黃治國 劉 娜 衛(wèi)春會 鄧 杰 鐘姝霞 陳 波 任志強(qiáng)

(1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.四川健能制藥有限公司，四川 自貢 643000；3.四川郎酒股份有限公司，四川 古藺 646523)

大曲培養(yǎng)發(fā)酵過程中，空氣中棲息著大量微生物，其種類、濃度以及群落結(jié)構(gòu)直接影響大曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)及大曲質(zhì)量，進(jìn)而影響大曲酒的生產(chǎn)[1]。同時，因不同的地理氣候環(huán)境，不同產(chǎn)地的大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)也有所差異，通過對曲房空氣中微生物的研究可為大曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)提供一定的理論基礎(chǔ)[2-3]。

醬香型白酒獨特的醬香味是眾多微生物交織在一起共同作用的結(jié)果，很難確切地描述單個微生物在釀造過程中不同時間的具體作用。大曲生產(chǎn)的主要場所是制曲車間，曲的質(zhì)量會直接影響酒的質(zhì)量、風(fēng)格和出酒率。目前，大曲的生產(chǎn)工藝大多沿用自然接種的傳統(tǒng)方式，其中微生物主要來源于環(huán)境空氣、制曲原料和制曲用水，而空氣微生物對曲的質(zhì)量有重要影響[4]。生產(chǎn)實踐[5]表明在傳統(tǒng)工藝下，老曲房制曲效果較新曲房更佳，這是由于老曲房中的有益微生物種類及數(shù)量較新曲房更豐富。

高溫大曲在醬香型白酒生產(chǎn)中既作為糖化發(fā)酵劑，也是發(fā)酵原料。發(fā)酵過程中，曲房空氣微生物對釀制醬香型白酒具有重要作用，能將釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)分解為糖和氨基酸，并產(chǎn)生一些高級醇、醛、酸、酚類、酯類等，進(jìn)而形成天然的醬香風(fēng)味[6-7]。文章擬以高溫大曲曲房空氣中的微生物為研究對象，對其進(jìn)行篩選分離，同時采用分子生物學(xué)的方法對純種微生物進(jìn)行鑒定，并對菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行分析，由此得到優(yōu)勢功能微生物；測定生長曲線后進(jìn)行高粱汁液態(tài)發(fā)酵，利用GC-MS分析技術(shù)分析其代謝產(chǎn)物，以期得到更完善的曲房優(yōu)勢菌的功能性，為進(jìn)一步指導(dǎo)釀酒用曲提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

采自川南某醬香型白酒廠曲房，用Coriolis μ型空氣生物采樣器在曲房空氣中進(jìn)行多點取樣，4 ℃保藏，同一生產(chǎn)階段的曲房空氣取3個平行。

1.2 藥品與試劑

干酪素、NaCl、淀粉等：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、Tris-飽和酚、十二烷基硫酸鈉 (SDS)等：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；

瓊脂糖：生化試劑，北京索萊寶科技有限公司；

dNTPs、TaqDNA polymerase、TaKaRa TaqTM、DL2000TM DNA Marker等：生化試劑，寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

空氣生物采樣器：Corolis μ型，法國Bertin公司；

水平電泳儀：JY600+型，美國Bio-rad公司；

PCR儀：MyCycler型，美國Bio-rad公司；

顯微照相機(jī)：DM3000型，德國Leica公司；

全自動菌落分析儀：Scan1200型，上海智理科學(xué)儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975B型，美國Agilent公司。

1.4 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂粉15～20 g，NaCl 5 g，pH 7.4～7.6；

產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，可溶性淀粉10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2；

產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，干酪素10 g(先取用并加入少量NaOH助溶)，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.6～7.8；

產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，硫酸銨4 g，NaCl 1.25 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL；

耐酸培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，用5 mol/L的乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0；

耐乙醇培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，冷卻后加入7%的無水乙醇備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 空氣中微生物的分離純化與形態(tài)觀察 采用平板稀釋涂布法和革蘭氏染色法[8]。

1.5.2 微生物的鑒定

(1) DNA的提?。翰捎酶牧嫉腃TAB法[9-10]。

(2) PCR擴(kuò)增：選用細(xì)菌通用引物27F-1492r對DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用25 μL體系(2.5 μL 10×buffer、2 μL dNTP、1 μL 27F引物、1 μL 1492r引物、0.5 μL Taq、1 μL 模板、17 μL ddH2O)，其PCR反應(yīng)程序為Touch Down PCR，94 ℃維持3 min；30個反應(yīng)循環(huán)；94 ℃維持15 s，56 ℃ 維持30 s，72 ℃維持90 s；72 ℃維持10 min；4 ℃保溫。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，再取5 μL DL2000TM DNA Marker作對照，160 V下電泳30 min，通過凝膠成像儀觀察。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至成都擎科測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對并記錄。

