賈 娜，孫 嘉，劉 丹，金伯陽(yáng)，劉登勇

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

肌肉中最基本的組織是肌原纖維，肌原纖維由肌原纖維蛋白組成。在肉制品加工和貯藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白易發(fā)生氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變，最終影響產(chǎn)品品質(zhì)。植物多酚作為天然抗氧化劑的一種，具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力。這些酚類(lèi)物質(zhì)能夠抑制肉品中脂肪和蛋白氧化的程度，如將迷迭香、丁香、桂皮提取物添加到速凍肉丸中，可有效延緩脂肪氧化[1]。迷迭香提取物還可以減少博洛尼亞香腸中蛋白質(zhì)羰基氧化產(chǎn)物的生成[2]。富含多酚的黑加侖提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力，能夠抑制豬肉中的脂肪氧化和蛋白氧化[3]。

雖然抗氧化劑的添加可以抑制蛋白的氧化，但是抗氧化劑也可以與蛋白發(fā)生相互作用，從而對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生影響。如高添加量的沒(méi)食子酸（150 μmol/g）、綠原酸（150 μmol/g）會(huì)改變肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，降低凝膠性[4-5]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯也會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)巰基和游離氨基的損失，蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚集，蛋白質(zhì)的凝膠特性被破壞[6]。因此，明確多酚類(lèi)物質(zhì)引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和交聯(lián)聚集程度的改變對(duì)于闡明多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響具有重要作用。

槲皮素為類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，共有5 個(gè)酚羥基，具有一定的抗氧化活性。有研究表明，槲皮素可以抑制豬肉蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生，減緩蛋白氧化的過(guò)程，但其抗氧化效果與濃度相關(guān)[7]。Fenton氧化體系可以形成大量的羥自由基，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)[8]。故本研究選取Fenton氧化體系，以槲皮素作為抗氧化劑加入到肌原纖維蛋白氧化體系中，通過(guò)對(duì)蛋白的巰基含量、表面疏水性、電泳、凝膠強(qiáng)度、保水性、微觀(guān)結(jié)構(gòu)、流變特性以及水合特性進(jìn)行測(cè)定，研究槲皮素添加量對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響，為深入研究多酚類(lèi)抗氧化劑對(duì)肌肉蛋白功能特性及肉品品質(zhì)的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌、豬肥膘，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

槲皮素 美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、甘油、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、尿素、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、溴酚藍(lán)、冰乙酸、β-巰基乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 64R冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；T25數(shù)顯型均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；UV-2550紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；Mini電泳儀、電泳槽美國(guó)Bio-Rad公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；S4800場(chǎng)發(fā)式掃描電鏡 日本日立公司；Discovery DHR-1流變儀 美國(guó)TA公司；低場(chǎng)核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取及氧化體系的構(gòu)建

豬肉肌原纖維蛋白的提取按照Park等[9]的方法進(jìn)行。用雙縮脲法測(cè)定提取出的蛋白質(zhì)濃度，并利用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定蛋白含量。

氧化體系的構(gòu)建參照Cao Yungang等[4]的方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。提取的肌原纖維蛋白溶解于pH 6.0 10 mmol/L磷酸緩沖溶液（含0.6 mol/L NaCl），隨后添加10、50、100、150 μmol/g的槲皮素（以蛋白計(jì)），并向其中添加羥自由基氧化體系（10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L VC和1 mmol/L H2O2），使蛋白最終質(zhì)量濃度為40 mg/mL。對(duì)照組為未氧化的肌原纖維蛋白以及氧化后未加槲皮素的肌原纖維蛋白。蛋白樣品均在4 ℃反應(yīng)12 h。

1.3.2 巰基含量的測(cè)定

按照Di Simplicio等[10]的方法，使用Ellman’s試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的總巰基含量。配制10 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，取1 mL蛋白質(zhì)溶液加入8 mL Tris-甘氨酸，混勻后10 000 r/min離心15 min，除去不溶性蛋白質(zhì)。取上清液4.5 mL與0.5 mL 10 mmol/L的Ellman’s試劑反應(yīng)，并以含有4.5 mL Tris-甘氨酸和0.5 mL 10 mmol/L的Ellman’s試劑作為對(duì)照，反應(yīng)30 min后，用紫外分光光度計(jì)在412 nm測(cè)吸光度。采用13 600 L/（mol·cm）的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算巰基含量，蛋白含量使用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.3 表面疏水性的測(cè)定

