黃文媛，孫士杰，唐宏震，蘇智芳，鐘秦迪，劉幽燕，李青云

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

引 言

苯酚作為一種重要的有機化工基礎(chǔ)原料在石油精煉、皮革制造、樹脂合成、香料生產(chǎn)等行業(yè)廣泛應(yīng)用，由此產(chǎn)生大量含酚工業(yè)廢水，嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境，并且苯酚是一種難降解的有毒污染物，即便是低濃度也危害水生生物與人類身體健康[1-2]。因此，世界各國對含酚工業(yè)廢水的排放制定了非常嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)，例如，美國環(huán)境保護署將苯酚列入優(yōu)先污染物名單，規(guī)定處理后的廢水苯酚濃度最大不超過0.1 mg·L-1，而世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中的苯酚含量小于1μg·L-1[3-4]。采用物理、化學(xué)方法去除含酚工業(yè)廢水通常費用較高，且容易造成環(huán)境二次污染。相對而言，生物法清潔、高效，環(huán)境效益突出，愈來愈受到重視[5-6]。但是，生物法在運行過程中存在生物量流失、系統(tǒng)運行不穩(wěn)定等現(xiàn)實問題，因此，采用固定化細胞技術(shù)解決生物系統(tǒng)的上述問題是目前常用的有效策略[7-12]。

可用于細胞固定化的載體多為機械強度高、生物相容性好、來源廣泛、制作簡單的材料物質(zhì)，文獻報道用于苯酚降解菌的固定化載體有聚氨酯泡沫(PUF)[13]、藻酸鈣珠[14]、竹炭[15]等材料。聚氨酯泡沫具有孔隙率高、理化性質(zhì)穩(wěn)定、經(jīng)濟價廉等優(yōu)點[16]，研究發(fā)現(xiàn)其大孔結(jié)構(gòu)有利于物質(zhì)的交換與傳質(zhì)，易于菌株掛膜生長，因此大孔聚氨酯泡沫常被選用為固定化的載體。Ueno等[17]采用網(wǎng)狀PUF材料對菌株P(guān)rototheca zopfii進行固定化，結(jié)果表明菌株在30℃條件下能快速掛膜，并且成膜穩(wěn)定，基本無細胞泄漏。但另一方面，小孔徑的材料比表面積大，吸附位點多，有利于富集營養(yǎng)物，因此也有利于菌株的固著生長[18]。Xiong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物炭材料的孔徑尺寸為細菌大小的1～5倍時，固定化的生物量接近最大值。由此可見，載體的孔徑大小是影響細胞固定化及其降解效果的重要因素，開展載體孔結(jié)構(gòu)大小的研究對進一步理解材料特性與菌株固定化、生物降解的關(guān)系，進而構(gòu)建高效的固定化細胞體系非常必要。

本研究主要以孔結(jié)構(gòu)大小可調(diào)的聚氨酯泡沫材料為研究對象，通過改變泡沫組分的含量，制備獲得不同孔徑大小的泡沫用于苯酚降解菌的固定化，并比較其生物量和苯酚的降解率。在此基礎(chǔ)上，進一步開展PUF-固定化細胞在不同初始pH、NaCl濃度條件下的生物降解過程研究，掌握聚氨酯泡沫固定化細胞體系降解苯酚的基本規(guī)律，為進一步開展實際工業(yè)廢水的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 主要材料與菌株

苯酚、4-氨基安替比林、鐵氰化鉀、25%～28%氨水，AR，上海阿拉丁試劑有限公司；戊二醛、無水乙醇，AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

實驗菌株為產(chǎn)堿桿菌Alcaligenessp.DN25（CGMCC 5734），為本實驗室從受污土壤中篩選、分離所得。

1.2 主要設(shè)備

可見分光光度計，723N，上海光譜儀器有限公司：新型高分辨場發(fā)射掃描電鏡，SU8220，日本日立高新科技有限公司。

1.3 不同孔徑聚氨酯泡沫的制備

本實驗采用一步自由發(fā)泡工藝制備聚氨酯泡沫。首先在塑料燒杯中分別稱取100 g聚醚4110G、10 g 1618A、0.6 g C-8、3 g硅油L-580、10 g 1006-2、6 g KF-28、0.4 g催化劑A-33、20 g CFC-141B等原料，5000 r·min-1轉(zhuǎn)速下充分攪拌1.5 min，靜置，得到混合聚醚（白料），總質(zhì)量為150 g，然后放置于恒溫水浴預(yù)熱至設(shè)定溫度35℃。按照白料與黑料（異氰酸酯）質(zhì)量比為1.5∶1的關(guān)系，稱取黑料MDI-5005于塑料燒杯中，同樣放置于恒溫水浴預(yù)熱至設(shè)定溫度35℃。最后將黑料與白料混合，以5000 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌8 s后迅速倒入模具中進行發(fā)泡，將泡沫體置于80℃烘箱中熟化4 h，制備得到聚氨酯泡沫。

