陸敏濤，任廷遠,2,3,*，楊 建，陸龍發(fā)，秦禮康

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試貴陽分中心，貴州 貴陽 550006；4.貴州玄德生物科技股份有限公司，貴州 貴陽 550016）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病群[1]。 隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病機率越來越高，據(jù)估計，2045年，將有近7億糖尿病患者，長期高血糖可對人體機能造成巨大的損害，因此糖尿病的防治迫在眉睫[2]。目前對于糖尿病的治療措施一般采用注射胰島素同時口服合成藥的方法，常用的降糖藥物雖然具有較好的效果，但是，長期使用藥物會對身體的正常生理功能產(chǎn)生嚴重的不良影響[3]。因此，研究預防糖尿病的新型藥物或輔料很有必要，來源于食品或藥物食物中的天然活性成分因其健康、安全、作用溫和等特點而備受人們的青睞。

花椒是指植物花椒樹（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）的成熟果皮，花椒樹屬蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）[4]，主要分布于我國四川、重慶、河北、湖南、吉林省以及東南亞一些國家。據(jù)《詩經(jīng)》記載，我們的祖先早在兩千多年就已經(jīng)開始使用花椒[5]，目前全世界花椒種類大約有250余種，而我國花椒種類高達50余種，約占全世界的五分之一，從種植面積和數(shù)量來看，我國是花椒產(chǎn)業(yè)的大國[6]?；ń肥俏覈鴤鹘y(tǒng)調(diào)味品之一，含揮發(fā)油等多種成分[7]，具殺菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、抗?jié)?、驅蟲抗寒等多種功能[8]，是醫(yī)藥和食品的原料[9-10]，具有極高的藥理性能和廣泛的應用范圍。

目前，關于花椒對糖尿病的治療，人們主要對花椒麻素的降糖降脂方面進行了大量研究，花椒麻素是產(chǎn)生麻味風味的主要來源[11-12]，You Yuming等[13]研究表明，花椒麻素的降糖作用可能是通過上調(diào)肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCK）、葡萄糖激酶（glucokinase，GK）和葡萄糖-6-磷 酸酶（gucose-6-phosphatase，G6Pase）的表達量以及修復受損的胰腺β細胞從而上調(diào)胰腺中胰十二指腸同源盒1 （pancreatic-duodenal homeobox 1，PDX-1）、GK和葡糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）2的mRNA水平和蛋白表達量而實現(xiàn)的。Ren Tingyuan等[14]研究表明，花椒麻素對糖尿病大鼠的降糖機制是激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信號通路，介導GLUT4從細胞質快速轉運到細胞膜，達到降糖效果[15]。陳朝軍[16]研究表明，花椒素和辣椒素能使大鼠體質量增加速率減慢，減輕大鼠的脂肪肝癥狀，對膽固醇代謝循環(huán)紊亂有一定的改善作用。游玉明等[17]研究發(fā)現(xiàn)花椒麻素有改善糖尿病導致的腸道菌群紊亂的作用，灌胃花椒麻素后，盲腸內(nèi)容物中某些益生菌數(shù)量顯著增加，而某些條件致病菌數(shù)量顯著降低?，F(xiàn)階段對于花椒的研究甚多，但鮮見花椒精油治療糖尿病的 報道。然而，國內(nèi)花椒的銷售主要以鮮椒、干椒和低麻度花椒油等初級產(chǎn)品為主，而花椒的精深加工產(chǎn)品非常匱乏，這將阻礙花椒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，挖掘花椒的附加值以提高其經(jīng)濟效益、增加椒農(nóng)收入，是企業(yè)、政府和相關科技人員急需解決的一大難題，而開展花椒精油的功能性評價，是解決花椒向精細化加工的又一條有效途徑。

目前，花椒功能的探究仍處于初步探索階段，本實驗選用不同濃度的花椒精油對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的1型糖尿病小鼠模型進行灌胃實驗，旨在探討花椒精油對1型糖尿病小鼠糖代謝的影響及可能機制，有助于促進對花椒精油的認識，為花椒精油的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

紅花椒精油（由陜西韓城產(chǎn)大紅袍花椒經(jīng)超臨界CO2萃取后，用分子蒸餾分離而得）由貴州玄德生物科技股份有限公司提供。

昆明種雄性小鼠50 只（SPF級，體質量22～24 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）20120008）由重慶騰鑫生物技術有限公司提供。