參照Chelh等[11]的方法，將肌纖維蛋白溶于20 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0），制備質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，取1 mL蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)，充分混合，然后在6 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋10 倍，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以未加蛋白溶液的磷酸鹽緩沖溶液作為對(duì)照組。表面疏水性以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，公式如下：

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測(cè)定

參考Xiong等[12]的方法并加以修改。將制備好的肌原纖維蛋白溶液調(diào)整質(zhì)量濃度為2 mg/mL，采用12%的濃縮膠，4%的分離膠，以體積比1∶1將蛋白液添加上樣緩沖液，通過(guò)添加和不添加5%的β-巰基乙醇進(jìn)行SDS-PAGE分析，以對(duì)比氧化體系中，不同添加量槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白的交聯(lián)和降解情況。運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行掃描和分析。

1.3.5 溶解度的測(cè)定

參照J(rèn)oo等[13]的方法并略加修改。用20 mmol pH 7.0的磷酸緩沖溶液配成10 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，每管取3 mL于10 mL離心管中，4 ℃放置2 h后，10 000 r/min冷凍離心20 min。取上清液1 mL，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。溶解度按照下式計(jì)算：

1.3.6 低場(chǎng)核磁共振

采用Bertram等[14]方法，并做適當(dāng)修改。將測(cè)試之前室溫放置30 min的凝膠放入直徑15 mm核磁管，隨后放入分析儀中。測(cè)試條件：質(zhì)子共振頻率為22 MHz，測(cè)量溫度為32 ℃。首先確定測(cè)試參數(shù)為重復(fù)掃描8 次，重復(fù)間隔時(shí)間為12 500 ms，采樣間隔80 μs/樣，回波個(gè)數(shù)18 000。

1.3.7 動(dòng)態(tài)流變學(xué)測(cè)定

用Discovery DHR-1流變儀測(cè)定樣品的動(dòng)態(tài)學(xué)特性。首先將制備好的蛋白質(zhì)溶液均勻涂布于測(cè)試平臺(tái)，趕走氣泡。測(cè)試參數(shù)為頻率0.1 Hz，應(yīng)變力2%，上下夾縫1 mm，起始溫度30 ℃，升溫速率1 ℃/min，終止溫度80 ℃。測(cè)定過(guò)程中，平板外蛋白與空氣接觸，使用保護(hù)蓋進(jìn)行密封。每組3 個(gè)重復(fù)。測(cè)定指標(biāo)為流變的彈性模量G′和損失模量G″。

1.3.8 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

采用TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定。參數(shù)如下：測(cè)定模式選擇下壓距離，測(cè)試前速率5 mm/s，測(cè)試速率2 mm/s，測(cè)試后速率2 mm/s，下壓距離為凝膠高度的4 mm，引發(fā)力為5 g，探頭型號(hào)選擇P/0.5。將待測(cè)樣品固定于測(cè)定平臺(tái)好，在室溫下進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 凝膠保水性的測(cè)定

采用Salvador等[15]的方法測(cè)定凝膠保水性，并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取離心管的質(zhì)量，記為m0，取一定質(zhì)量凝膠（5～8 g）放入離心管底部，準(zhǔn)確稱(chēng)取此時(shí)離心管的質(zhì)量，記為m1。在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，離心后小心用中性濾紙吸干離心管中凝膠析出的水分，再次準(zhǔn)確稱(chēng)取離心管質(zhì)量，記為m2。每組樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。計(jì)算公式如下：

1.3.10 微觀(guān)結(jié)構(gòu)

