曹得萍，張耀剛，姜博璠，李建華，龐明泉,4，陳 根

棘球蚴病是一種對人類危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，俗稱包蟲病。包蟲病最常見的兩種類型分別是細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染所致的細粒棘球蚴病和多房棘球蚴病。我國受包蟲病威脅的高危人口有5 000萬，被感染的家畜及其它動物超過億頭(只)[1]。包蟲病病程長，治療費用較高，給患者及其家庭帶來極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔，目前包蟲病仍然是我國西部農(nóng)牧區(qū)感染最為嚴重的人獸共患病之一[2]。多房棘球蚴病對人類的危害更大，感染后幾乎100%原發(fā)在肝臟，其它部位的病變是由肝臟轉移而來的，其生長方式類似惡性腫瘤，又稱為“蟲癌”[3]。目前對細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染后的免疫機制還不甚明了，本研究通過腹腔注射細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲原頭節(jié)建立繼發(fā)性細粒棘球蚴病和多房棘球蚴病Balb/c小鼠模型，利用流式細胞術探討感染細粒棘球蚴和多房棘球蚴小鼠脾臟和血液中T、B、Th1、Th2、Treg、NK細胞變化情況，旨在探討T、B、Th1、Th2、Treg、NK細胞在細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型中的免疫作用，為進一步研究細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染的免疫機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1建立細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型

1.1.1細粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 收集西寧市屠宰場綿羊肝臟細粒棘球蚴囊泡，在實驗室無菌狀態(tài)下收集囊內(nèi)原頭節(jié)，無菌含雙抗(青霉素1 000 U/mL，鏈霉素1 000 U/mL)洗滌3次，配成6 000個/mL懸液備用。選取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只小鼠右下腹0.5 mL原頭節(jié)懸液注射。

1.1.2多房棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 剖殺多房棘球蚴保種沙鼠，無菌取出多房棘球蚴囊泡，眼科剪剪碎，分離原頭節(jié)，無菌含雙抗(青霉素1 000 U/mL，鏈霉素1 000 U/mL)洗滌3次，配成6 000個/mL懸液備用。選取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只右上腹做一小手術切口，暴露右葉肝臟，注射0.2 mL原頭節(jié)懸液后縫合切口。6個月后剖殺小鼠，提取脾臟淋巴細胞。取20只小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水作為對照組。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠脾臟淋巴細胞分離 稱取0.1 g小鼠脾臟置于無菌小培養(yǎng)皿中，利用5 mL注射器芯在70目的篩網(wǎng)上研磨，去除纖維組織等，邊研磨邊加入勻漿沖洗液，使細胞全部通過篩網(wǎng)到小培養(yǎng)皿中。棄去篩網(wǎng)，組織研磨液經(jīng) 1 000 rpm/min離心 10 min，棄上清。用樣本稀釋液重懸組織細胞，將細胞懸液調整為2×108～1×109/mL的細胞濃度為宜，約使用 1 mL 樣本稀釋液重懸細胞，備用。淋巴細胞分離按照天津市灝洋生物制品科技有限責任公司的淋巴細胞分離試驗流程進行。

1.2.2小鼠血液淋巴細胞提取 小鼠進行眼球摘除采血，血液滴入一次性的抗凝真空抽血管，在無菌的塑料離心管中加入2 mL淋巴細胞分離液，在裝有小鼠血樣的真空管中加入等量PBS混勻。緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細胞分離液的離心管中，使血樣盡量位于提取液上層，然后1 500 rpm/min離心15 min。

1.2.3細胞抗體標記上機檢測 CD3+、CD4+、CD8+、CD19、CD25、CD16/CD32單抗孵育約30 min，上機檢測(機型：BD FACSCelesta)。

1.3統(tǒng)計方法 細胞比例以百分數(shù)表示，GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計圖制作，用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，兩組獨立樣本比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1流式細胞儀分析小鼠脾臟淋巴細胞亞群 T細胞在多房棘球蚴感染組(56.95±13.09)%和對照組(57.79±5.71)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=0.025，P>0.05)；NK細胞在多房棘球蚴感染組(12.3±5.65)%和對照組(11.02±4.03)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=0.800，P>0.05)。B、Th1、Th2、Treg細胞在多房棘球蚴感染組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(tB=4.239,P<0.05;tTh1=2.965,P<0.05;tTh2=2.403,P<0.05;tTreg=2.752，P<0.05)；T細胞在細粒棘球蚴感染組(64.71±21.26)%和對照組(57.97±5.71)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=1.271，P>0.05)；NK細胞在細粒棘球蚴感染組(10.97±3.56)%和對照組(11.02±4.03)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=0.029，P>0.05)，B、Th1、Th2、Treg細胞在細粒棘球蚴感染組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(tB=3.396,P<0.05;tTh1=3.539,P<0.05;tTh2=3.731,P<0.05;tTreg=2.197，P<0.05)。結果如表1和圖1、圖2。