泡沫孔徑的大小通過改變物理發(fā)泡劑CFC-141B的用量，或者添加不同用量的化學(xué)發(fā)泡劑——水來調(diào)控，其他組分不變。

1.4 固定化細胞的制備

1.4.1 泡沫載體的預(yù)處理 將PUF材料切成約5 mm×5 mm×5 mm的小塊，過篩去除碎屑，然后用95%乙醇浸泡30 min，再用超純水浸洗3次，最后在60℃烘箱中烘干，待用。1.4.2 種子液的制備 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g·L-1）：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.5 g，K2HPO42 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母粉5 g，用0.1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)整pH為8.0。移液器量取1 ml保藏的菌液接種至滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶裝液20 ml，然后置于30℃、120 r·min-1的搖床中培養(yǎng)18 h，作為種子液。

1.4.3 菌株的固定化 稱量預(yù)處理后的聚氨酯泡沫10塊（0.08 g）為一份加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后以10%的接種量接種，30℃、120 r·min-1的搖床中培養(yǎng)48 h。取出搖瓶，用鑷子夾出固定化細胞，用20 ml的PBS溶液（pH=8、200 mmol·L-1）清洗固定化細胞3次，制備得到1份固定化細胞，待用于掃描電鏡觀測以及苯酚降解實驗。游離細胞（即無載體）體系的培養(yǎng)條件同固定化細胞體系，將培養(yǎng)48 h的游離細胞倒入離心管，9500 r·min-1、4℃離心15 min，再用PBS溶液清洗3次后重懸，配制得到菌懸液（OD600≈1.25），待用。

1.5 苯酚去除實驗

為比較固定化細胞體系與游離細胞體系的苯酚去除效果，兩個體系的苯酚降解條件一致：生物量均為0.015 g（以細胞干重記），量取一定體積、經(jīng)過0.22μm膜過濾的苯酚儲備液加入到PBS溶液中以達到設(shè)定的苯酚濃度，然后將樣品瓶置于30℃、120 r·min-1的搖床中進行降解反應(yīng)，定期收集樣品，并測量殘留的苯酚濃度。所有樣品瓶用蓋子密封以防止苯酚氧化。

考察pH、NaCl濃度對菌株降解苯酚的影響時，設(shè)置實驗的pH為6.0、7.0、8.0、9.0，NaCl濃度的值為0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%。

上述苯酚去除實驗每個樣品皆做3個平行，同時分別做無降解菌、無菌且僅有載體的空白對照。

1.6 固定化細胞的重用性研究

固定化細胞重復(fù)使用降解苯酚的實驗體系同1.5節(jié)，每批次降解反應(yīng)結(jié)束，取樣測定剩余苯酚含量。取出固定化細胞并用無菌水洗滌3次，然后轉(zhuǎn)移到新鮮配制的降解體系中，用于下一批次降解實驗。

1.7 分析方法

參照Oh等[20]的孔徑測定方法，對聚氨酯泡沫材料的掃描電鏡進行孔徑大小的統(tǒng)計學(xué)計算，結(jié)果用平均值表示。

固定化細胞的掃描電鏡分析：將清洗后的固定化細胞用2.5%戊二醛溶液浸泡，放置于4℃冰箱12 h后取出，用超純水清洗3次，然后按照10%-30%-50%-70%-80%-90%-100%的乙醇梯度逐級脫水，每次15 min，脫水2次后自然晾干。分別切割載體樣品的表面、中間部分為薄片，噴金，上機測試。

苯酚的濃度根據(jù)國標(biāo)方法4-氨基安替比林法進行分光光度測定，所有測試均重復(fù)三次。生物量測定采用細胞干重法，將樣品置于60℃的烘箱中干燥至恒重。固定化細胞樣品根據(jù)載體PUF材料固定前和固定后的質(zhì)量差計算得到固定的生物量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化細胞的掃描電鏡圖

