吳晨燕，楊 梅，王珂莉，劉鑫潔，劉思佳，馬儷珍,*

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)分中心（天津），天津 300384；2.天津市強源食品有限公司，天津 301700）

水產品保鮮包括冰藏保鮮、冷海水保鮮、微凍保鮮[1]、 凍結保鮮[2]、超冷保鮮、氣調保鮮、化學保鮮等方式。其中，冷凍保鮮不僅能延長產品保質期，且經濟成本較低，是一種比較常見的保鮮方式。冷凍保鮮通過將魚體的水分凍結成冰，使其體內的生化反應和微生物活動基本處于停滯狀態(tài)[3-4]，從而達到延長魚肉貨架期的目的[5-6]。 隨著冷鏈物流業(yè)的發(fā)展，冷凍品在-18 ℃環(huán)境下由生產地配送至全國各地也成為可能，但根據(jù)實際生產情況，冷凍水產品從廠家?guī)旆垦b載至物流車、物流車運輸、從物流車卸貨至目的地倉庫房、消費者購買產品帶回家這一系列過程中都伴隨著因溫度波動而導致產品品質下降的情況。魚肉在經歷冷凍-解凍循環(huán)過程中，其蛋白質發(fā)生不同程度的變性。研究發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，斑節(jié)對蝦和南美白對蝦[7]、尖吻鱸 魚肉[8]、脆肉鯇魚肉[9]等都存在感官品質和風味下降、蛋白和脂肪氧化、組織結構和功能特性變化等現(xiàn)象。

隨著市場上調理食品的興起，調味魚產品也越來越受到消費者的喜愛，因調味魚產品的保鮮方式以冷凍保鮮更為常見，調味后的魚肉產品在配送轉運過程中也伴隨著反復凍融過程，關于此過程產品品質變化的研究尚不深入。本實驗以調味開背斑點叉尾鮰為研究對象，將其速凍后在-18 ℃下凍藏，通過超高壓（ultra high pressure，UHP）和滾揉（tumbling，TB）兩種腌制方式制得開背調味魚產品，測定調味魚肉在5 次凍融循環(huán)過程中菌落總數(shù)、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reaction substances，TBARS）、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量及肌原纖維蛋白（myofibril protein，MP）相關指標，并通過掃描電子顯微鏡、紫外分光光度計、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀對MP的結構進行表征，以探究在凍藏過程中反復凍融循環(huán)次數(shù)對調味魚品質、結構和功能特性的影響，為開背調味魚新產品投入市場提供一定的數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點叉尾鮰、香辛料、調味料、姜、蔥、蒜購于天津市西青區(qū)紅旗農貿水產批發(fā)市場。

一水檸檬酸（食品級） 常州百運渡化工有限 公司；五香濃縮液 頂興（天津）食品科技發(fā)展有限 公司；硝酸銀、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HPP.L1-600/5超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；BVRJ-40真空滾揉機 嘉興艾博實業(yè)有限公司；FA25高速剪切分散乳化機 德國弗魯克 公司；Pro臺式掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-Word BV公司；MinI 4電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；Spectrum65 FTIR儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 斑點叉尾鮰魚處理

購買鮮活斑點叉尾鮰魚，經宰殺（分左右兩半胴體）、減菌化處理后，采用超高壓（UHP組）和滾揉（TB組）方式腌制魚體，將腌制好的魚體真空包裝后放入速凍機（-35 ℃）至中心溫度達-18 ℃（大約30 min），然后在-18 ℃冰箱冷凍貯藏，凍藏12 h后測定新鮮魚肉指標，此時凍融循環(huán)次數(shù)記為0（不同處理樣品分別記為UHP0d和TB0d）。總凍藏時間為100 d，每組樣品凍結數(shù)量為18 袋，期間每隔20 d，將全部樣品取出，置于流動水中解凍，直至魚體中心溫度達0～4 ℃，即完成第一次凍融循環(huán)（不同處理樣品分別記為UHP20d和TB20d），此時每組樣品留下3 袋用于指標的測定，其余樣品立即放入-18 ℃冰箱中繼續(xù)凍藏，20 d后再次將冰箱中的所有樣品從冰箱中取出，進行相同方式的凍融循環(huán)，以此類推進行第2、3、4、5次的凍融循環(huán)（UHP組中分別記為UHP40d、UHP60d、UHP80d和UHP100d，TB組中 分別記為TB20d、TB40d、TB60d、TB80d、TB100d）。每次凍融循環(huán)的樣品進行各項指標的測定。