將肌原纖維蛋白凝膠樣品切成2 mm×5 mm的小條，用2.5%的戊二醛溶液（pH 6.8）浸泡，過(guò)夜固定。用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸緩沖液洗3 次，每次10 min。隨后分別用50%、70%、80%、90%的乙醇溶液脫水，每次10 min，再用100%的乙醇脫水，每次10 min，共3 次。最后，采用氯仿脫脂1 h，再用100%乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）以及叔丁醇各進(jìn)行一次置換，每次為15 min。樣品進(jìn)行冷凍干燥。凝膠樣品緊貼在掃描電鏡樣品臺(tái)上并且將樣品表面噴金，處理好樣品后，放入掃描電鏡樣品盒中待檢，加速電壓3.0 kV、放大倍數(shù)100 000進(jìn)行觀(guān)察。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響

圖1 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.1 Effect of quercetin on total SH content of myofibrillar protein

從圖1可以看出，氧化（0 μmol/g）后肌原纖維蛋白的巰基含量略有降低，但差異不顯著（P＞0.05）。添加槲皮素后，巰基含量急劇降低，顯著低于2 個(gè)對(duì)照組（P＜0.05），這是由于酚類(lèi)物質(zhì)被氧化形成醌，然后醌與肌原纖維蛋白巰基發(fā)生共價(jià)加成生成巰基-醌加成產(chǎn)物[4,16]，從而導(dǎo)致巰基含量降低。Jongberg等[17]將白葡萄提取物加入到肉糜中時(shí)，也發(fā)現(xiàn)巰基損失的程度增加。從圖1還可以看出，槲皮素添加量增加，巰基含量先降低后升高，可能是因?yàn)槎嘤嗟拈纹に貢?huì)掩蓋巰基結(jié)合位點(diǎn)，阻礙蛋白質(zhì)之間形成二硫鍵，或者阻礙多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而導(dǎo)致總巰基損失的減少。此外，還可能是因?yàn)殚纹に亟Y(jié)構(gòu)中的3-OH結(jié)構(gòu)通過(guò)電子共軛和錯(cuò)位形成穩(wěn)定的平面立體結(jié)構(gòu)，從而抑制自由基的生成，防止巰基的損失[18]。Procházková等[19]證實(shí)槲皮素的抗氧化活性取決于其2,3-雙鍵和4-羰基結(jié)合Fe2+的螯合作用，阻礙其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的攻擊。

2.2 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖2 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig . 2 Effect of quercetin on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

疏水相互作用是一種非共價(jià)鍵相互作用，能夠說(shuō)明蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露的程度，從而反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[20]。從圖2可以看出，氧化（0 μmol/g）后蛋白質(zhì)的表面疏水性略有增加（P＞0.05）。10 μmol/g槲皮素使表面疏水性降低（P＞0.05），可能是由于蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生聚集或蛋白質(zhì)與槲皮素之間相互作用（如生成巰基-醌加成產(chǎn)物），形成聚合物，從而阻礙了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，疏水性氨基酸埋藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，導(dǎo)致表面疏水性下降[21-22]。槲皮素添加量增加，蛋白質(zhì)的表面疏水性均高于10 μmol/g處理組的（P＞0.05）。表面疏水性適度增加能夠促進(jìn)熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中的疏水相互作用[23]，并且表面疏水性增加，說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，因此，更多的活性基團(tuán)能夠參與到凝膠的形成過(guò)程中，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子之間以及蛋白質(zhì)與槲皮素之間的共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)，從而有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。有研究表明，向肌原纖維蛋白中添加中、低濃度的綠原酸，表面疏水性適度增加，同時(shí)凝膠強(qiáng)度也提高，但高濃度綠原酸導(dǎo)致表面疏水性顯著增加，凝膠強(qiáng)度急劇下降[4]。

2.3 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

從圖3A可以看出，與兩個(gè)對(duì)照組相比，加入槲皮素后，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的強(qiáng)度明顯減弱，尤其是槲皮素添加量為150 μmol/g時(shí)，MHC條帶強(qiáng)度更淺，但此時(shí)在凝膠頂部并未出現(xiàn)聚集條帶，可能是由于巰基-醌共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與槲皮素之間形成了大分子聚合物，因分子質(zhì)量較大而未能進(jìn)入凝膠。槲皮素添加量較低（0、10 μmol/g和50 μmol/g）時(shí)，肌動(dòng)蛋白幾乎沒(méi)有損失，當(dāng)槲皮素添加量偏高（100 μmol/g和150 μmol/g）時(shí)，肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度降低，說(shuō)明肌動(dòng)蛋白也參與了大分子物質(zhì)的形成。從圖3B可見(jiàn)，添加β-巰基乙醇后，氧化蛋白（0 μmol/g）的MHC和肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明聚合物通過(guò)二硫鍵形成[5]。與相應(yīng)未加β-巰基乙醇的肌原纖維蛋白相比，添加β-巰基乙醇后，槲皮素組蛋白MHC和肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度增大，且在凝膠頂部出現(xiàn)條帶，說(shuō)明所形成的大分子聚集體可以被還原。

