王悄悄，李超龍，張會芳，劉旭苗，鄭 峰，汪春暉，潘秀珍，曹祥榮

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種重要的人獸共患病病原菌，不僅可以通過上呼吸道感染豬，也可以通過皮膚傷口或經口途徑感染人[1]。人感染該菌的臨床癥狀表現為腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎、心內膜炎等，病死率高達12.8%，常見后遺癥包括聽力損失和前庭功能障礙[2]。S.suis血清型眾多，目前較為公認的有29種[3-4]，全世界已經報道了1 600余例人類感染病例，其中75%的病例是由2型豬鏈球菌(S.suis2)引起的[5]。S.suis2對公共健康造成了嚴重威脅，因此，對于S.suis2致病機制的研究具有重要意義。

CovR最早發(fā)現于化膿鏈球菌，通常與CovS(CsrS)共同組成二元信號轉導系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCS)，主要參與透明質酸莢膜合成基因hasAB的調控[5]。課題組前期對CovR的研究發(fā)現，CovR是全面調節(jié)基因表達的負調控因子，其調控的下游靶基因可能涉及多個已知毒力因子及潛在的毒力因子[6]，然而，在S.suis2 05ZYH33基因組中未發(fā)現covS的同源基因，表明CovR是一個孤兒調控因子。近期，有研究發(fā)現絲/蘇氨酸激酶可以對多種TCS發(fā)揮磷酸化調控，在無乳鏈球菌中STK1可以在體外對CovR/S的生物反應調節(jié)因子組分CovR進行磷酸化[7]。在S.suis2中也存在絲/蘇氨酸激酶STK，研究表明STK通過磷酸化底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基以達到調控靶蛋白的目的，從而在轉錄與翻譯、細胞壁合成、細胞分裂、應激反應以及毒力因子的表達[8-11]等過程中發(fā)揮著重要作用。然而S.suis2編碼的STK是否能對全局性毒力負調控因子CovR進行磷酸化作用尚不清楚。本研究參照Molle等[12]的實驗方法，在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中共表達STK與CovR蛋白，旨在探討STK對CovR的磷酸化作用以及尋找CovR關鍵磷酸化位點，為進一步探索CovR磷酸化機制及S.suis2的致病作用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1菌株、質粒及引物S.suis2中國強毒株05ZYH33分離自2005年四川資陽中毒性休克癥病人，實驗室保存；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)菌株購自北京全式金公司；pMD-19T購自日本TaKaRa公司；pCDFDuet-1購自美國Novagen公司；引物由上海賽百盛公司合成，堿基序列見表1。

表1 實驗所用引物

1.2主要試劑與儀器 限制性內切酶BamH I、Hind III、XhoI、SalI、T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自美國Promega公司；Ni-NTA親和層析柱購自南京金斯瑞公司；抗CovR蛋白單克隆抗體實驗室保存[13]；抗蘇/絲/酪氨酸磷酸化抗體、羊抗兔(鼠)IgG(HRP標記)購自北京Bioss公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。

1.3重組表達質粒的構建及鑒定 以S.suis2 05ZYH33基因組DNA為模板，分別以covR-F/covR-R、stk-F/stk-R為引物，PCR擴增目的基因covR和stk，隨后使用DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收?；厥盏腸ovR片段和pCDFDuet-1質粒經BamH I、Hind III雙酶切、T4 DNA連接酶連接并轉化至E.coliDH5α后，獲得pCDFDuet-1::covR重組質粒(其表達產物命名為CovR1)。將上述pCDFDuet-1::covR重組質粒和stk片段經NdeI、XhoI雙酶切連接轉化后獲得pCDFDuet-1::covR/stk重組質粒(其表達產物命名為CovR2)。pCDFDuet-1::covR、pCDFDuet-1::covR/stk質粒經酶切驗證正確后送蘇州金唯智公司測序。共表達質粒pCDFDuet-1::covR/stk構建示意圖見圖1。