超高壓腌制條件：食鹽質量分數(shù)11%、超高壓壓力200 MPa、保壓時間15 min。

滾揉腌制條件：食鹽質量分數(shù)10%、滾揉方式為呼吸式、真空度0.08 MPa、滾揉時間60 min。此處呼吸式滾揉的具體步驟是：抽真空正轉5 min→靜置2.5 min→反轉5 min→靜置2.5 min→正壓正轉5 min→靜置2.5 min→正壓反轉5 min→靜置2.5 min，再一次重復以上過程。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[10]。

1.3.3 TBARS值的測定

TBARS值測定參考馬儷珍等[11]的方法。

1.3.4 TVB-N含量的測定

準確稱取5 g絞碎的肉樣，置于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻，瓶口包上保鮮膜放入搖床振蕩30 min，過濾后濾液放入冷藏柜中備用。待半微量定氮蒸餾裝置加熱沸騰后，吸取5 mL濾液（以蒸餾水作為空白）加入凱氏蒸餾裝置反應室，再立即加入5 mL 10 g/L MgO溶液，塞住塞子，加蒸餾水液封。在反應裝置末端處用體積分數(shù)2%的硼酸作為接收液，液面以下接收5 min，液面以上接收1 min，之后用0.01 mol/L鹽酸標準溶液進行滴定，按式（1）計算TVB-N含量。

式中：V1表示樣液消耗鹽酸體積/mL；V2表示空白消耗鹽酸體積/mL；cB表示標準鹽酸濃度/（mol/L）；m表示樣品質量/g；V4表示樣液體積/mL；V3表示樣液定容后的體積/mL；14表示氮的摩爾質量/（g/mol）。

1.3.5 電子鼻分析氣味成分

稱取10 g剪碎魚肉（精確到0.001 g），放入樣品瓶中，待上機檢測。先用空氣清洗傳感器，清洗時間為300 s，然后通過真空泵將樣品中的氣體吸入到電子鼻中，進氣速率為0.8 L/min，檢測時間為200 s。每種魚肉樣品5 個平行，每個樣品測定一次。

1.3.6 MP相關指標的測定

1.3.6.1 MP的提取

參照Xiong Youling L.等[12]的方法進行鮰魚MP的提取，提取過程在4 ℃條件下操作。制備好的MP采用雙縮脲法測定MP的蛋白質量濃度，并放置于4 ℃的冰箱內備用。

1.3.6.2 總巰基含量的測定

總巰基含量的測定參考李鵬[13]的方法。在10 mL離心管中加入0.5 mL 2 mg/mL MP溶液、2.5 mL含8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸溶液（pH 8，每升Tris-甘氨酸溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g 乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））以及0.02 mL Ellman’s試劑，再加入20 μL 5,5’-二硫代雙 (2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）避光室溫反應25 min，立即在412 nm波長處測定吸光度（A412nm）。利用公式（2）計算總巰基含量。

式中：1.36×104表示摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ρ為雙縮脲法測得的蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6.3 二硫鍵含量的測定

二硫鍵含量的測定參照Thannhauser等[14]的方法。先取1 mol/L Na2SO310 mL，與100 mg DTNB充分混合，調節(jié)pH值至7.5，在38 ℃條件下通入氧氣直至溶液顏色從亮紅色變?yōu)榈S色，大約45 min，得到2-硝基-5-硫 代苯磺酸酯（2-nitro-5-thio- sulfobenzoate，NTSB）儲備液；NTSB使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。稱取3.755 g甘氨酸、0.88 g EDTA、12.6 g Na2SO3、236.32 g硫氰酸胍，用蒸餾水溶解并定容至1000 mL，再將NTSB儲備液與混合溶液按體積比1∶100稀釋，調節(jié)溶液pH值至9.5，即得NTSB使用液。在0.25 mL MP溶液中加入3 mL新制備的NTSB使用液漩渦振蕩均勻。將混合溶液避光室溫下放置25 min后測定其在412 nm波長處的吸光度，用摩爾吸光系數(shù)13900 L/（mol·cm）計算二硫鍵含量。