圖 3槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響Fig.3 Effect of quercetin on SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein

2.4 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度、保水性和微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響

凝膠強(qiáng)度和保水性是反映肌原纖維蛋白凝膠特性的重要指標(biāo)[24]。從圖4A可以看出，未氧化蛋白的凝膠強(qiáng)度高于氧化組（0 μmol/g）（P＜0.05），說(shuō)明氧化破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白形成凝膠的能力降低。加入槲皮素后，隨著添加量的增加，凝膠強(qiáng)度也逐漸增加（P＜0.05）。有研究證實(shí)，150 μmol/g的綠原酸或沒(méi)食子酸使肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度降低[4-5]，而本研究中，槲皮素有利于改善蛋白的凝膠特性，尤其是高添加量（150 μmol/g）時(shí)仍能提高蛋白的凝膠強(qiáng)度。Benjakul等[23]報(bào)道疏水相互作用增加以及二硫鍵的形成使得蛋白質(zhì)有更高的聚合程度，從而形成較好的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，如前所述，可能是由于槲皮素所導(dǎo)致的適度增加的表面疏水性促進(jìn)了蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。此外，一般認(rèn)為，巰基-醌共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物的形成阻礙蛋白質(zhì)之間形成二硫鍵，因此不利于凝膠特性，但從本研究來(lái)看，凝膠強(qiáng)度并沒(méi)有降低，反而提高，可能是因?yàn)閹€基-醌之間的共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致了形成大分子聚集物，槲皮素增加了蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)聚集程度，因而有利于凝膠的形成。與未氧化的蛋白相比，氧化（0 μmol/g）蛋白的保水性略有降低（圖4B），加入槲皮素以后保水性逐漸增加，表明槲皮素可促進(jìn)蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，提高蛋白束縛水的能力，這與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果一致。

蛋白凝膠的微觀(guān)結(jié)構(gòu)也可說(shuō)明凝膠強(qiáng)度和保水性的變化。如圖4C所示，未氧化的蛋白具有連續(xù)、緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，氧化后凝膠孔隙變大，因此，蛋白凝膠束縛、截流水的能力降低，保水性下降。加入槲皮素后，凝膠孔隙變小，凝膠表面更加光滑、均勻，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密，因此，凝膠強(qiáng)度和保水性提高。

圖4 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度（A）、保水性（B）和微觀(guān)結(jié)構(gòu)（C）的影響Fig.4 Effect of quercetin on strength (A), water-holding capacity (B)and microstructure (C) of myofibrillar protein gel

2.5 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白流變特性的影響

G′表示凝膠的彈性特征。如圖5所示，加熱初始階段，G′增加，這是由于肌球蛋白上重酶解肌球蛋白開(kāi)始變性，肌球蛋白長(zhǎng)絲進(jìn)行交聯(lián)引起的；45～50 ℃時(shí)，G′下降是由于酶解肌球蛋白輕鏈開(kāi)始變性，其尾部解螺旋，破壞了原來(lái)的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[25]；之后G′上升，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)分子已經(jīng)全部展開(kāi)，蛋白質(zhì)之間交聯(lián)形成了穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖5 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白流變特性的影響Fig.5 Effect of quercetin on rheological properties of myofibrillar protein gel