圖1 共表達質粒pCDFDuet-1::covR/stk構建示意圖

1.4重組蛋白的表達純化 將構建好的重組質粒pCDFDuet-1::covR和pCDFDuet-1::covR/stk分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到BL21-pCDFDuet-1::covR及BL21-pCDFDuet-1::covR/stk重組蛋白表達菌株。將上述重組表達菌轉接于新鮮LB液體培養(yǎng)基(Spc抗性)中振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6，添加IPTG(終濃度為1 mmol/L)進行誘導。誘導結束后，進行超聲破碎(300 W，超5 s，停5 s)，離心收集蛋白上清液，并使用Ni-NTA親和層析柱進行蛋白純化，對純化后的CovR1、CovR2重組蛋白進行12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.5重組蛋白的Western blot鑒定及磷酸化檢測 將CovR1、CovR2蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，使用電轉印(濕轉恒流300 mA，60 min)將蛋白轉移至PVDF膜上，以本實驗室保存的抗CovR蛋白單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG(HRP標記)為二抗，對上述CovR1、CovR2蛋白進行特異性檢測。另外，以抗蘇氨酸磷酸化抗體為一抗，以羊抗兔IgG(HRP標記)為二抗，對CovR1、CovR2蛋白進行磷酸化檢測。

1.6CovR蛋白磷酸化位點質譜檢測 將純化后的CovR2蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍R-250染色液染色10 min，脫色液脫色2 h，割取目的條帶送北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司進行磷酸化質譜鑒定。

1.7定點突變質粒構建 根據質譜檢測結果，利用全基因合成技術合成covR基因點突變序列使CovR蛋白的潛在磷酸化位點突變?yōu)楸彼帷ovR基因點突變序列有以下4種：covRT(CovR中Thr磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRS(CovR中Ser磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRY(CovR中Tyr磷酸化位點突變?yōu)锳la)、covRA(CovR中所有磷酸化位點突變?yōu)锳la)。將4種covR基因點突變序列與pCDFDuet-1::stk質粒連接后轉化至E.coliDH5α中，涂布到含Spc抗性(100 μg/mL)的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，PCR驗證陽性克隆后，提取質粒送至蘇州金唯智公司測序，將測序正確的質粒分別命名為pCDFDuet-1::stk/covRT、pCDFDuet-1::stk/covRS、pCDFDuet-1::stk/covRY、pCDFDuet-1::stk/covRA。

1.8定點突變蛋白的誘導表達及純化 將上述4種突變重組質粒轉化至表達菌株E.coliBL21(DE3)中，并分別接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，按上述1.4步驟中蛋白純化方案進行定點突變蛋白的誘導表達及純化。純化后的重組突變蛋白分別命名為CovRT、CovRS、CovRY及CovRA。

1.9定點突變蛋白的Western blot鑒定及磷酸化檢測 參照步驟1.5，使用抗CovR蛋白單克隆抗體對CovRT、CovRS、CovRY及CovRA 4種突變蛋白進行Western blot鑒定，檢測純化后突變蛋白的特異性。另外，分別用抗蘇/絲/酪氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白進行磷酸化檢測，以鑒定突變蛋白的磷酸化特性。

2 結 果

2.1CovR重組表達質粒的酶切驗證 對pCDFDuet-1::covR重組質粒進行BamH I/Hind III雙酶切及BamH I單酶切驗證，單酶切條帶大小在4 500 bp左右，雙酶切條帶大小在500～750 bp、3 000～4 500 bp之間，與預期大小4 468 bp、687 bp、3 781 bp相符(圖2A)。對pCDFDuet-1::covR/stk進行NdeI單酶切鑒定，單酶切條帶大小在4 500 bp之上，與預期大小6 460 bp相符(圖2B)。結果表明上述兩個重組表達質粒構建成功。

A: M.DNA maker; 1.Plasmid pCDFDuet-1::covR; 2.BamH I digestion; 3.BamH I/Hind III digestion;B: M.DNA maker; 1.Plasmid pCDFDuet-1::covR/stk; 2.Nde I digestion