(3) 上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'。

(4) 下游引物1492r：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.5.3 微生物特性研究

(1) 耐受性能：將分離純化后的菌株接種至特定培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后于600 nm處測定培養(yǎng)液OD值，以判斷其耐酸與耐乙醇能力。

(2) 產(chǎn)酶特性：將分離純化后的菌株接種至特定培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)D/d分別進(jìn)行菌株蛋白酶活力[8,11]、淀粉酶活力[12]以及纖維素酶活力[13]測定。

1.5.4 優(yōu)勢菌株發(fā)酵產(chǎn)物研究

(1) 生長曲線：根據(jù)產(chǎn)酶特性篩選出性能優(yōu)良菌株，將其活化并按體積分?jǐn)?shù)10%接種至液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)，每2 h取樣，以未接種的培養(yǎng)基作為空白，測定OD600 nm并繪制生長曲線。

(2) 高粱汁液態(tài)發(fā)酵液：高粱粉與水按m高粱∶V水=1∶5 (g/mL)配制，水浴加熱2 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的液化酶(2 000 U/g)，60 ℃水浴液化1 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的糖化酶(50 000 U/g)保溫糖化1 h；糖化結(jié)束后取一滴與碘液反應(yīng)，不顯藍(lán)色即為反應(yīng)徹底，過濾、澄清，取上清液，滅菌備用。菌體培養(yǎng)4 h后(對數(shù)期)按體積分?jǐn)?shù)10%接入至高粱汁發(fā)酵液中。

(3) 發(fā)酵產(chǎn)物研究：發(fā)酵48 h后，取2 mg/mL的乙酸丁酯10 μL作為內(nèi)標(biāo)，利用固相頂空萃取[14]、CG-MS對發(fā)酵液進(jìn)行檢測[15-16]，分析其代謝產(chǎn)物。

(4) GC-MS：

① 色譜條件：DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度230 ℃；分流比20∶1；程序升溫：40 ℃保持1 min，5 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min；載氣為99.999%氦氣，載氣流速1 mL/min。

② 質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI；質(zhì)量掃描范圍m/z20～500；溶劑延遲3 min。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析

(2) 測序結(jié)果在GenBank中運(yùn)用BLAST進(jìn)行比對，找出相似序列并下載，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對并進(jìn)行人工修正。根據(jù)Kimura 模型運(yùn)用MEGA6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的分析與構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離純化

通過對高溫大曲曲房空氣細(xì)菌進(jìn)行分離與純化，根據(jù)其形態(tài)特征不同共篩出13株菌，并依次編號為S-1、S-2、…、S-13。通過形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定出8種菌，分別為S-1血紅鞘氨醇單孢菌(Sphingomonassanguinis)、S-3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、S-5Massiliasp.、S-7解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、S-8Sphingobacteriumsp.、S-11蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、S-12Pedobactersuwonensis和S-13Delftiasp.，其菌落圖及菌落形態(tài)特征分別見圖1和表1，革蘭氏染色結(jié)果見圖2。

圖2 曲房空氣中細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢圖Figure 2 The bacterial Gram staining microscopy chart from the air of Daqu fermentation room (100×)

表1 曲房空氣中細(xì)菌的菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of bacterial colony in the air of Daqu fermentation room

圖1 曲房空氣中細(xì)菌群落形態(tài)圖Figure 1 The pictures of bacterial colony isolated from the air of Daqu fermentation room

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 PCR擴(kuò)增 通過手提法提取菌株基因組DNA，采用核酸蛋白微量檢測儀檢測DNAOD260nm/OD280 nm為1.70～1.90，表明DNA質(zhì)量較好，可用于PCR擴(kuò)增。由圖3可知，1 500 bp處出現(xiàn)清晰可見的熒光條帶，表明產(chǎn)物可用于分析和測序。

圖3 菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 3 Electrophoresis of PCR amplification products of strains