1.3.6.4 紫外光譜測定

以0.6 mol/L KCl緩沖液為空白，在230～350 nm波長范圍內建立基線，將MP用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至蛋白質量濃度為1 mg/mL，采用UV-1800紫外分光光度計在230～350 nm波長范圍內對MP溶液進行紫外光譜掃描。使用Origin 8.5軟件計算二階導數(shù)紫外光譜[15]。

1.3.6.5 FTIR測定

參考喻亞麗[16]的方法，將提取的MP凍干，取凍干樣品1 mg，經KBr壓片，用Spectrum65 FTIR儀對樣品進行紅外掃描。掃描范圍為1700～1000 cm-1。

1.3.6.6 掃描電子顯微鏡觀察微觀結構

將提取的MP真空冷凍干燥成凍干粉，取少量凍干粉均勻涂抹在膠墊上，鍍金處理60 s，用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構。測定參數(shù)：加速電壓為10 kV，束流強度為能譜點掃，探頭模式為背散射，實時觀察參數(shù)為684×684 像素，照片存儲參數(shù)為1024×2048 像素，放大1000 倍。

1.3.6.7 SDS-PAGE分析

參照Laemmli等[17]的方法，在0.25 mL 2 mg/mL MP溶液中分別加入0.25 mL、體積分數(shù)10%β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）和0.25 mL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品緩沖液（含4 g/100 mL SDS、20 mL/100 mL甘油、0.125 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），使MP質量濃度為1 mg/mL，沸水浴中加熱3 min后置于冰中冷卻，加入50 μL溴酚藍，以10000×g離心3 min。吸取上清液20 μL進行點樣，濃縮膠質量分數(shù)為4%，分離膠質量分數(shù)為12%。樣品在濃縮膠中電流為20 mA，進入分離膠后，電流改為40 mA。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗重復3 次，利用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果以平均值±標準差表示，采用Simplot 10.0軟件作圖，用SPSS 13.0軟件中的Tukey HSD進行差異顯著性分析 （P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 反復凍融過程中UHP和TB樣品菌落總數(shù)的變化

圖 1 反復凍融過程中UHP和TB樣品菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Changes in TBC of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

從圖1可以看出，UHP和TB樣品初始菌落數(shù)分別為3.41（lg（CFU/g））和4.86（lg（CFU/g）），前者顯著低于后者，而且在凍藏100 d、反復凍融5 次的過程中始終為UHP樣品菌落總數(shù)顯著低于TB樣品菌落總數(shù)。這是因為超高壓處理不僅能夠提高腌制速率，還具有冷殺菌作用[18]，尤其對芽孢菌有很顯著的殺滅作用[19]。UHP和TB樣品在凍融1 次后細菌總數(shù)分別為3.11（lg（CFU/g）） 和4.38（lg（CFU/g）），相比初始菌落總數(shù)均有所下降，這是因為加工好的產品經過速凍、-18 ℃凍藏后，微生物進入新的冷藏環(huán)境，在適應及滯留期部分被凍死，這與李秀霞等[20]的研究結果一致。凍融1 次后，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的繼續(xù)增加，UHP和TB樣品的菌落總數(shù)一直維持在較低水平，并沒有顯著增加，這是因為在凍藏條件下，微生物細胞內原生質或膠體脫水，溶質濃度增加，促使菌體蛋白質變性，同時冰晶體的形成還會使微生物細胞膜遭受機械性破壞。

2.2 反復凍融過程中UHP和TB樣品TBARS值的變化

從圖2可以看出，凍融初期，UHP和TB兩組樣品的TBARS值分別為0.04 mg/kg和0.06 mg/kg，兩者均處于 較低水平，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，TBARS值在凍融前3 次整體上變化不顯著（P＞0.05），3 次后有顯著升高趨勢 （P＜0.05），凍融4 次時，UHP、TB兩組樣品的TBARS值分別為0.065 mg/kg和0.074 mg/kg，前者顯著低于后者 （P＜0.05），這是因為超高壓處理具有抑制肉類脂肪氧化的作用[21]。即使凍融5 次，UHP、TB兩組樣品的TBARS值也僅分別升高至0.10 mg/kg和0.11 mg/kg，且兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。這說明UHP和TB產品在凍藏過程中脂肪氧化得到很好的控制，這可能與五香風味腌制液中姜、蒜、香辛料等所含有的天然抗氧化成分有關。