2.2CovR1、CovR2蛋白純化 對純化后的CovR1、CovR2重組蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，蛋白條帶在25 kDa附近，與預期大小26 kDa相符，且蛋白條帶單一，說明純化后的重組蛋白純度較高(圖3A)。

2.3CovR1、CovR2蛋白Western blot鑒定與磷酸化檢測 使用抗CovR蛋白單克隆抗體和特異抗蘇氨酸磷酸化抗體分別對CovR1、CovR2重組蛋白進行Western blot鑒定。在25 kDa附近有明顯的蛋白印記條帶，與目的蛋白大小(26 kDa)相符，說明CovR1、CovR2重組蛋白均可以與抗CovR蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應，表明CovR1、CovR2蛋白純化成功(圖3 B)。CovR1蛋白與抗蘇氨酸磷酸化抗體孵育后沒有目的條帶，而CovR2蛋白在相應位置處有目的條帶，說明單獨表達的CovR1蛋白未發(fā)生蘇氨酸磷酸化，而與STK蛋白共同表達的CovR2蛋白可以被磷酸化(圖3C)。結果表明CovR與STK在E.coliBL21(DE3)中共表達后，CovR發(fā)生了磷酸化修飾。

A: M.Protein marker; 1.CovR1; 2.CovR2；B: Anti-CovR monoclonal antibody; 1.CovR1; 2.CovR2；C: Anti-phosphothreonine antibody; 1.CovR1; 2.CovR2

2.4CovR2蛋白磷酸化位點的質譜檢測 將純化的CovR2進行蛋白磷酸化質譜檢測，發(fā)現CovR2蛋白的第45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸，第40、172、215位絲氨酸以及第225位酪氨酸發(fā)生了磷酸化修飾。

2.5CovR定點突變蛋白表達與純化 構建pCDFDuet-1::stk/covRT、pCDFDuet-1::stk/covRS、pCDFDuet-1::stk/covRY、pCDFDuet-1::stk/covRA重組質粒，經IPTG對誘導表達后純化CovRT(第45、148、150、159、168、194、219位Thr替換為Ala)、CovRS(第40、172、215位Ser替換為Ala)、CovRY(第225位Tyr替換為Ala)、CovRA(所有磷酸化位點替換為Ala)，對其進行12% SDS-PAGE鑒定，4種突變蛋白電泳條帶單一，說明純化的突變蛋白純度較高，條帶均在25 kDa上方，與預期大小26 kDa相符(圖4A)。使用抗CovR單克隆抗體對4種突變蛋白進行Western blot鑒定，均出現單一條帶，且條帶大小與預期相符(圖4B)。結果表明CovRT、CovRS、CovRY、CovRA定點突變蛋白純化成功。

A: M.Protein marker; 1.CovRT; 2.CovRS; 3.CovRY; 4.CovRA；B: Anti-CovR monoclonal antibody; 1.CovRT; 2.CovRS; 3.CovRY; 4.CovRA

2.6CovR關鍵磷酸化位點鑒定 使用特異抗蘇氨酸磷酸化抗體對純化的CovRT、CovRS、CovRY、CovRA定點突變蛋白進行蘇氨酸磷酸化檢測，結果顯示只有CovRS和CovRY可以被磷酸化，而CovRT和CovRA未檢測到磷酸化信號，說明45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸為CovR磷酸化位點。使用特異抗絲氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白檢測，結果顯示只有CovRT和CovRY可以被磷酸化，而CovRS和CovRA未檢測到磷酸化信號，說明40、172、215位絲氨酸為CovR磷酸化位點。使用特異抗酪氨酸磷酸化抗體對4種突變蛋白檢測，結果顯示只有CovRT、CovRS可以被磷酸化，而CovRY、CovRA未檢測到磷酸化信號，說明225酪氨酸是CovR磷酸化位點。以上結果表明CovR的絲/蘇/酪氨酸均可發(fā)生磷酸化修飾(圖5)。

A: Anti-phosphothreonine antibody; B: Anti-phosphoserine antibody; C: Anti-phosphotyrosine antibody；M: Protein marker; 1: CovR1; 2: CovR2; 3: CovRT; 4: CovRS; 5: CovRY; 6: CovRA