STZ 美國Sigma公司；DNA凝膠回收試劑盒 德國Qiagen公司；總RNA提取試劑盒、糞便DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；熒光定量試劑盒、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）試劑盒、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）試劑盒、胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒、肝糖原試劑盒 南京建成生物科技有限公司；抗體 英國Abcam公司。

1.2 儀器與設備

L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；SpectraMax190連續(xù)波長多功能酶標儀 美國 Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；YH-A5003電子天平 合肥 五星衡器有限公司；血糖儀與配套血糖試紙 江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司；S1000梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Powerpac蛋白電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)、Trans-Blot Turbo蛋白轉膜儀 美國BIO-RAD公司；Nano Drop 1000微量紫外分光光度計 美國Thermo公司；Light Cycler Nano熒光定量PCR儀 美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)與樣品采集

動物實驗過程嚴格遵循現(xiàn)行的貴州醫(yī)科技大學實驗動物倫理委員會批準的相關法律法規(guī)進行，將50 只雄性昆明小鼠50只分為空白組（n＝10）和模型組 （n＝40）。小鼠經(jīng)過12 h禁食，不禁水，一次性注射 150 mg/kgmbSTZ造模，造模期間自由攝食、飲水。造模后第3天，禁食10 h，然后尾尖采集血樣，血糖儀測定空腹血糖濃度。當空腹血糖濃度高于11.10 mmol/L時，則造模成功[18]，并篩除造模失敗的小鼠。把40 只建模成功的小鼠分為4 組（n＝10），即花椒精油高劑量 15 mg/（kgmb·d）、中劑量9 mg/（kgmb·d）、低劑量3 mg/（kgmb·d）和模型組，模型組和空白組灌胃等劑量的大豆油。飼養(yǎng)期間均自由攝食，自由飲水，每隔7 d稱量體質量、攝食量、飲水量，根據(jù)體質量 （0.1 mL/kg）調(diào)整灌胃劑量。

各組小鼠連續(xù)灌胃28 d后禁食不禁水12 h，摘掉眼球取血完畢，斷頸處死，小鼠在冰上迅速被解剖取其肝臟，并用預冷的質量分數(shù)0.9%生理鹽水（預先配好滅菌后置于4 ℃冰箱）漂洗干凈，使用吸水紙將肝臟表面的水分擦干，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，測定時取出樣品，解凍后進行部分指標檢測[19]。

1.3.2 花椒精油的處理

為保證每只小鼠為等劑量灌胃（40 g體質量小鼠灌胃0.2 mL劑量）。準確稱取1.2 g紅花椒精油，加入400 mL大豆油后，充分混勻，配制成3 mg/mL 花椒精油溶液，再取少量分別用大豆油稀釋成1.8 mg/mL和0.6 mg/mL的花椒精油溶液，分別作為高 （15 mg/（kgmb·d））、中（9 mg/（kgmb·d））、低（3 mg/（kgmb·d））劑量組的灌胃質量濃度，空白組和模型組灌胃等劑量大豆油，每3 d配一次，于4 ℃保存。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 空腹血糖濃度的測定

在灌胃試劑后的第0、7、14、21、28天，禁食不禁水6 h，剪尾采血使用血糖儀測定空腹血糖濃度[20]。

1.3.3.2 口服糖耐量測定

連續(xù)灌胃28 d，禁食不禁水12 h，根據(jù)2.00 g/kgmb灌胃葡萄糖溶液，通過剪尾取血測定0、0.5、1 h和2 h時的血糖水平[21]，觀察各組小鼠血糖濃度的變化情況。血糖曲線下面積（area under the cure，AUC）根據(jù)公式（1）計算[22]。式中：cA、cB、cC和cD是灌胃葡萄糖溶液后0、0.5、 1 h和2 h的血糖濃度/（mmol/L）。

1.3.3.3 小鼠臟器指數(shù)的測定

小鼠臟器指數(shù)按公式（2）[23]計算。

1.3.3.4 血清理化指標測定

血清GHb、GSP、胰島素，肝臟肝糖原，左腿肌肌糖原水平測定操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.3.3.5 肝臟及骨骼肌mRNA和蛋白表達量檢測