圖 2 反復凍融過程中UHP和TB樣品TBARS值的變化Fig. 2 Changes in TBARS values of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

2.3 反復凍融過程中UHP和TB樣品TVB-N含量的變化

圖 3 反復凍融過程中UHP和TB樣品TVB-N含量的變化Fig. 3 Changes in TVB-N contents of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

TVB-N含量是評價水產制品新鮮程度的重要指標之一。TVB-N含量與微生物數(shù)量高度相關，微生物作用下水產品中的蛋白質被分解產生氨及胺類等堿性含氮 物質[22]，使TVB-N含量升高，產品新鮮度下降。從圖3可以看出，凍融初期，UHP、TB兩組樣品TVB-N含量分別為5.34 mg/100 g和6.85 mg/100 g，含量較低，說明這兩種腌制方式加工的開背調味魚新鮮度比較高，這與菌落總數(shù)結果一致。凍融循環(huán)1 次后，兩組TVB-N含量迅速升高，隨著反復凍融循環(huán)次數(shù)的繼續(xù)增加，TVB-N含量呈緩慢升高趨勢，到凍融循環(huán)5 次，UHP、TB樣品的TVB-N含量分別為10.02、10.73 mg/100 g，均低于淡水魚鮮度TVB-N含量的限量（20.00 mg/100 g）[23]。這是因為凍藏過程中微生物作用受到抑制，蛋白質被分解為堿性含氮物質的過程也被抑制，即使后期凍融循環(huán)次數(shù)增加， 因微生物作用導致的TVB-N含量增加量也較小。在凍融循環(huán)過程中，UHP樣品的TVB-N含量始終顯著低于TB樣品（P＜0.05）。綜上，對于凍融5 次的開背調味魚，超高壓腌制比滾揉腌制能更好地保持其鮮度。

2.4 反復凍融過程中UHP和TB樣品氣味的變化

圖 4 反復凍融過程中UHP（A）和TB（B）樣品氣味的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis plots for odor changes of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

從圖4A可知，凍融循環(huán)0～3 次的UHP0d、UHP20d、UHP40d、UHP60d樣品較密集地分布在一起，而UHP80d、UHP100d樣品與UHP0d樣品分布距離較遠，說明當將樣品凍融循環(huán)4 次后，UHP樣品的風味與新鮮開背調味魚之間出現(xiàn)顯著差異。從圖4B可以看出，TB樣品中，TB60d、TB80d、TB100d樣品分布在不同的區(qū)域，與TB0d樣品相距較遠，說明當將樣品凍融循環(huán)3 次后，TB樣品的風味與新鮮開背調味魚之間出現(xiàn)顯著差異。以上結果與TBARS值結果基本一致，說明脂肪氧化對調理魚產品風味影響較大。

2.5 反復凍融過程中UHP、TB 樣品MP總巰基和二硫鍵含量的變化

巰基是蛋白分子中非常重要的功能基團，總巰基含量是蛋白氧化的一項重要指標，總巰基含量越低，蛋白氧化程度越高[24]?？値€基含量的降低是由于巰基氧化為二硫鍵[25]，所以總巰基含量降低對應著二硫鍵升高。

由圖5可以看出，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，UHP和TB魚肉產品蛋白氧化程度逐漸加強，表現(xiàn)為MP總巰基含量顯著降低（P＜0.05），二硫鍵含量顯著升高 （P＜0.05）。這是因為反復凍融過程中，冰晶體逐漸增大破壞了細胞結構，蛋白質周邊分散的粒子濃度繼續(xù)增加，加速蛋白質變性，蛋白質發(fā)生變性和聚集，會伴隨著巰基氧化形成二硫鍵[26-28]。在凍融循環(huán)0 次時，UHP、TB樣品的MP總巰基含量較高，分別為93.10、72.17 nmol/mg，二硫鍵含量較低，分別為26.88、29.11 nmol/mg。但凍融循環(huán)5 次后，總巰基含量顯著降低，二硫鍵含量顯著升高，其中UHP、TB總巰基含量分別為56.88、51.55 nmol/mg，二硫鍵含量分別為35.42、44.00 nmol/mg。UHP和TB樣品在各個凍融循環(huán)次數(shù)之間的MP總巰基含量和二硫鍵含量差異均達到顯著水平 （P＜0.05），表明超高壓腌制加工的開背調味魚蛋白氧化程度顯著低于滾揉腌制方式，這是因為滾揉腌制方式會伴隨著產熱產能的過程，物理狀態(tài)也有會發(fā)生一定程度的改變，而超高壓方式對產品結構影響較小，所以在反復凍融過程中，超高壓腌制調味魚產品的蛋白氧化程度低于滾揉腌制方式。