3 討 論

實驗室前期研究發(fā)現S.suis2 05ZYH33株基因組中存在反應調節(jié)因子CovR。構建covR敲除突變株，發(fā)現突變株的毒力和致病性明顯增強；比較野毒株和突變株的轉錄譜，發(fā)現突變株中有195個基因(占全基因組的8.9%)的轉錄水平發(fā)生了變化，其中193個基因呈上調表達，而2個基因呈下調表達。研究結果表明，在豬鏈球菌中CovR是全面調節(jié)基因表達的負調控因子[6]。除此之外，還通過基因克隆、雜交瘤技術制備了CovR重組蛋白和CovR單克隆抗體[13]；采用多種技術篩選到兩個CovR直接調控的靶基因[14]，并對多個受CovR調控的靶基因的生物學功能進行了研究[15-18]。

CovR通常與CovS(CsrS)共同組成二元信號系統(tǒng)，CovS/CovR最初是作為透明質酸莢膜合成基因hasAB的負調控子而被發(fā)現的[5]，隨后發(fā)現它不僅對透明質酸莢膜的產生起著負調控作用，還對外毒素、溶血素、鏈激酶、鏈道酶等其它毒力因子的轉錄表達起負調控作用[19]。課題組前期對S.suis2 05ZYH33株基因組進行分析，并未發(fā)現編碼CovS的同源基因，表明CovR在S.suis2中是一個孤兒調控因子。近期研究表明，在化膿鏈球菌中CovR作為負反應調節(jié)因子參與毒力因子的調控，通過質譜以及定點突變證實絲氨酸/蘇氨酸激酶STK可以使CovR蛋白的第65位蘇氨酸磷酸化[20]。在無乳鏈球菌中，STK1使CovR蛋白的第65位蘇氨酸磷酸化，磷酸化后的CovR不能與其靶基因的啟動子結合[21]。以上研究證實了在細菌中絲/蘇氨酸激酶系統(tǒng)與TCS系統(tǒng)之間存在交互作用，提示我們在S.suis2中絲/蘇氨酸激酶STK也有可能使CovR磷酸化，從而調節(jié)CovR蛋白的活性。

本研究將CovR與STK蛋白在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中共表達，通過對CovR2蛋白進行磷酸化質譜檢測，發(fā)現第45、148、150、159、168、194、219位蘇氨酸，第40、172、215位絲氨酸以及第225位酪氨酸為CovR蛋白的磷酸化位點。利用全基因合成技術合成covR基因點突變序列，使CovR蛋白的潛在磷酸化位點突變?yōu)楸彼幔Χc突變蛋白進行蘇氨酸、絲氨酸以及酪氨酸磷酸化檢測。蘇氨酸磷酸化檢測結果顯示CovRS、CovRY磷酸化信號仍然存在，CovRT、CovRA的磷酸化信號消失；絲氨酸磷酸化檢測結果顯示CovRT、CovRY磷酸化信號仍然存在，CovRS、CovRA的磷酸化信號消失；酪氨酸磷酸化檢測結果顯示，CovRS、CovRT磷酸化信號仍然存在，CovRY、CovRA的磷酸化信號消失。CovR定點突變蛋白的磷酸化檢測結果證實了CovR蛋白的絲/蘇/酪氨酸殘基均可發(fā)生磷酸化。除此之外，由于結果顯示CovR2蛋白酪氨酸殘基也發(fā)生了磷酸化，提示STK蛋白可能具有酪氨酸激酶的特性，但CovR是否作為STK直接磷酸化修飾作用底物，仍需要進一步深入研究。

本研究利用共表達載體在E.coliBL21原核表達系統(tǒng)中初步探究了絲/蘇氨酸激酶STK與CovR的磷酸化關系，通過蛋白磷酸化質譜技術以及對定點突變蛋白磷酸化檢測確定了孤兒調控因子CovR的關鍵磷酸化位點，為在2型豬鏈球菌中進一步探索CovR的磷酸化機制奠定了基礎。

利益沖突：無