使用試劑盒從組織樣品中提取總RNA，并反轉錄得cDNA，使用紫外分光光度計測定RNA濃度。應用PCR檢測相關基因的表達，以β-actin為內(nèi)參基因，并采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量，操作步驟如下：總RNA提取→反轉錄及cDNA的合成與檢測→熒光定量PCR檢測[24]。各基因的引物序列見表1。蛋白表達量檢測參考Ren Tingyuan等[14]的方法進行。

表 1 用于熒光定量PCR的引物序列和片段長度Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR and product sizes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.0和Origin 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析進行Duncan檢驗，差異顯著水平是0.05。

2 結果與分析

2.1 花椒精油對糖尿病小鼠攝食量、飲水量及體質量的影響

圖 1 小鼠攝食量（A）、飲水量（B）及體質量（C）的變化Fig. 1 Changes in food intake (A), water intake (B) and body mass (C) in mice

2.2 花椒精油對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)是衡量機體健康生長的重要指標，灌胃花椒精油28 d后斷頸處死，迅速于冰上解剖取各組織器官精確稱質量，計算各組小鼠的臟器指數(shù)，結果如表2所示。各組小鼠的心臟、脾臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。與空白組相比，模型組肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)分別顯著升高了15.60%、42.55%（P＜0.05），各劑量組比模型組均有降低，但無顯著性差異，這與陳小敏等[26]的研究結果一致。

表 2 花椒精油對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響（n＝10）Table 2 Effect of the essential oil from the ripe fruit percicarp of Zanthoxylum bungeanum Maxim. on viscreal indexes of diabetic mice (n= 10)

2.3 花椒精油對糖尿病小鼠空腹血糖濃度的影響

圖 2 糖尿病小鼠空腹血糖濃度的變化（n＝10）Fig. 2 Changes in fasting blood glucose concentration in diabetic mice (n = 10)

如圖2所示，空白組空腹血糖濃度一直在正常范圍內(nèi)波動，而模型組空腹血糖濃度較高，最高達到33.07 mmol/L，說明模型組小鼠糖尿病嚴重；3 個花椒精油劑量組與模型組相比，空腹血糖濃度明顯下降。經(jīng)過28 d治療給藥，花椒精油高、中、低劑量組空腹血糖濃度分別下降了28.60%、9.81%、12.57%，雖未能降到正常血糖水平，但有明顯的改善作用。

2.4 花椒精油對糖尿病小鼠口服糖耐量及曲線下面積的影響

圖 3 糖尿病小鼠血糖濃度（A）及AUC（B）的變化（n＝10）Fig. 3 Changes in glucose tolerance (A) and area under curve (B) in diabetic mice (n = 10)

各組小鼠飼養(yǎng)28 d禁食不禁水12 h，并且根據(jù)2.00 g/kgmb灌胃小鼠葡萄糖溶液，0、0.5、1、2 h血糖濃度變化如 圖3A所示，空白組的血糖水平在給葡萄糖溶液后升高，在0.5 h達到最高，并且在體內(nèi)調(diào)節(jié)2 h后降至正常水平。然而，模型組的血糖水平在給葡萄糖溶液后0.5 h達到最高值，隨后一直維持在高水平，證明造模成功?；ń肪椭?、低劑量組在0.5 h后緩慢下降，但都未回到初始血糖濃度。圖3B顯示，模型組AUC顯著高于空白組，與模型組相比，花椒精油中、低劑量組AUC降低但差異不顯著（P＞0.05），高劑量組顯著降低（P＜0.05）。實驗結果表明，不同劑量的花椒精油可以在一定程度上提高1型糖尿病小鼠的糖耐量，且高劑量效果更明顯。

2.5 花椒精油對糖尿病小鼠血清GHb與GSP水平的影響

圖4A顯示，模型組與空白組血清GHb與GSP水平有顯著性差異（P＜0.05），模型組GHb質量濃度比空白組顯著增加443.95%（P＜0.05），花椒精油高、中、低劑量組比模型組GHb質量濃度分別下降30.76%、13.32%、3.31%，但差異不顯著；模型組GSP濃度比空白組 增加138.78%（P＜0.05），花椒精油高、中、低劑量組GSP質量濃度與模型組相比分別下降37.29%、22.49%、16.65%，其中花椒精油高劑量組與模型組差異達到顯著性水平。