從圖5還可以看出，溫度在30～50 ℃時(shí)，即凝膠形成的初始階段，加入槲皮素后，蛋白質(zhì)的G′高于兩個(gè)對(duì)照組，說(shuō)明槲皮素提高了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。在凝膠形成的最終階段，加入槲皮素的蛋白凝膠的G′仍較高，說(shuō)明槲皮素促進(jìn)了更具彈性的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。Yan Mingyan等[26]證實(shí)了槲皮素的C6—C3—C6類(lèi)黃酮類(lèi)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)互相作用有利于形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)蛋白凝膠強(qiáng)度和保水性，這與本研究結(jié)果相似。槲皮素添加量為150 μmol/g時(shí)，最終G′略有降低，可能是槲皮素添加量過(guò)高，掩蓋了蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)，阻礙了蛋白之間的交聯(lián)，因此降低了G′。G″表示凝膠的黏性特征，其變化趨勢(shì)與G′相似，加入槲皮素后，蛋白凝膠的G″均高于對(duì)照組，這與G′的結(jié)果一致。整個(gè)加熱過(guò)程中，G′始終高于G″，尤其是當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí)，這表明形成了一個(gè)更具彈性的蛋白凝膠。

2.6 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白水合特性的影響

肌原纖維蛋白凝膠低場(chǎng)核磁衰減曲線(xiàn)擬合的弛豫時(shí)間T2分布為4 個(gè)峰，其中T2b（0～10 ms）表示結(jié)合水；T21（10～100 ms）和T22（100～1 000 ms）表示不易流動(dòng)水；T23（＞1 000 ms）表示自由水。弛豫時(shí)間能體現(xiàn)出水分的自由度，弛豫時(shí)間長(zhǎng)說(shuō)明水分流動(dòng)性強(qiáng)，弛豫時(shí)間短說(shuō)明水分流動(dòng)性弱[27-28]。

表1 槲皮素對(duì)肌原纖維蛋白凝膠T2弛豫時(shí)間和弛豫峰比例P2的影響Table 1 Effect of quercetin on relaxation time T2 and peak area proportion P2 in myofibrillar protein gel

從表1可以看出，氧化后的蛋白T21、T22變化均不明顯，T23略有升高（P＞0.05），說(shuō)明氧化導(dǎo)致凝膠束縛自由水的能力降低，自由水的流動(dòng)性增加。當(dāng)加入50、100 μmol/g和150 μmol/g槲皮素后，與氧化組相比，T23降低，說(shuō)明槲皮素增強(qiáng)了蛋白質(zhì)截留自由水的能力，使自由水流動(dòng)性變差，這與本實(shí)驗(yàn)?zāi)z保水性的結(jié)果一致。弛豫峰比例P2的變化可以反映不同狀態(tài)下水分群的相對(duì)含量，從而可以評(píng)估不同狀態(tài)下水分群的遷移情況[29]。從表1可以看出，不易流動(dòng)水（P21和P22）和自由水（P23）所占比例較大，對(duì)兩種水分的比較分析可知，氧化后，不易流動(dòng)水的峰面積比例降低，自由水的峰面積比例增加。加入槲皮素后，與氧化組相比，不易流動(dòng)水的峰面積比例上升，自由水的峰面積比例下降，表明部分自由水轉(zhuǎn)化為不易流動(dòng)水，進(jìn)一步證實(shí)了槲皮素促進(jìn)了肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，增加了對(duì)水分的束縛能力[30]。

3 結(jié) 論

槲皮素降低了肌原纖維蛋白的巰基含量；中、高添加量的槲皮素（50、100、150 μmol/g）使肌原纖維蛋白的表面疏水性略有提高，因而促進(jìn)熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用；槲皮素使MHC條帶強(qiáng)度減弱，添加量為100 μmol/g和150 μmol/g時(shí)，肌動(dòng)蛋白條帶也減弱，說(shuō)明MHC和肌動(dòng)蛋白均參與了肌原纖維蛋白與槲皮素共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物的形成，且交聯(lián)產(chǎn)物大部分可被還原；槲皮素提高了肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度和保水性，凝膠微觀(guān)結(jié)構(gòu)更加致密，部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰琢鲃?dòng)水，凝膠對(duì)自由水的束縛能力增強(qiáng)；槲皮素提高了肌原纖維蛋白的G′和G″，最終形成了一個(gè)更具彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，槲皮素通過(guò)與肌原纖維蛋白巰基的共價(jià)交聯(lián)及適度提高蛋白的表面疏水性改善蛋白的凝膠特性。