2.2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，將其16S rDNA序列在Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明其與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已知菌的16S rDNA序列具有100%相似性，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以判斷為同種。將相似性較高的13株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示，其中芽孢桿菌屬最多，與何明國等[17-19]的研究結(jié)果一致，這是由于空氣中缺乏水分和營養(yǎng)物質(zhì)因而不利于微生物生長，芽孢桿菌屬的菌株可以產(chǎn)生芽孢，具有極強(qiáng)的抗逆性，對惡劣的環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性。此外，張明春等[20-21]對大曲微生物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬在大曲中為絕對優(yōu)勢屬，其優(yōu)勢細(xì)菌主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等，其在釀酒環(huán)境中普遍存在，對白酒發(fā)酵及風(fēng)味形成都具有重要影響。另一方面，在曲房空氣中分離出大量具有良好釀造性能的細(xì)菌，也表明經(jīng)過長期的生產(chǎn)，曲房空氣中細(xì)菌群落與大曲生產(chǎn)密切相關(guān)[22]。

圖4 高溫大曲曲房空氣中細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA sequence and other relative species from the air of Daqu fermentation room

高溫大曲曲房空氣中分離出的8種菌株，其中，S-13Delftiasp.能夠利用L-苯丙氨酸、乳糖、葡萄糖、蔗糖等[23]，其在增塑劑和除草劑等的生物降解方面也有重要作用[24]；S-11蠟樣芽孢桿菌能分解碳水化合物且不產(chǎn)氣，在葡萄糖肉湯中厭氧培養(yǎng)產(chǎn)酸[25]；S-7解淀粉芽孢桿菌會影響醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)，可以通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生四甲基吡嗪、2-戊基呋喃和庚醇等多種香味物質(zhì)成分[26]。

2.3 細(xì)菌特性分析

2.3.1 耐受性能 前期試驗發(fā)現(xiàn)，高溫大曲曲房空氣中分離得到的細(xì)菌在pH>4.0時均能很好地生長，且其最大耐乙醇濃度為7%，故根據(jù)細(xì)菌的生長繁殖情況，選取pH 4.0、7%乙醇濃度條件下對比研究8種菌的耐酸性和耐乙醇能力，其結(jié)果見圖5。

由圖5可知，高溫大曲曲房空氣中分離的8種細(xì)菌在pH 4.0條件下，其耐受性能均較差，S-13的耐受能力最低，但S-11的耐酸能力顯著高于其他菌株(P<0.05)。7%乙醇濃度下，8株菌的耐受性能均較差，但S-7耐受能力顯著高于其他菌株(P<0.05)，且其他菌株均有一定的耐受能力。

2.3.2 產(chǎn)酶特性 分離純化后的細(xì)菌分別接種至產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)淀粉酶和產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基中，其產(chǎn)酶菌落圖見圖6。

圖6 產(chǎn)酶菌落圖Figure 6 Enzyme-producing colony diagram

由圖7可知，同時具有纖維素分解能力、淀粉和蛋白水解能力的菌株為S-3(枯草芽孢桿菌)、S-7(解淀粉芽孢桿菌)、S-11(蠟樣芽孢桿菌)；具有纖維素分解能力和淀粉水解能力的菌株為S-5(Massiliasp.)；僅具有淀粉水解能力的菌株為S-13(Delftiasp.)。這些菌株有待進(jìn)一步研究以探討其在制曲及釀酒中應(yīng)用的可能性，與王濤等[18]的研究結(jié)果相似。產(chǎn)纖維素的4株菌不僅形成菌落，而且還有明顯的透明圈，表明其產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，可對其進(jìn)行進(jìn)一步研究；產(chǎn)淀粉酶的5株菌中有4株的透明圈與菌落面積的比值為1.0～2.0，且S-13菌的比值達(dá)5.1，說明這株菌高產(chǎn)淀粉酶，有進(jìn)一步研究的價值；產(chǎn)蛋白酶的3株菌透明圈與菌落面積的比值為1.5～3.0，其中S-7菌的比值最大為2.77，表明S-7菌對蛋白質(zhì)的水解能力顯著強(qiáng)于其他細(xì)菌(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 高溫大曲曲房空氣中細(xì)菌的耐受性Figure 5 The bacteria tolerance research in the air of high temperature Daqu fermentation room