圖 4 糖尿病小鼠GHb（A）與GSP（B）水平的變化（n＝10）Fig. 4 Changes in GHb (A) and GSP (B) levels in diabetic mice (n = 10)

2.6 花椒精油對糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響

體內(nèi)能起到降糖作用的物質只有胰島素，其分泌狀況和受體功能與糖尿病密切相關[27]。圖5顯示，模型組的胰島素含量比空白組顯著下降16.5%（P＜0.05），表明模型建立成功后破壞了胰島細胞，使其分泌功能受到了抑制；而花椒精油高、中、低劑量組分別比模型組增加了10.29%、22.56%、13.97%。

圖 5 小鼠胰島素含量的變化Fig. 5 Changes in insulin concentration in mice

2.7 花椒精油對糖尿病小鼠肝糖原與肌糖原含量的影響

正常人體血糖水平過高時，會誘導胰島素產(chǎn)生，合成肝糖原和肌糖原，降低血糖水平。由圖6可知，模型組的肝糖原和肌糖原含量分別比空白組降低了37.22%和75.00%，花椒精油3 個劑量組的肝糖原和肌糖原含量較模型組均有提高，其中高劑量組提高最為顯著，其肝糖原與肌糖原含量分別提高了23.61%、 149.75%（P＜0.05）。

圖 6 糖尿病小鼠肝糖原與肌糖原含量的變化Fig. 6 Changes in liver glycogen and muscle glycogen contents in diabetic mice

2.8 花椒精油對糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌相關基因與蛋白 相對表達量的影響

連續(xù)灌胃花椒精油28 d后，解剖小鼠取肝臟與骨骼肌，采用實時熒光定量PCR測定肝臟PI3K、PKB、GLUT2和骨骼肌GLUT4mRNA的相對表達量，Western blot檢測肝臟PI3K(p110)、PKB和p-PKB（Ser473）的蛋白相對表達量（圖7A）。

由圖7B可知，PI3K（p110）和p-PKB（Ser473）蛋白相對表達量顯著提高，其中花椒精油高、中、低劑量組PI3K（p110）蛋白相對表達量分別上調(diào)了319.53%、251.21%和167.43%，p-PKB（Ser473）的蛋白相對表達量分別上調(diào)了7.64、6.12 倍和2.73 倍，PKB蛋白表達量變化不顯著。

圖7C顯示，與空白組對比，模型組PI3KmRNA和PKBmRNA相對表達量均顯著下調(diào)（P＜0.05）。給藥28 d后，與模型組相比，花椒精油高、中、低劑量組的PI3KmRNA表達量分別上調(diào)87.5%、54.7%、36.9%，PKBmRNA表達量分別上調(diào)53.4%、52.8%、27.7%；模型組的GLUT2和GLUT4mRNA相對表達分別比空白組下降了50.4%、63.4%，而花椒精油高、中、低3 個劑量組GLUT2和GLUT4mRNA表達量分別比模型組高77.05%、76.35%、49.22%和133.3%、110.8%、94.9%。

圖 7 糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌相關蛋白條帶（A、B）、蛋白相對 表達量（C）和mRNA相對表達量（D）Fig. 7 Western blot patterns (A, B), and relative protein expression (C) and relative mRNA expression (D) of liver and skeletal muscle proteins in diabetic mice

3 討 論

有研究表明，STZ對雄性鼠胰島組織損傷程度強于雌性鼠，雄性動物對STZ較雌性更為敏感，造模成功率較高[28]，因此本實驗采用KM種雄性小鼠進行實驗。STZ是一種從鏈霉菌中提取的抗生素，可特異性破壞胰島β細胞，引發(fā)胰島的自身免疫性炎癥損傷和凋亡，胰島β細胞受損導致胰島素分泌迅速減少而血糖大幅度升高，出現(xiàn)糖尿病的癥狀[29]。