圖1分別為制備所得聚氨酯泡沫材料以及聚氨酯泡沫固定化細胞的掃描電鏡圖。圖1（a）所示，聚氨酯泡沫為多孔隙結(jié)構(gòu)，結(jié)實的骨架使得聚氨酯泡沫具有良好的機械強度和穩(wěn)定性，為微生物的附著生長提供了有利條件。圖1（b）反映了菌株在載體上的生長情況，圖中可見，在泡沫的孔壁上分布有大片密集的、呈桿狀的降解菌細胞，表明制備的聚氨酯泡沫材料對微生物具有良好的固定化效果。

2.2 固定化細胞對不同濃度苯酚的去除

苯酚是一種殺菌劑，目前文獻報道的菌株最大耐受水平為24 mmol·L-1（2250 mg·L-1）[21]，大多數(shù)菌株的降解濃度大致為1000 mg·L-1[22-24]，圖2比較了游離細胞與固定化細胞對不同濃度苯酚的降解結(jié)果。圖中所示，隨著苯酚濃度增大，抑菌作用明顯增強，游離細胞降解200、500、900 mg·L-1苯酚所用的時間分別為22、46、96 h。當(dāng)苯酚濃度增大至1160 mg·L-1時，游離細胞完全受到抑制，經(jīng)過96 h苯酚濃度基本沒有改變。Su等[25]報道的菌株Rhodotorulasp.的最大耐受苯酚濃度為1500 mg·L-1。與游離細胞體系相對比，PUF-固定化細胞降解200、500、900、1160 mg·L-1苯酚所用時間分別為15、32、48、66 h，固定化細胞體系顯著縮短了降解時間。Jiang等[26]采用藻酸鈣珠固定化菌株Debaryomycessp.可在56 h內(nèi)完全降解500 mg·L-1苯酚，而游離細胞僅降解了38.9%。因此，固定化體系的局部高細胞密度，以及載體對微生物的保護作用是固定化細胞比游離細胞降解快速的主要原因。而值得關(guān)注的是，本研究中PUF-固定化細胞在降解初期的速率明顯加快，測定發(fā)現(xiàn)聚氨酯泡沫能吸附苯酚，使其濃度從1160 mg·L-1降低至673.5 mg·L-1（圖2），因此初步分析認為，載體PUF對苯酚的吸附在一定程度上降低了液相濃度對細胞的抑制作用，從而有利于生物降解過程的啟動，縮短苯酚的降解時間，同時相對提高了固定化細胞體系對苯酚的處理濃度。Wang等[27]研究者也有類似的結(jié)論，通過采用樹脂材料作為“酚收集劑”吸附苯酚，使得液相主體苯酚濃度快速從6000 mg·L-1降低至1000 mg·L-1，生物降解過程得以順利進行。Stenholm等[28]構(gòu)建PUF-固定化菌株Trametes versicolor反應(yīng)器去除壬基酚（NPEO）能連續(xù)運行18 d，去除率保持在90%以上。研究結(jié)果表明，PUF對NPEO的良好吸附作用（最大動態(tài)吸附容量達到106 mg·g-1）有效促進了壬基酚的生物降解。

圖1 載體材料固定化前、后的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of the carrier material before and after immobilization

圖2 游離細胞與PUF-固定化細胞對不同濃度苯酚的降解Fig.2 Degradation of phenol at different concentrations by the freely suspended cells and PUF-immobilized cells

2.3 泡沫孔徑大小的影響

圖3 聚氨酯泡沫材料的孔徑分布Fig.3 Pore size distribution of the polyurethane foammaterials

圖4 不同孔徑泡沫固定化細胞量的結(jié)果Fig.4 The biomass immobilized on the foam at different pore sizes

圖5 不同孔徑PUF-固定化細胞去除苯酚的時間進程Fig.5 Time curve of phenol removal by the PUF-immobilized cells at different pore sizes

