPH自由基清除率是評(píng)價(jià)乳酸菌抗氧化最常見(jiàn)的指標(biāo)，是由不成對(duì)電子氮為中心構(gòu)成的一種穩(wěn)定的基團(tuán)，通過(guò)接受氫自由基或電子形成更加穩(wěn)定的DPPH-H分子[26-27]。如果乳酸菌能將其清除則說(shuō)明乳酸菌具有降低自由基的能力，也就具有一定的抗氧化性。因此，乳酸菌的抗氧化活性與DPPH自由基清除率有關(guān)，即乳酸菌的DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，則說(shuō)明乳酸菌的抗氧化活性越強(qiáng)。

表1 乳酸菌菌株對(duì)DPPH自由基的清除率Table 1 DPPH free radical scavenging activity of LAB strains

由表1可知，來(lái)自魚(yú)腸道的48 株乳酸菌均具有DPPH自由基清除能力，清除率范圍在（1.74±0.21）%～（67.29±0.42）%，31 株乳酸菌的DPPH自由基清除率高于陽(yáng)性對(duì)照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），其中菌株LY-21、CY1-2、CY2-1、CY2-3、LY-17的DPPH自由基清除率顯著高于其他乳酸菌包括陽(yáng)性對(duì)照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），清除率分別為（64.10±0.75）%、（67.29±0.42）%、（65.14±0.43）%、（65.6±0.30）%、（61.34±0.34）%。因此，選擇這5 株菌繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)一步探究其抗氧化活性[28]。

2.2 抗氧化活性乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1 羥自由基清除率

圖1 乳酸菌菌株的羥自由基清除結(jié)果Fig.1 Hydroxyl radical scavenging effect of LAB strains

由圖1可知，清除能力較強(qiáng)的5 株乳酸菌的完整細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞提取物都表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力，其范圍分別為（56.60±0.52）%～（60.67±1.44）%和（57.43±1.84）%～（64.27±1.26）%，且均超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05）。其中，菌株CY1-2的完整細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞提取物的羥自由基清除率均高于其他菌株，分別為（60.67±1.44）%和（64.27±1.26）%，并且其無(wú)細(xì)胞提取物的清除率大于完整細(xì)胞的清除率。該結(jié)果與劉少敏等[29]研究植物乳桿菌NDC 75017的羥自由基清除結(jié)果類(lèi)似，這可能是由于細(xì)胞被破壞后，特定的Fe2+和Cu2+金屬螯合物被釋放出來(lái)，參與氧化反應(yīng)，從而明顯減少羥自由基的產(chǎn)生。

2.2.2 抗脂質(zhì)過(guò)氧化率

由圖2可知，5 株乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，此外，菌株CY1-2和LY-21的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05）。乳酸菌的完整細(xì)胞組，菌株CY1-2的抗脂質(zhì)過(guò)氧化率最高，為（40.77±0.50）%，其次是菌株LY-21，為（39.70±0.35）%。乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物組，菌株LY-21的抗脂質(zhì)過(guò)氧化率最高，為（56.10±0.01）%，其次是菌株CY1-2，為（51.03±0.40）%。由結(jié)果可知，相較于其他菌株，菌株CY1-2和LY-21抗脂質(zhì)過(guò)氧化率較高，且其無(wú)細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化率均高于完整細(xì)胞，這一結(jié)果與羅章等[30]研究清酒乳桿菌（L. sake）HN05的抗脂質(zhì)過(guò)氧化率結(jié)果相似，這可能是由于乳酸菌細(xì)胞內(nèi)存在較多的螯合Fe2+的活性物質(zhì)，與脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)，達(dá)到抑制脂質(zhì)氧化的目的[21]。

圖2 乳酸菌菌株的抗脂質(zhì)過(guò)氧化結(jié)果Fig.2 Anti-lipid peroxidation effect of LAB strains

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基也可以直接作用于核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，引起一系列的有害反應(yīng)[31]。

圖3 乳酸菌菌株的超氧陰離子自由基清除結(jié)果Fig.3 Superoxide anion radical scavenging effect of LAB strains