顏林春[27]通過高溫大曲中微生物產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等特性，以透明圈法從分離到的芽孢桿菌中篩選出產(chǎn)特定酶類(纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等)酶活性髙的芽孢桿菌。通過耐熱性、抑制性和拮抗性試驗表明，產(chǎn)特定酶類且酶活性高的芽孢桿菌菌株均能應(yīng)用于強(qiáng)化高溫大曲制作。產(chǎn)酶試驗發(fā)現(xiàn)，從醬香型大曲曲房空氣微生物中分離得到的芽孢桿菌大多能分泌高活性的胞外產(chǎn)物酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶。此外，通過菌株部分釀造性能分析發(fā)現(xiàn)，有些菌株具備2種以上的釀造特性，如S-3菌株同時具備纖維素利用、淀粉水解和pH 4.0 耐受能力較好；S-11菌株同時具備蛋白質(zhì)分解、纖維素分解、淀粉水解且7%乙醇耐受能力較好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 高溫大曲曲房空氣細(xì)菌的產(chǎn)酶特性Figure 7 The bacteria enzyme production features research in the air of high temperature Daqu fermentation room

2.4 優(yōu)勢菌株發(fā)酵產(chǎn)物分析

根據(jù)產(chǎn)酶特性篩選出3株優(yōu)勢菌株，分別為S-3(枯草芽孢桿菌)、S-7(解淀粉芽孢桿菌)、S-11(蠟樣芽孢桿菌)，其生長曲線見圖8，發(fā)酵產(chǎn)物分析結(jié)果見表2。由圖8 可知，3株菌均能在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上良好生長，前期生長速率快，4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)20 h時的OD值達(dá)最大，隨后進(jìn)入平緩期。

圖8 S-3、S-7、S-11生長曲線Figure 8 S-3,S-7,S-11 Growth curve

由表2可知，3-羥基-2-丁酮是這些菌的優(yōu)勢產(chǎn)物，且均會產(chǎn)生一些吡嗪類物質(zhì)，如2-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，還含有少量酚類、酯類等芳香類物質(zhì)。菌株S-3共產(chǎn)生7種風(fēng)味產(chǎn)物，其中3-羥基-2-丁酮、2-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪含量較高，其他醇類、酚類物質(zhì)含量較少；菌株S-7共有10種代謝產(chǎn)物，其主要代謝產(chǎn)物除3-羥基-2-丁酮、2-甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪外，還含有大量的2,3-丁二醇，其他酚類物質(zhì)含量較少；菌株S-11產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類較多(共13種)，3-羥基-2-丁酮含量>4.000 μg/mL，并產(chǎn)生大量己酸，其他酚類種類較多。3-羥基-2-丁酮又名乙偶姻，具有甜香、奶制品香，并帶有脂肪風(fēng)味；3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇是產(chǎn)生香味物質(zhì)四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[28]，四甲基吡嗪又名川穹嗪，是許多食品的風(fēng)味物質(zhì)，同時也是其他香味物質(zhì)的前體，具有焙烤香，是中國白酒特有的功能性成分。黃永光等[29]從醬香型大曲中篩選出枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及解淀粉酶芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物有乙偶姻、吡嗪等物質(zhì)。

表2 優(yōu)勢菌株發(fā)酵產(chǎn)物分析?Table 2 Analysis of fermentation products of dominant strains μg/mL

3 結(jié)論

(1) 以川北某醬香型酒廠高溫大曲曲房空氣微生物為原料，經(jīng)分離、純化培養(yǎng)得13株菌，通過形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定出8種菌，分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、Pedobactersuwonensis、血紅鞘氨醇單孢菌(Sphingomonassanguinis)、Massiliasp.、Delftiasp.和Sphingobacteriumsp.。

(2) 對8株菌進(jìn)行產(chǎn)酶特性試驗，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的耐受性較強(qiáng)，并且芽孢桿菌大多能分泌高活性的胞外產(chǎn)物酶，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌均能產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶，可以加速釀酒原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等轉(zhuǎn)變?yōu)樘恰被岬取?/p>

(3) 由產(chǎn)酶特性得到的3株優(yōu)勢功能菌株分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。按體積分?jǐn)?shù)10%接種至高粱汁發(fā)酵液中，運(yùn)用GC-MS技術(shù)分析其代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-羥基-2-丁酮是這些菌的優(yōu)勢產(chǎn)物，且四甲基吡嗪含量較高。在利用現(xiàn)代分子技術(shù)解析醬香型大曲細(xì)菌的基礎(chǔ)上，后續(xù)可進(jìn)一步對真核微生物區(qū)系及其相互協(xié)同制約的代謝機(jī)制進(jìn)行分析和探討。