材料孔徑的大小將影響固定化的生物量以及苯酚的去除結(jié)果，圖3、圖4分別為聚氨酯泡沫材料孔徑尺寸的統(tǒng)計學(xué)計算以及固定化細胞量的結(jié)果。當(dāng)每百份多元醇物理發(fā)泡劑用量為15 g時，制備得到的泡沫PUF-1肉眼可見孔徑較小，平均孔徑約為150μm[圖3(a)]，采用PUF-1泡沫制備固定化細胞的生物量為(0.0253±0.0010)g（圖4）。增加物理發(fā)泡劑用量為20 g時，泡沫PUF-2的平均孔徑增大為約300μm[圖3（b）]，固定所得的生物量為(0.0182±0.0020)g。當(dāng)以2 g的水作為化學(xué)發(fā)泡劑時，泡沫PUF-3的平均孔徑約為400μm[圖3（c）]，對應(yīng)的固定化細胞生物量為（0.0156±0.0016）g。大孔的材料有利于物質(zhì)交換，菌株生長不會堵孔，小孔的材料能為細胞的附著生長提供更多的比表面，但可能會產(chǎn)生堵孔問題，因此，孔徑的大小存在一個合適值，本實驗載體材料孔徑為150μm時固定化的結(jié)果較好。不同孔徑載體PUF-1、PUF-2、PUF-3的固定化細胞降解苯酚的結(jié)果如圖5所示，孔徑為150、300、400μm泡沫固定化細胞完全去除1160 mg·L-1苯酚的時間分別為48、66和69 h。實驗發(fā)現(xiàn)，在降解開始前的6 h，苯酚的去除以泡沫吸附為主，不同孔徑泡沫的苯酚吸附率分別為51.2%、41.1%和37.5%，這符合孔徑越小、比表面積越大，越有利于吸附的常規(guī)規(guī)律。經(jīng)過12 h后吸附達到平衡，最終吸附率分別為56.1%、44.2%和42.1%，由此可見，PUF材料對苯酚的吸附在降低苯酚的濃度抑制、快速啟動降解發(fā)揮了重要作用，使得固定化細胞體系比游離細胞體系具有更快的降解速率和更高的苯酚處理能力。Ma等[29]制備的活性炭纖維固定化菌株P(guān)seudomonas putida甚至可以處理濃度高達10000 mg·L-1的苯酚，載體活性炭纖維可以在短時間內(nèi)通過吸附使苯酚的濃度降低至2000 mg·L-1以下，此時生物降解過程得以啟動，而隨著苯酚的降解，載體上吸附的苯酚被不斷解吸并且降解，最終10000 mg·L-1的高濃度苯酚在吸附-降解-解吸-降解的協(xié)同作用下被固定化細胞120 h內(nèi)降解完全。本研究對無菌且僅有載體的對照樣品進行解吸實驗，結(jié)果能檢測到解吸出來的苯酚，而對PUF-固定化細胞進行多次解吸卻檢測不到苯酚。因此認為，本實驗也存在吸附-降解-解吸-降解的類似過程，吸附在載體PUF上的苯酚最終也被菌株降解完全。

2.4 初始p H的影響

pH是影響生物降解效率的重要環(huán)境因素之一，同時也會影響物質(zhì)的存在形態(tài)，并且還會與污染物質(zhì)競爭吸附位點。不同初始pH條件對PUF-固定化細胞降解苯酚的影響如圖6所示，初始pH為6.0、7.0、8.0、9.0時，PUF-固定化細胞完全降解900 mg·L-1苯酚所需時間分別為52、46、46、52 h，其中降解至40 h時，對應(yīng)的苯酚去除率分別為66.7%、86.5%、75.5%、65.6%。Gomes等[30]采用甘蔗渣固定Candida tropicalis的研究表明，當(dāng)pH為7.0時會降低苯酚的毒性水平，從而加快苯酚的降解。Wang等[27]采用大孔樹脂固定菌株Alcaligenesfaecalis去除苯酚發(fā)現(xiàn)，pH為6.0時，苯酚的去除率僅為44.9%；當(dāng)pH為7.0時，苯酚去除率達到最大值為99.34%，該菌株適宜在中性或弱堿性條件下降解苯酚。本研究固定化體系的最佳初始pH也為7.0，并且在不同pH條件下的苯酚降解率結(jié)果差距不顯著，說明PUF-固定化細胞具有較寬廣的pH適用范圍，有利于實際工業(yè)廢水的處理。此外，pH的變化對載體吸附行為的影響也不顯著，圖中所示的吸附曲線具有相似的趨勢，苯酚的吸附主要發(fā)生在前12 h，達到平衡的吸附率約為55.1%，體系中的高濃度苯酚仍然是載體吸附的主要對象，由此也反映菌株在載體上的“微環(huán)境”很可能與液相主體不同，因此受到pH的影響較小。