由圖3可知，5 株乳酸菌表現(xiàn)出不同差異的超氧陰離子自由基清除效果。乳酸菌的完整細(xì)胞提取物組，菌株CY1-2表現(xiàn)出最強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除率，為（29.87±1.14）%，其次是菌株LY-21，清除率為（23.63±0.55）%。乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物組，菌株LY-21的超氧陰離子自由基清除率最高，為（24.00±1.15）%，其次是菌株CY1-2，清除率為（21.97±1.47）%。且結(jié)果均小于陽(yáng)性對(duì)照鼠李糖乳桿菌LGG（P＜0.05），該結(jié)果與高原[31]研究的植物乳桿菌Y42結(jié)果類(lèi)似，鼠李糖乳桿菌LGG分泌的抑制超氧陰離子活性物質(zhì)強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)菌株，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組結(jié)果均小于對(duì)照組結(jié)果。菌株CY1-2和LY-17完整細(xì)胞的超氧陰離子自由基清除率高于無(wú)細(xì)胞提取物，該結(jié)果與郭慧芬等[20]研究的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）X31結(jié)果相類(lèi)似，表明這兩株乳酸菌清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)主要存在于細(xì)胞表面；其他菌株無(wú)細(xì)胞提取物的超氧陰離子自由基清除率均高于完整細(xì)胞，結(jié)果與高原[31]研究的植物乳桿菌Y44結(jié)果類(lèi)似，表明細(xì)胞內(nèi)存在某種抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶與過(guò)氧化氫酶作用產(chǎn)生的結(jié)果[32]。

從上述抗氧化活性指標(biāo)可得出，菌株CY1-2完整細(xì)胞的羥自由基、超氧陰離子自由基清除率及抗脂質(zhì)過(guò)氧化率均比其他菌株的清除率大；菌株CY1-2無(wú)細(xì)胞提取物的羥自由基清除效果強(qiáng)于其他菌株，抗脂質(zhì)過(guò)氧化率和超氧陰離子自由基清除率僅次于菌株LY-21，結(jié)果可能與細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)部存在的活性分子的差異性有關(guān)。綜合以上指標(biāo)，故選擇分離自草魚(yú)腸道的菌株CY1-2作為優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 乳酸菌的抑菌結(jié)果

具有抗氧化及抑菌雙重功效的乳酸菌在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域具有非常重要的價(jià)值，因?yàn)橐环矫婵梢匝泳徦a(chǎn)品氧化，達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的；另一方面又能保護(hù)水產(chǎn)品免受腐敗菌的污染，提高水產(chǎn)品的安全性。因此，探究抗氧化乳酸菌CY1-2是否具有廣譜抑菌活性。

表2 菌株CY1-2對(duì)8 種細(xì)菌的抑菌結(jié)果Table 2 Inhibitory effects of strain CY1-2 against eight bacteria

由表2可知，菌株CY1-2對(duì)志賀氏菌、埃希氏大腸桿菌、銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌等革蘭氏陰性菌均具有抑菌效果，其中對(duì)志賀氏菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑為（14.20±0.07）mm。除單核細(xì)胞性李斯特菌之外，菌株CY1-2對(duì)地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌均具有抑菌作用，其中對(duì)地衣芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為（13.53±0.35）mm。此外，吳光偉等[33]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌LGG對(duì)多種革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑制作用。因此，菌株CY1-2作為抗氧化菌株也具有廣譜抗菌活性。

2.4 菌株鑒定結(jié)果

2.4.1 生理生化鑒定結(jié)果

菌株CY1-2生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 菌株CY1-2的糖發(fā)酵結(jié)果Table 3 Sugar fermentation characteristics of strain CY1-2

2.4.2 16S rDNA序列結(jié)果

如圖4所示，核酸序列在1 000～2 000 bp之間，進(jìn)一步測(cè)序，得到菌株CY1-2的目的片段序列為1 500 bp。利用BLAST軟件，從GenBank中選擇10 個(gè)菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5，菌株CY1-2與L. plantarumKP317705.1親緣關(guān)系達(dá)99%，由此確定菌株CY1-2為植物乳桿菌。

圖4 菌株CY1-2的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA gene of strain CY1-2

圖5 菌株CY1-2基于16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain CY1-2 based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié) 論

本研究從來(lái)自魚(yú)腸道的48 株乳酸菌中篩選出具有較強(qiáng)抗氧化活性的菌株CY1-2，經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析鑒定為植物乳桿菌，該菌株的完整細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物均具有較強(qiáng)的清除羥自由基和超氧陰離子自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果，表明該菌株具有良好的抗氧化性和抑菌性。本研究對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天然水產(chǎn)品抗氧化劑具有一定的應(yīng)用價(jià)值。