多飲、多尿、多食和體質量減輕的“三多一少”癥狀及高血糖是糖尿病患者最直觀的癥狀，花椒精油對糖尿病小鼠的攝食量、飲水量及低體質量等癥狀具有明顯的改善作用，這與王祖哲等[30]的結果相一致?？崭寡菨舛戎饕从硻C體胰島素分泌能力，是判斷糖尿病的主要依據(jù)[31]，根據(jù)國際通用的糖尿病診斷標準，正常人空腹血糖濃度應在3.3～6.1 mmo1/L，高于11.1 mmol/L則被診斷為糖尿病[32]。實驗發(fā)現(xiàn)，花椒精油可降低空腹血糖濃度；糖耐量是指機體對葡萄糖的耐受能力，測定糖耐量可判斷出胰島素的分泌情況[33]，實驗結果顯示花椒精油能提高糖尿病小鼠的糖耐量，降低AUC；這與鐘禮云等[34]的研究結果一致。

GHb和GSP水平與血糖濃度成正比，主要表示過去4～8 周的平均血糖濃度控制水平，糖尿病患者的GHb和GSP水平均高于正常人[27]，花椒精油可降低糖尿病小鼠的GHb、GSP水平。劉紅芹等[35]發(fā)現(xiàn)葛根、桑葉、苦瓜、苦蕎配方可降低糖化GHb和GSP水平，而本次實驗結果也顯示，3 個劑量組的GHb和GSP水平較模型組均有降低。胰島素是體內(nèi)唯一的降糖物質，缺乏胰島素就會使血糖水平升高，血清胰島素含量是糖尿病患者的重要檢測指標[36]，沈玖君[37]研究4 種食源性植物配方對糖尿病小鼠的降糖機制表明，與模型組相比，植物配方根葉組、全葉組、混合粉小鼠血清胰島素水平分別升高了35.59%、23.60%和28.19%。本次實驗結果也顯示花椒精油可促進胰島素的分泌?？沙醪酵茢嗷ń肪蛯?型糖尿病小鼠具有降糖效果。

現(xiàn)有研究表明，許多藥物和植物可以影響胰島素相關基因的表達從而降低血糖[38-39]。胰島素通路有PI3K/PKB 和Ras-MAPK途徑，其PI3K/PKB是胰島素信號通路的主要途徑[40-41]。GLUT2/4是細胞吸收葡萄糖的載體，GLUT2在肝臟中高度表達，形成葡萄糖分子通道，促進肝臟吸收葡萄糖合成肝糖原，肝細胞吸收7%的葡萄糖；而GLUT4在肌肉和脂肪中具有高表達量，形成分子通道，使肌肉細胞能夠吸收葡萄糖并合成肌肉糖原，肌肉細胞吸收約70%葡萄糖，脂肪組織細胞吸收約7%[42-44]。當體內(nèi)血糖濃度升高時，胰島β細胞產(chǎn)生的胰島素與其受體底物結合，PI3K蛋白被激活并大量表達，激活后的PI3K又介導下游的PKB蛋白高表達并磷酸化，磷酸化的PKB蛋白誘導GLUT2和GLUT4大量表達并由細胞質轉位到細胞膜，形成葡萄糖通道促進細胞吸收葡萄糖形成糖原被機體利用從而降低血糖濃度[45-46]。結果顯示，經(jīng)28 d給藥治療，花椒精油3 個劑量組的肝糖原與肌糖原含量較模型組均有提高，其中高劑量組升高顯著，這與游玉明[47]的研究結果一致。此外，模型組的PI3K、PKBmRNA表達量與空白組相比顯著下調(diào)，證實了糖尿病小鼠 PI3K/PKB胰島素信號通路被抑制而導致高血糖，經(jīng)給藥治療后，高、中、低劑量的PI3K與PKB的mRNA相對表達量及PI3K（p110）與p-PKB（Ser473）的蛋白相對表達量比模型組分別顯著上調(diào)且呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象。測定肝GLUT2mRNA與骨骼肌GLUT4mRNA相對表達量發(fā)現(xiàn)，模型組的GLUT2mRNA和GLUT4mRNA比空白組相比顯著下降，而花椒精油3 個劑量組相比模型組顯著上升。結果表明，花椒精油對糖尿病小鼠糖代謝基因的相對表達有顯著影響。

綜上所述，花椒精油對1型糖尿病具有降糖作用，其可能機制是通過激活PI3K/PKB途徑，促使GLUT2/4的表達，促進肝細胞和肌細胞吸收葡萄糖，進而降低血糖濃度，達到治療糖代謝紊亂的效果。此外，本實驗僅從GLUT膜轉位的胰島素介導的PI3K途徑進行了研究，而對非胰島素介導的AMPK途徑影響需待進一步研究。