2.5 NaCl鹽濃度的影響

苯酚工業(yè)廢水通常還包含有無機鹽和多種有機化合物，鹽濃度對微生物的活性影響不容忽視。高鹽條件（主要以NaCl計，NaCl濃度＞3%）會導(dǎo)致微生物失活、死亡，因此，常規(guī)的微生物一般只能處理含鹽量不超過3%的廢水[31-32]。不同NaCl濃度下的苯酚去除結(jié)果如圖7所示，苯酚的去除率隨著NaCl濃度的增加而降低，NaCl濃度為0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%時，PUF-固定化細胞對900 mg·L-1苯酚48 h內(nèi)的去除率分別為100%、77.8%、74.3%、70.1%、65.7%，完全去除的時間分別為48、72、72、78、84 h。與不同pH條件下的吸附結(jié)果相類似，苯酚在降解初期被快速吸附，12 h時達到吸附平衡，吸附率約為53.8%，在實驗考察的NaCl濃度范圍內(nèi)也未觀察到競爭吸附的現(xiàn)象，載體對苯酚的吸附率變化不大。上述結(jié)果表明，PUF-固定化細胞在NaCl濃度達到4.0%的條件下仍然具有較好的苯酚降解效果，展示了固定化細胞在耐受環(huán)境條件變化方面的突出優(yōu)勢。Jiang等[26]采用Fe3O4-藻酸鈣珠固定菌株Debaryomycessp.在1%的NaCl濃度下，40 h內(nèi)可完全降解500 mg·L-1苯酚。當(dāng)NaCl濃度增大至9%時，固定化細胞72 h的降解率超過99.9%，而此時游離細胞的降解率僅為30.6%，因此，細胞固定化技術(shù)有效提高了含鹽工業(yè)廢水的生物處理效能。

圖6 初始pH對PUF-固定化細胞去除苯酚的影響Fig.6 Effect of initial pH on phenol removal by the PUF-immobilized cells

圖7 NaCl濃度對PUF-固定化細胞去除苯酚的影響Fig.7 Effect of salt concentrations on phenol removal by the PUF-immobilized cells

2.6 重復(fù)批次降解

固定化細胞的重用性可以反映生物處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性情況。圖8結(jié)果所示，PUF-固定化細胞重復(fù)使用11個批次（合計264 h），苯酚的去除率依然能達到100%，在第12個循環(huán)時，苯酚去除率降低為84.0%，比第11個批次時減少了16%，開始呈緩慢下降的趨勢。司偉磊等[33]采用聚氨酯泡沫固定蒽醌脫色偶氮染料莧菜紅，結(jié)果表明固定化蒽醌循環(huán)使用10次后，莧菜紅的脫色率仍高達90%。由此可見，PUF材料具有良好的機械強度和穩(wěn)定性，以此為載體的固定化細胞可以重復(fù)使用多次，說明該載體能有效固定菌株，使其不易脫落，為生物處理系統(tǒng)的長效、穩(wěn)定運行提供了有利條件，這也是固定化體系在實際污染廢水中的應(yīng)用價值。

圖8 PUF-固定化細胞的重復(fù)使用Fig.8 Reuse of the PUF-immobilized cells for phenol removal

3結(jié) 論

(1)本研究合成的聚氨酯泡沫機械強度好、孔結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能有效固定苯酚降解菌株，為構(gòu)建固定化細胞體系提供了良好的載體材料。

(2)當(dāng)PUF載體材料的孔徑尺寸均值為150μm時，固定化細胞的生物量干重最大值為(0.0253±0.0010)g，PUF-固定化細胞能在48 h內(nèi)完全降解1160 mg·L-1的苯酚，而游離細胞在此濃度下則完全受到抑制。PUF材料對1160 mg·L-1苯酚的平衡吸附率為56.1%，載體對苯酚的吸附被認為有效降低了液相主體苯酚對菌株的抑制作用。

(3)在初始pH為6.0～9.0、NaCl濃度為0～4.0%的范圍內(nèi)，PUF-固定化細胞能保持較好的降解活性，pH為9.0、NaCl濃度為4.0%的固定化細胞體系分別在52 h、84 h內(nèi)完全降解900 mg·L-1苯酚，反映了PUF-固定化細胞具有較寬廣的適用范圍。

(4)PUF-固定化細胞在重復(fù)使用11個批次的循環(huán)后，苯酚的去除率仍能保持100%，第12個循環(huán)批次的去除率開始緩慢下降，表明該PUF-固定化細胞體系具有良好的穩(wěn)定性，為進一步發(fā)展實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。