表1 細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠脾臟淋巴細胞亞群比例變化

對照：無感染多房棘球蚴小鼠組；實驗：感染多房棘球蚴小鼠組

對照：無感染細粒棘球蚴小鼠組；實驗：感染細粒棘球蚴小鼠組

2.2流式細胞儀分析小鼠血液淋巴細胞亞群 T、B、Treg、NK細胞在多房棘球蚴感染組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(tT=0.029,P>0.05;tB=1.746,P>0.05;tTreg=2.183,P>0.05;tNK=1.690，P>0.05)，Th1、Th2在多房棘球蚴感染組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(tTh1=3.669,P<0.01;tTh2=4.302，P<0.01)；T細胞在細粒棘球蚴感染組(70.31±9.84)%和對照組(61.92±9.02)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=1.967，P>0.05)，Treg細胞在細粒棘球蚴感染組(6.29±3.39)%和對照組(7.39±2.18)%比較，二者差異無統(tǒng)計學意義(t=0.923，P>0.05)；B、NK、Th1、Th2細胞在細粒棘球蚴感染組和對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(tB=2.125,P<0.05;tNK=3.569,P<0.05;tTh1=6.532,P<0.05;tTh2=4.463，P<0.05)。結果如表2和圖3、圖4。

表2 細粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠血液淋巴細胞亞群比例變化

對照：無感染多房棘球蚴小鼠組；實驗：感染多房棘球蚴小鼠組

對照：無感染細粒棘球蚴小鼠組；實驗：感染細粒棘球蚴小鼠組

3 討 論

T淋巴細胞對腫瘤細胞有直接殺傷作用，承擔著腫瘤免疫監(jiān)視作用[4]。T淋巴細胞主要分為CD4+和CD8+T細胞亞群，在宿主防御反應和免疫介導的疾病中起著決定性作用[5]。在寄生蟲感染的免疫應答中，CD4+T細胞各亞群，尤其是輔助性T(Th)細胞具有關鍵作用。寄生蟲進入機體后，宿主體內(nèi)具有抗原特異的T、B細胞被誘導分化成效應細胞，對寄生蟲生長形成抑制或促進寄生蟲的死亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)Th1與Th2兩種細胞在寄生蟲感染的宿主免疫反應過程中發(fā)揮重要作用，棘球蚴通過增加Th2 型細胞因子表達和抑制Th1型細胞因子的表達來干預宿主的細胞免疫[7-8]。

本研究中，多房棘球蚴感染小鼠脾臟中Th1/Th2比值約為2.8∶1，說明多房棘球蚴感染后血液中主要以Th1介導的細胞免疫為主。多房棘球蚴組Treg細胞和B細胞數(shù)量與對照組相比較有所減少，說明機體的體液免疫有所抑制而細胞免疫起主導作用。究其原因可能是多房棘球蚴的生物學特性類似腫瘤，在多房棘球蚴寄生的微環(huán)境中寄生蟲釋放抗原刺激機體激發(fā)了細胞免疫。細粒棘球蚴感染小鼠脾臟中Th1/Th2比值約為1.6∶1，說明細粒棘球蚴感染后主要以Th2介導的體液免疫為主，小鼠體內(nèi)以Th2型T細胞的反應起主導作用。細粒棘球蚴的囊壁將囊內(nèi)容物與周圍肝臟組織隔絕，從而使宿主體液免疫幾乎不能影響到蟲體的存活和增殖。Rigano等[9]發(fā)現(xiàn)細粒棘球絳蟲主要抗原分子B可使PBMC產(chǎn)生Th1/Th2比值改變，傾向于病理免疫相關的Th2型反應，本實驗細粒棘球蚴感染組脾臟中的Th1/Th2比值結果與此文獻結果一致。

調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)通常是指CD4+CD25+Foxp3+T 細胞，是一種具有免疫抑制功能的細胞亞群，通過主動調節(jié)的方式抑制存在于機體內(nèi)潛在的自身反應性T細胞的活化與增殖，從而調節(jié)機體的免疫應答[10]，具有干擾免疫療法的作用[11]。機體感染寄生蟲后發(fā)生了抗寄生蟲感染免疫，機體產(chǎn)生免疫病理損傷，當寄生蟲感染進展到慢性期時，Treg細胞水平上升抑制炎癥反應，產(chǎn)生保護機體的作用[12]。Treg細胞在多房棘球蚴和細粒棘球蚴感染組小鼠脾臟中的變化有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在血液中Treg細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這可能是由于寄生蟲抗原在脾臟刺激各種淋巴細胞發(fā)生反應，Treg細胞則可能要起調節(jié)作用，故引起Treg細胞比例變化。但是血液中多房棘球蚴和細粒棘球蚴感染組Treg細胞變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這或許是本研究中樣本數(shù)量問題，又或許這本身就是多房棘球蚴和細粒棘球蚴感染后外周血淋巴細胞的一個特征。研究發(fā)現(xiàn)細粒棘球蚴感染小鼠6個月和12個月時肝臟髓源抑制性細胞和Treg細胞比例增加，提示在小鼠感染細粒棘球蚴中后期Treg細胞發(fā)揮了免疫調節(jié)作用[13]。

本研究的目的是分析感染這兩種棘球蚴后小鼠脾臟和血液免疫細胞的變化情況，為弄清感染棘球蚴后機體的免疫機制提供實驗依據(jù)。后續(xù)研究中將動態(tài)監(jiān)測小鼠脾臟和血液各淋巴細胞亞群變化情況，尤其從CD4+、CD8+、Treg細胞分型等分析多房棘球蚴和細粒棘球蚴感染過程中機體的免疫機制。

利益沖突：無