圖 5 反復凍融過程中UHP、TB樣品MP總巰基和二硫鍵含量的變化Fig. 5 Changes in total sulfhydryl group and disulfide bond contents of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

2.6 反復凍融過程中UHP、TB樣品MP的二階導數(shù)紫外光譜變化

圖 6 反復凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的 二階導數(shù)紫外光譜變化Fig. 6 Change in second-derivative UV spectra of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

蛋白質分子中的部分官能團具有特征性的紫外吸收區(qū)域[29]，色氨酸、酪氨酸的R基團含有苯環(huán)共軛雙鍵，分別在280 nm和275 nm波長處有吸收峰[30]。從圖6可以看出，在280～300 nm之間，不同凍融循環(huán)次數(shù)UHP和TB樣品MP的二階導數(shù)吸收光譜均在288、296 nm波長處出現(xiàn)極大值，在284、292 nm波長處出現(xiàn)極小值。在288 nm波長處的峰值是色氨酸、酪氨酸共同作用的結果，而在296 nm波長處的峰值可以單獨歸因于酪氨酸[31]。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，288 nm和296 nm處的峰值有明顯的藍移，這說明色氨酸、酪氨酸殘基從內部轉移到極性更高的區(qū)域，并由于構象的改變而暴露在蛋白的表面，這表明蛋白發(fā)生了一定程度的氧化。

2.7 反復凍融過程中UHP和TB樣品MP的FTIR分析結果

圖 7 反復凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的FTIR變化Fig. 7 Changes in FTIR spectra of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

蛋白質的肽鍵有幾個特征振動帶，包括酰胺I帶（1600～1700 cm-1）、酰胺II帶（1500～1600 cm-1）和酰胺III帶（1200～1300 cm-1）[32]，其中酰胺I和酰胺III帶對于探討蛋白質的二級結構十分有用[33]，可定量分析獲得各種二級結構的相對含量。酰胺I帶主要來自C＝O 的伸縮振動[34]，酰胺III帶來源于肽鍵的C—N伸縮振動和N—H面內振動。圖7為不同凍融循環(huán)次數(shù)的UHP、TB樣品MP的FTIR圖，對酰胺I帶（1700～1600 cm-1） 譜峰進行傅里葉自轉積譜分析（半峰寬810，增強因子f＝211），結合Origin軟件里的Savitsk-Golay函數(shù)得到各個峰區(qū)對應的相對面積，即為各二級結構的相對含量[35]，凍融過程中UHP、TB樣品MP二級結構的相對含量見表1。

表 1 凍融過程中UHP、TB樣品MP二級結構的相對含量Table 1 Relative contents of secondary structures in UHP and TB samples during freeze-thaw cycles

由表1可以看出，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，UHP、TB樣品MP的α-螺旋、β-轉角相對含量降低，β-折疊、無規(guī)卷曲相對含量升高，并且UHP樣品MP的α-螺旋相對含量下降趨勢比TB緩慢。α-螺旋相對含量的減少表明魚肉蛋白內部分子中的疏水基團暴露，表面疏水性增大。由于魚肉水分在反復凍融過程中不斷遷移，因此β-轉角結構難以被維持，其相對含量出現(xiàn)較大幅度的下降，凍融5 次后，UHP、TB樣品MP的β-轉角相對含量分別將至10.21%和11.88%。在4 種二級結構中，β-轉角相對含量最低，這可能是因為本實驗在腌制魚肉時添加了葡萄糖和白糖，小分子的糖類有助于MP形成片層結構，保持蛋白的分散結構[36]。與凍融0 次相比，凍融5 次后UHP樣品的β-折疊相對含量增加量（3.40%）高于TB樣品的β-折疊增加量（2.44%）。說明利用超高壓和滾揉腌制加工的開背調味魚在反復凍融過程中，盡管蛋白質會發(fā)生二級結構的變化，但魚肉蛋白質仍能維持一定的穩(wěn)定性，且超高壓處理效果更優(yōu)。

2.8 反復凍融過程中的UHP、TB樣品MP的SDS-PAGE分析結果

由圖8可以看出，UHP、TB樣品MP的條帶包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、副肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白，這些條帶在電泳圖中從上而下依次排列，與Sánchez-Alonso等[37]報道的結果一致。在凍融循環(huán)0～2 次，MHC、副肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白條帶變化并不明顯；隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，尤其是凍融循環(huán)4～5 次時，MHC條帶變細，肌動蛋白條帶變淡，說明反復凍融使蛋白發(fā)生了降解。因為在加工和凍藏過程中MP中MHC比肌動蛋白和肌原蛋白更容易氧化[38]， 從圖8中也觀察到MHC條帶比其他條帶變化較為明顯，且TB組的MHC蛋白條帶比UHP組樣品明顯變淡變細，這一結果與樣品的總巰基和二硫鍵含量的變化結果一致，均是凍融循環(huán)次數(shù)對UHP組樣品的 影響較小。盡管隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，蛋白條帶略有變化，但在凍融5 次時，仍能清晰可見5 條條帶，說明超高壓和滾揉腌制的開背調味魚在反復凍融5 次后產品仍在可接受范圍，沒有發(fā)生明顯的蛋白氧化現(xiàn)象。

圖 8 反復凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的SDS-PAGE變化Fig. 8 Changes in SDS-PAGE patterns of MPs in UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

2.9 反復凍融過程中的UHP、TB樣品MP的微觀結構變化

圖 9 反復凍融過程中UHP、TB樣品MP的微觀結構變化Fig. 9 Microstructure changes of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

凍融0 次時，UHP、TB樣品MP冷凍干燥粉末表面平滑、結構致密、兩者之間沒有明顯差異（圖9A1、B1）。當反復凍融1 次時，UHP、TB樣品MP表面相對平整，有微小褶皺，相比較而言，TB樣品的褶皺比UHP樣品更明顯（圖9A2、B2）。當反復凍融2 次時，UHP樣品MP整體呈現(xiàn)塊狀結構，但出現(xiàn)細小的孔洞；而TB樣品褶皺增加，表面微小的孔洞也增多，且呈蜂窩狀，表面結構比UHP樣品變得更粗糙（圖9A3、B3）。

隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加（3～5 次），UHP、TB樣品MP表面的褶皺、孔洞變化均不明顯，但TB樣品褶皺程度均比UHP樣品明顯。這說明魚肉經反復凍融循環(huán)，蛋白發(fā)生變性和氧化，會影響到MP的結構完整性，表現(xiàn)在MP表面會出現(xiàn)孔洞和褶皺。相比較而言，UHP樣品比TB樣品的結構破壞程度略輕，這與總巰基含量、二硫鍵含量、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜等分析結果一致。

3 結 論

UHB、TB開背調味魚在反復凍融過程（1～5 次）中品質變化如下：菌落總數(shù)始終維持在較低水平；隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，TBARS值在凍融前3 次總體變化不顯著（P＞0.05），3 次后有顯著升高趨勢；TVB-N含量呈緩慢升高趨勢，但凍融循環(huán)過程中始終低于淡水魚鮮度TVB-N 20.00 mg/100 g的限量；凍融循環(huán)3～4 次后，樣品的風味與新鮮開背調味魚之間出現(xiàn)顯著差異。

UHB、TB開背調味魚在反復凍融過程（1～5 次）中MP特性變化如下：總巰基含量顯著降低（P＜0.05），二硫鍵含量顯著升高（P＜0.05）；α-螺旋、β-轉角相對含量降低，β-折疊、無規(guī)卷曲相對含量升高；MHC、肌動蛋白條帶均有不同程度的變淺變細；掃描電子顯微鏡觀察微觀結構發(fā)現(xiàn)，凍融2 次時，樣品表面明顯出現(xiàn)孔洞、褶皺，表面結構粗糙。

對比UHP、TB樣品發(fā)現(xiàn)，UHP樣品的各指標變化趨勢明顯低于TB樣品，說明UHP腌制方式可以延緩開背調味魚在反復凍融過程的品質變化。